Summary
Mejorar nuestra comprensión y nuestra capacidad para gestionar muchos de los virus de las plantas transmitidas por insectos requiere el uso del vector. La transmisión por insectos de los virus de plantas es una interacción tritrófica, y como tal, requiere la manipulación de los insectos, virus, y de plantas. Vectores deberán ser criados en grandes números y manipulados de tal manera como para asegurar altas tasas de transmisión a las plantas de prueba. Los fundamentos de la cría y la manipulación de la mosca blanca,
Abstract
Las moscas blancas, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complejo de especies morfológicamente indistinquishable 5, son vectores de muchos virus de plantas. Varios géneros de estos virus vegetales transmitidos por moscas blancas (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, torrado) incluyen varios cientos de especies de patógenos emergentes y económicamente importantes de alimento importante y los cultivos de fibra (revisado por 9,10,16). Estos virus no se multiplican en su vector, pero sin embargo se mueven fácilmente a partir de una planta a otra por la mosca blanca adulta por diversos medios (revisado por 2,6,7,9,10,11,17). Para la mayoría de estos virus alimentación mosca blanca se requiere para la adquisición e inoculación, mientras que para otros se requiere sólo de sondeo. Muchos de estos virus no pueden o no pueden ser fácilmente transmitidos por otros medios. Por lo tanto, el mantenimiento de cultivos de virus, biológicos y caracterización molecular (identificación de rango de hospedantes y síntomas) 3,13, Ecología 2,12, requiere que los virus se transmiten a los hosts experimentales utilizando el vector de mosca blanca. Además del desarrollo de nuevos métodos de gestión, tales como la evaluación de nuevas sustancias químicas o compuestos 14 15, nuevos enfoques culturales 1,4,19, o la selección y el desarrollo de cultivares resistentes 7,8,18, requiere el uso de la mosca blanca de la transmisión del virus. El uso de la transmisión de la mosca blanca de los virus de las plantas de selección y desarrollo de cultivares resistentes en los programas de mejoramiento es particularmente desafiante 7. Selección eficaz y la detección de la resistencia emplea un gran número de plantas y hay una necesidad para el 100% de las plantas para ser inoculados con el fin de encontrar los pocos genotipos que poseen genes de resistencia. Estos estudios utilizan un gran número de moscas blancas virulíferos, a menudo varias veces por año.
Mantenimiento Mosca Blanca descrito aquí puede generar cientos o milesde moscas blancas adultas de las plantas a la semana, durante todo el año, sin la contaminación de otros virus de plantas. Las plantas libres de las dos moscas blancas y virus deben ser producidos a introducir en la colonia de mosca blanca cada semana. Mosca Blanca culturas deben mantenerse libres de patógenos, parásitos, moscas blancas y parasitoides que pueden reducir las poblaciones de mosca blanca y / o reducir la eficiencia de la transmisión del virus. Las colonias producidas en la forma descrita se puede escalar rápidamente para aumentar o disminuir las cifras de población, según sea necesario, y se pueden ajustar para adaptarse a las preferencias de alimentación de la base de mosca blanca en la planta huésped del virus.
Hay dos tipos básicos de colonias de mosca blanca que se pueden mantener: un nonviruliferous y una colonia virulífero mosca blanca. La colonia nonviruliferous se compone de moscas blancas criadas en las plantas libres de virus y permite la disponibilidad semanal de moscas blancas que pueden ser utilizados para transmitir los virus a partir de diferentes cultivos. La colonia viruliferous mosca blanca,compuesto de moscas blancas criadas en plantas infectadas por virus, permite disponibilidad semanal de moscas blancas que han adquirido el virus omitiendo por lo tanto un paso en el proceso de transmisión del virus.
Protocol
1. Mantenimiento Colony Mosca Blanca
- Condiciones ambientales: colonias de mosca blanca se deben mantener en una cámara de crecimiento controlada. El control de la humedad relativa, la temperatura, fotoperiodo y la intensidad de luz son esenciales para el crecimiento de las colonias óptima (Figura 1). Una temperatura de 28 ° C, 30-50% de humedad relativa, y un fotoperiodo de 14 horas dará lugar a una colonia que se desarrolla desde el huevo hasta la emergencia del adulto en 18 días (este tiempo varía con la planta huésped). La humedad relativa debe mantenerse por debajo de 70% para desalentar el crecimiento de insectos y hongos patógenos de plantas. Las tasas de fertilización y riego debe reducirse para desalentar los hongos patógenos y la acumulación de sal. La intensidad de la luz de la colonia debe ser bastante alta. Bombillas fluorescentes VHO utilizados en número suficiente para generar aproximadamente 800-1.000 velas ft a la altura del dosel son adecuados para la mayoría de las plantas (es decir. Algodón, haba común, frijol lima, tomate). La limpieza es esencial enuna colonia de mosca blanca para mantener las condiciones óptimas de crianza.
- Jaulas Colony: Las moscas blancas se deben mantener las plantas en cajas, en vez de gratis en la habitación crecimiento. Las jaulas se pueden construir de diversos materiales, pero deben permitir: la ventilación, la facilidad de acceso, la capacidad de impedir la fuga o infiltración de mosca blanca, y de un tamaño suficiente para mantener suficientes plantas para generar la población de mosca blanca es necesario. Buenos resultados se han obtenido con organza más proyección de aluminio (por la fuerza), así como la detección de mosca blanca a prueba (véase la tabla de equipos e insumos específicos).
- Colony Preparación de la planta: Las especies de plantas seleccionadas es una consideración importante cuando se inicia una colonia de mosca blanca. La planta debe ser capaz de soportar una alta población de insectos sin colapsar. La planta elegida para una colonia nonviruliferous debe ser un no huésped para el virus o virus que están destinados a ser transmitida para evitar la contaminación en la colonia y si el mantenimiento de un virulicolonia ferous, debe ser portador del virus. Las plantas deben crecer con bastante rapidez para apoyar aparición de nuevos adultos dentro de los 18 días de haber sido introducido a la colonia, pero no tan rápidamente como para superar las jaulas dentro de cuatro semanas. Enano, arbusto, o variedades de plantas de tipo patio se recomiendan ya que a menudo producen un área foliar similar a los cultivares más altos, pero sin el alargamiento del tallo.
- Es muy importante para las plantas traseras para la colonia en invernaderos en jaulas que excluyen la mosca blanca y otros insectos. El uso de las plantas que están infestadas con la mosca blanca, trips, ácaros o antes de entrar en la colonia puede causar la colonia se colapse. Las plantas infestadas también tienen el potencial de ser infectado con virus transmitidas por insectos que puedan interferir con los estudios de transmisión de virus.
2. Establecimiento Colonia Mosca Blanca
- Empezar una colonia por primera vez el uso de moscas blancas limpias - los libres del virus de plantas, otros insectos y patógenos de insectos. Estos pueden ser obtenidosde los colaboradores o de campo. Si el campo recolectada, moscas blancas deben ser criados durante al menos 8 semanas en las plantas hospedantes del virus de la planta, y comprobar la ausencia de síntomas de la planta para asegurarse de que están libres de virus de plantas.
- Semana 1: Introducir la mosca blanca limpia a la primera jaula de plantas. Las moscas blancas pueden ser introducidos por aspiración de números conocidos o agitando suavemente las moscas blancas de otra planta de origen en función de las demandas de la colonia. En la semana 1, moscas blancas están poniendo huevos en el envés de la superficie foliar de la planta. Un tamaño de la población aproximada se puede predecir para cada aparición basado en el número de adultos utilizados para poner los huevos y el número promedio de huevos puestos por hembra en la mosca blanca de la planta huésped en cuestión.
- Semana 2: Comenzar otra jaula con la introducción de la mosca blanca a las nuevas plantas hospederas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán los huevos, y algunas moscas blancas inmaduras que cubren el envés de las hojas (Figura 2). Algunosmoscas blancas adultas introducidas durante 1 semana seguirán con vida.
- Semana 3: Comenzar una tercera jaula mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 se tienen muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes inmaduros, así como y debe haber un aumento muy notable de la mosca blanca adulta de la población. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas.
- Semana 4: Comienza la cuarta caja mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán muchas moscas blancas adultas que son aproximadamente una semana después de la emergencia. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes y debe haber un aumento muy notable de la población de mosca blanca. Las plantas en la jaula iniciadas durante la semana 3 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas.
- Semanal después de la primera 4 weeks: Cada semana, comienza una nueva jaula mediante la introducción de las moscas blancas adultas desde la cuarta caja más antigua (la jaula comenzó en la semana 1) en nuevas plantas en una nueva jaula limpia. La jaula de edad debe ser retirado y desechado sus plantas. Estas moscas blancas son de aproximadamente 1 semana de post-emergencia. En el caso de la colonia virulífero, estas moscas blancas se transmitir el virus a las nuevas plantas, así como ponen huevos para la próxima generación de moscas blancas.
- Experimentos de transmisión va a utilizar la mosca blanca que surgirán en la jaula de la tercera semana. Si se necesitan más moscas blancas, el número de plantas se pueden aumentar las moscas blancas y más pueden ser añadidos a la semana 1 jaula para aumentar la población de mosca blanca.
3. Método para la inoculación de plantas de ensayo
- Para asegurar altas tasas de transmisión: 1) Las moscas blancas se deben manejar el mayor cuidado posible para evitar daños a los insectos que reducirá las tasas de transmisión, 2) Debe haber suficiente área foliar disponible para la mosca blanca de IETsu sonda o alimentación. Un aumento en el tiempo de adquisición o un aumento en el número de plantas hospedantes de adquisición puede aumentar las bajas tasas de infectividad en plantas de ensayo por la aglomeración, ya sea en la adquisición o el periodo de acceso de la inoculación.
- Colección de moscas blancas. El siguiente es un procedimiento para la recogida y el movimiento de los números precisos de moscas blancas requeridos para fines experimentales. Para mover un gran número de moscas blancas, como se necesita para la detección de la resistencia, por ejemplo, sólo es necesario agitar suavemente las plantas infestadas de mosca blanca en las plantas de prueba o de adquisición de los anfitriones infectados por el virus (y más tarde las plantas de ensayo). Asegúrese de agitar las plantas durante muchos lugares para minimizar los efectos de agregación.
- Recientemente surgieron moscas blancas adultas (1-3 días después del brote) son muy activos y se alimentan a menudo así tienden a dar a las velocidades de transmisión más altas 4. Moscas blancas mayores, pero todavía transmiten a una frecuencia más baja. Varias moscas blancas por planta de ensayo (15-40 por plant) se debe utilizar para altas tasas de transmisión desde una proporción de 1 mosca blanca por planta a menudo resulta en inaceptablemente bajas tasas de transmisión 3,4. El número necesario dependerá del virus de la especie y de la adquisición y plantas de ensayo.
- Montar los dispositivos de aspiración y viales de colección. (Figura 3)
- Con una mano, sostenga una tarjeta de plástico de color amarillo dentro de la jaula de la colonia que contiene las moscas blancas que se recojan. Golpear suavemente las plantas para estimular las moscas blancas adultas para volar. Las moscas blancas se sentirán atraídos por la tarjeta amarilla que volarán desde la planta hasta la tarjeta donde se pueden recoger con un aspirador y una respiración muy suave. Nunca aspirar moscas blancas que se alimentan en las plantas. Sus estiletes están incrustados en la planta mientras que la alimentación para tirar de ellos fuera de las plantas se romperán sus estiletes y haciéndolos incapaces ya sea adquirir o transmitir virus (Figura 4).
- Recoge unas 20 moscas blancas adultas en un solo collección vial para minimizar el daño físico a los insectos de las aspiraciones repetidas (Figura 5).
- Para cambiar el tubo de recolección, toque suavemente el vial sobre una superficie dura y tapa con Parafilm mientras que las moscas blancas están desorientados desde el tapping.
- Ponga un nuevo vial cobrar el aspirador y repetir hasta que se recogen el número de moscas blancas necesarios. Las moscas blancas pueden permanecer en los viales de recolección a temperatura ambiente durante varias horas.
- Adquisición. Moscas blancas se colocan en una planta infectada del virus y se les permite alimentarse de las plantas infectadas durante 48-72 h. Períodos de adquisición de más de 72 horas generalmente no aumentan las tasas de transmisión. Para los virus transmitidos de manera no persistente o semipersistente, 1 hora y varias horas, respectivamente, son suficientes periodos de acceso de adquisición (Tabla 1). Los mejores resultados se obtienen cuando las moscas blancas se les da acceso libre a las plantas en jaulas que encierran a los insectos a una sola planta o avarias plantas. Sin embargo, algunos experimentos requieren la adquisición de las hojas específicas en las que se pueden utilizar de casos jaulas de clip. Al utilizar jaulas de clip es importante dar cabida a la preferencia alimentaria mosca blanca de la parte inferior de las hojas. Además, el hacinamiento de la mosca blanca en jaulas de clip puede reducir las tasas de transmisión - tasas aceptables de transmisión se han cumplido con 10 moscas blancas femeninas por clip jaula de 2,5 cm de diámetro.
- La inoculación. Preparar una jaula apropiada para el tamaño de la inoculación y colocar las plantas de ensayo en el interior. Si sólo una planta es para ser inoculados considerar una sola jaula planta. Si más de una planta se inoculó en cuenta un pequeño marco / organza bolsa de jaula de PVC o una jaula de aluminio (Figura 6). El tamaño de la jaula se utiliza para la inoculación debe ser ligeramente más grande es el tamaño de la planta (s) a ser inoculados. Velocidades de transmisión más altas se obtienen cuando la mosca blanca se mantienen cerca de la copa de la planta y no dan mucho espacio libre.
- Colección de moscas blancas de anfitriones de adquisición depende de las necesidades del experimento. Si se necesitan pequeñas cantidades, aspirar moscas blancas como se describió anteriormente. Colocar los viales de recolección de moscas blancas dentro de la jaula cerca de las plantas y quitar la tapa (Figura 7). Abra el frasco y liberar las moscas blancas o invertir y golpear suavemente el vial para liberar las moscas blancas. Si se necesitan grandes cantidades basta con mover las plantas de adquisición con la mosca blanca en las jaulas donde están ubicadas las plantas de ensayo y agite suavemente las moscas blancas de la planta huésped adquisición. Para ambos tipos de presentación, asegúrese de distribuir las moscas blancas a través de las plantas para minimizar la agregación y asegurar una inoculación uniforme.
- Permita que las moscas blancas para sondear o piensos con la cantidad adecuada de tiempo, una vez más dependiente del virus y, en cierta medida, la planta huésped (Tabla 1).
- Compruebe las moscas blancas, al menos una vez durante el período de acceso inoculación para asegurar que las moscas blancas sonsondeo o alimentar al abrir la jaula y girando sobre unas hojas de cada planta.
- Para los períodos de acceso inoculación largos, molestar a las plantas con cuidado (con una vara de bambú o equivalente) para repasar las puntas de las plantas y fomentar las moscas blancas para redistribuir en las plantas. La redistribución de la mosca blanca ayuda a asegurar una velocidad de transmisión superior al contrarrestar la tendencia natural de la mosca blanca a agregarse.
- Terminación. El periodo de acceso inoculación se terminó matando las moscas blancas con productos químicos autorizados. Aplicar dos insecticidas, una tras otra: un insecticida de contacto para poner fin rápidamente moscas blancas adultas y un insecticida sistémico para cerrar todas las moscas blancas que se desarrollan en las siguientes semanas y las perdidas por el insecticida de contacto (Figura 8). Un insecticida de contacto, tales como el jabón insecticida e insecticidas sistémicos, tales como imidacloprid o pimetrozina se han utilizado con buenos resultados.
Representative Results
Estos métodos para el establecimiento de colonias de mosca blanca y el mantenimiento, así como la manipulación de transmitir los virus de plantas se han utilizado con éxito en una serie de estudios 4,11,12,14, así como otros muchos no citados. El uso de estos métodos con los virus transmitidos persistentemente, hemos obtenido rutinariamente las tasas deseadas de transmisión de 100% para la selección para la resistencia, el cribado insecticidas por su capacidad para interferir con la transmisión (y evaluación de compuestos que inducen resistencia) 13,14,17,18 ( la Figura 9). Los procedimientos descritos aquí pueden ser y han sido adaptados a muchos lugares en los centros públicos y privados de investigación.
| Tipo de Cambio | Período de acceso Adquisición (horas) | Período de acceso inoculación (horas) | Ref.. |
| No persistente | 1 2-24 | 10 | |
| Semipersistentes | 6-24 | 8-24 | 10, 16 |
| Persistente | 48-72 | 48-72 | 3, 6, 8, 9 |
Tabla 1. Tiempos estimados que se pueden utilizar para producir altas tasas de transmisión de virus con diferentes tipos de relaciones con sus vector especies Bemisia tabaci complejos. Duración estimada se basa en tiempos mínimos públicos que se exigen para la transmisión de 80-100% y modificado en algunos casos para tener en cuenta los períodos de latencia y las diferencias entre poblaciones de mosca blanca, virus, y las plantas anfitrionas.
Figura 1. Un ejemplo de una colonia virulífero mosca blanca. Esta cámara de crecimiento contiene jaulas de plantas infectadas con un begomovirus y INFEsted con moscas blancas virulíferos.
Figura 2. Izquierda: inmaduros etapas de la mosca blanca, Bemisia tabaci MEAM clado sensu De Barro 6 aproximadamente 1 semana después de la aparición y la derecha: un adulto de mosca blanca, un vector eficaz de muchos virus de plantas.
Figura 3. Tipos de dispositivos de recogida que pueden ser utilizados para recoger las moscas blancas para la transmisión de virus de plantas.
La Figura 4. Izquierda: Tarjeta de plástico amarillo utilizado para recoger los adultos de mosca blanca que muestran moscas blancas listas para la recolección . Derecha: Recogida de la mosca blanca de una tarjeta de plástico amarillo. Las moscas blancas se pueden ver en la tarjeta como pequeñas manchas blancas / gris.
Figura 5. Las moscas blancas recogieron por aspiración (20 en un vial) de la colonia listo, ya sea para la adquisición o la inoculación.
La Figura 6. Superior izquierda:. Jaulas de plantas individuales utilizados, ya sea para la adquisición o inoculación superior derecha: jaulas más grandes hechas de tubos de pvc y organza. Inferior: Aluminio / pantalla y jaulas organdí en algunas plantas que contienen gases destinados a una colonia de mosca blanca.
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Figura 7. Las moscas blancas siendo transferidos a una sola planta para la inoculación (o adquisición).
Figura 8. La adición de un insecticida sistémico drench al terminar el período de acceso inoculación mosca blanca.
La Figura 9. Coloque las plantas en evaluación para la resistencia al virus del rizado amarillo del tomate. Todas las plantas fueron inoculadas en un 5 semanas de edad, las plantas de semillero y luego trasplantadas al campo para su evaluación. Las plantas en el primer plano son una línea de germoplasma resistente, las plantas en el fondo son la línea de germoplasma susceptible.
Discussion
Los métodos descritos aquí se han desarrollado durante un período de dos décadas y se basan en la información básica proporcionada por muchos estudios de transmisión de la mosca blanca, el comportamiento y la biología. Puesto que hay muchas publicaciones, este manuscrito se refiere principalmente a las revisiones y para algunas publicaciones específicas seleccionadas para ilustrar el tipo de datos que se utilizan para desarrollar esta técnica. Es muy importante en este procedimiento que las moscas blancas se manejan con cuidado ya que la rotura de las piernas y antenas puede conducir a comportamientos anormales y menores tasas de transmisión. Colección con aspiradoras y otros dispositivos mecánicos de aspiración nunca ha dado buenos resultados. Otra consideración para el éxito es que el número de moscas blancas utilizados para obtener 100% de transmisión a las plantas de prueba, se debe determinar para cada combinación de huésped de la planta y el virus. Esta relación óptima sólo necesita ser establecida una vez. Los mejores resultados se han obtenido utilizando las moscas blancas adultas jóvenes (1-3 días surgimiento pasado) ya que g másive las mayores tasas de transmisión. Los adultos mayores pueden ser utilizados, pero se necesitará un mayor número de moscas blancas para compensar las tasas reducidas de transmisión. Las hembras son conocidos por transmitir a velocidades más altas que los hombres, ya que se alimentan con más frecuencia que los hombres. Sin embargo, por lo general no vale la pena el tiempo para separar los sexos para la transmisión. Este procedimiento se puede modificar de muchas maneras para adaptarse a los recursos y las necesidades del investigador.
Cuando se trabaja con múltiples virus que lo mejor es mantener una colonia de moscas blancas criadas en plantas hospedantes del virus. Estas moscas blancas se pueden recoger coloca en plantas infectadas por virus para la adquisición y a continuación, después de la adquisición de las moscas blancas se pueden mover de nuevo a las plantas de ensayo. Vegetales destinados a la colonia deben ser cultivadas en invernaderos en jaulas para impedir la introducción de las moscas blancas que podrían infectar con otro virus. La infestación de estas plantas con ácaros, trips y otras plagas de las plantas puede comprometer la halud de la colonia y causar su colapso. Finalmente el riego de las plantas de colonias que hay que hacer con cuidado. Estas plantas están sometidas a un estrés extremo por la alimentación de tantas moscas blancas y las condiciones de luz normales inferiores. Root descomposición hongos que se introducen en la turba en las mezclas sin suelo puede convertirse en un problema si las plantas se overwatered ni una sola vez. El tratamiento previo de las plantas con un fungicida empapar puede eliminar algunos de los problemas.
Si bien la transmisión de los virus de la mosca blanca de la planta puede llevar mucho tiempo y requerir recursos valiosos (como salas de crecimiento) es esencial para la transmisión de algunos virus para los que no tenemos otro medio de transmisión. También es un medio valioso para la selección de plantas para la resistencia a los virus, ya que utiliza el mismo tipo de transmisión que se espera que las plantas en el campo de resistir. El uso de los medios más artificiales de transmisión no siempre producen los mejores resultados en las evaluaciones de germoplasma de virus-resistencia.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Item | Company | Catalogue No. | Comments (optional) |
| Whitefly proof screening | Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel | --- | BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen |
| Whitefly proof screening | Hummert International (www.hummert.com) | 27-4050-1 - 27-4062-1 | BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen |
| Whitefly Collection Devices | BioQuip | 1135A | Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth |
| Collection vials | BioQuip | 8909 | Vials used depend on which aspirator is used. |
| Yellow plastic cards | any company | --- | Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places. |
| Whitefly Cages | --- | --- | These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening. |
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