Summary
Drosophila larver kan associera lukt stimuli smak belöning. Här beskriver vi en enkel beteendevetenskaplig paradigm som gör att analysen av appetitive associativt lukt lärande.
Abstract
I det följande beskriver vi de metodologiska detaljer appetitive associativt lukt lärande i Drosophila larver. Upplägget i kombination med genetiska störningar, ger ett handtag för att analysera de neuronala och molekylära grunderna för specifikt associativ inlärning i en enkel larver hjärna.
Organismer kan använda tidigare erfarenheter att justera nuvarande beteende. Sådant förvärv av beteende potential kan definieras som lärande och de fysiska grunderna för dessa potentialer som minne spår 1-4. Neuroforskare försöka förstå hur dessa processer är organiserade i termer av molekylära och neuronala förändringar i hjärnan med hjälp av en mängd olika metoder modellorganismer från insekter till ryggradsdjur 5,6. För sådana ansträngningar är det bra att använda modellsystem som är enkla och experimentellt tillgängliga. Drosophila larv har visat sig uppfylla dessa krav bygger påtillgången på robusta beteendemässiga analyser, förekomsten av olika transgena tekniker och det elementära organisation av nervsystemet består endast ca 10.000 neuroner (om än med vissa eftergifter: kognitiva begränsningar, några beteendemässiga alternativ och rikedom av erfarenhet tveksamt) 7-10 .
Drosophila larver kan bilda föreningar mellan lukt och appetitive smak förstärkning som socker 11-14. I en vanlig analys etablerat i labbet av B. Gerber, djur får en två-lukt utbildning ömsesidig: En första grupp av larver utsätts för en lukt A tillsammans med en smak förstärkare (socker belöning) och därefter utsatt för en lukt B utan förstärkning 9. Samtidigt en andra grupp av larver får ömsesidig utbildning medan upplever lukt A utan förstärkning och därefter utsätts för lukt B med armering (socker belöning). I det följande båda grupperna är TESTed för deras önskemål mellan de två lukter. Relativt högre inställningar för belönas lukt återspeglar associativ inlärning - presenteras som en prestation (PI). Slutsatsen om associativa karaktär av prestanda index är övertygande, eftersom bortsett från oförutsedda mellan lukt och tastants, andra parametrar, såsom lukt och belöning exponering, tidens gång och hantering skiljer sig inte mellan de två grupperna 9.
Protocol
1. Förberedelser
- Drosophila vildtyp larver höjs vid 25 ° C och 60% -80% fuktighet i en 14/10 ljus / mörker cykel. För styrning av exakta ålder larverna alltid 20 honor placeras med 10 hanar i en injektionsflaska (6 cm höjd och 2,5 cm i diameter) som innehåller ca 6 ml vanlig fluga mat. Flugor får lägga ägg under 12 timmar och överförs till en ny flaska på den andra dagen. 5-6 dagar efter äggläggning larver nå utfodring 3: e instar skede om upp vid 25 ° C och kan nu användas för beteendevetenskaplig experiment. Emellertid måste man säkerställa att endast ta larver som fortfarande befinner sig i maten och inte larverna från sidan av flaskan. Dessa larver har redan nått "vandrande 3: e instar scenen" - strax före förpuppning - och deras användning komplicerar tolkningen av resultaten.
- Beredning av 2,5% agaros petriskålar (andra labb också använda agar koncentrationer av 1% under hela experimentet, hurallt lägre koncentrationer kan tillåta utfodring 3: e instar larver att gräva i substratet): Lös 2,5 g agaros i 100 ml DDH 2 O. Värm upp lösningen i en mikrovågsugn tills den börjar koka. Försiktigt skaka lösningen och sätter tillbaka den i mikrovågsugn tills all agaros är upplöst. Häll den varma agaroslösningen i petriskålar så att botten av petriskålar helt täckt och agaroslösningen bildar en slät yta. Låt lösningen svalna till rumstemperatur och stänga locken. Inte omedelbart stänga locken, eftersom det skulle göra det möjligt för kondensering av vatten på locken.
- Beredning av 2M fruktos petriskålar: Lös 2,5 g agaros i 100 ml DDH 2 O (igen, är användningen av 1% agar koncentration möjligt, men det kan tillåta utfodring 3: e instar larver att gräva i substratet). Värm upp lösningen i en mikrovågsugn tills den börjar koka. Försiktigt skaka lösningen och sätter tillbaka den i mikrovåg tills all agaros upplöst. Tillsätt försiktigt 35 g fruktos i den varma lösningen, långsamt omröra blandningen tills sockret upplöses för att undvika kokning fördröjning. Häll den varma fruktos-agaros-lösning i petriskålar så att bottnen är helt täckt och fruktos-agaros-lösning bildar en slät yta. Låt lösningen svalna till rumstemperatur och stänga locken. Inte omedelbart stänga locken, eftersom det skulle göra det möjligt för kondensering av vatten på locken.
- Beredning av 1-oktanol (oktober) lukt behållare: Fyll 10 il ren oktober till en skräddarsydd teflon lukt behållare och stäng den med ett lock som har flera små hål för att tillåta förångning av lukt. En detaljerad beskrivning av behållarna ges i Gerber och Stocker 2007. Förbered tre lukt behållare för oktober Lukt behållare tillåter avdunstning av de infogade kemikalier, men undvika att larver direkt kan kontakta dem. Således här beskrivna experimenten specifiktitu lukt lärande i larver utan störande smak biverkningar.
- Beredning av amylacetate (AM) lukt behållare: Späd AM 1:50 i paraffinolja. Fyll 10 ul av utspädningen till en skräddarsydd Teflon lukt behållare och stäng den med ett lock som har flera små hål för att tillåta förångning av lukt. Förbered tre lukt behållare för AM. Utspädningen är viktig av praktiska skäl, nämligen att undvika en stark preferens för en lukt över den andra som kan dölja en lärande-beroende förändringar i den relativa preferens mellan de två lukter. Lika attraktion för både lukter kan behöva bekräftas i labbet innan experimentet genom att tillämpa den senare beskrivna testet (2,5) med naiva djur. De värden som här presenteras är baserade på flera publikationer Gerber labbet som nyligen reproduceras av vårt laboratorium 9,15,16.
- Märkning av petriskålar: Innan beteendemässiga experimenten alla Petriskålar måste kodas. Det innebär attfruktos innehåller Petriskålar måste märkas till exempel med ett "X" eller ett "A" och agaros bara petriskålar med ett "Y" eller "B". Denna kod bör avslöjas för försöksledaren först när alla uppgifter har registrerats. Genom att utföra experimenten "blinda" det är därför inte möjligt att förväntningar försöksledaren kan påverka prestanda larverna. För att underlätta en förståelse för den breda läsekrets i det följande kommer vi bara tala om lukter som konditionerat stimuli (CS1 eller CS2) som antingen belönas när de presenteras på en fruktos petriskål (+) eller icke-belönad när den presenteras på ett agaros endast Petriskål (-).
2. Socker Belöning Utbildning och test
- Samla 30 matning 3: e instar larver från ett livsmedel flaska. Överföra dem till en första petriskål som innehåller några droppar kranvatten och försiktigt flytta dem framåt och bakåt med en borste. Överföra dem till en andra petriskål som innehåller också några droppar kranen WATER för att kontrollera att ingen mat pasta kvar på bodywall av larverna, annars larver skulle kunna uppleva den mat lukt under experimentet. Detta skulle sannolikt skymma inlärningsprocessen och deras prestanda i testet situationen.
- Utbildning: Att träna larver att associera lukter med appetitive socker kö följande regimen tillämpas. Sätt ett utomeuropeiskt lukt behållare på vänster och höger sida av ett "X" markerade - alltså, fruktos belöning innehåller (+) Petriskål ("blinda" experiment för detaljer se 1,6). Placera den grupp av 30 matning 3: e instar larver på mitten av petriskålen, stäng locket och vänta i 5 minuter medan djuren utsätts för oktober Kontrollera att larverna inte fångas inuti vattendroppen och kan övervinna ytspänningen hos den. Med det larver kan röra sig fritt på petriskål och uppleva lukt och / eller smak stimuli.
- Utbildning: Ta bort larverna från petriskål med en fuktad pensel och överföram på en andra petriskål som är märkt med ett "Y" - alltså, agaros endast (-) innehåller Petriskål - och har en AM lukt behållare placerad på vänster och höger sida. Stäng locket och vänta i 5 minuter medan djuren utsätts för AM.
- Träning: Upprepa 2,2) och 2,3) två gånger, så att alla 30 tre larver erfarenhet utbildning cykler: CS1 / (+) - CS2 / (-), CS1 / (+) - CS2 / (-), CS1 / (+) - CS2 / (-). I detta experiment CS1 representerar oktober och CS2-koder för AM.
- Test: Placera 01:00 och en oktober lukt container på motsatta sidor av en agaros endast petriskål. Överför utbildade djur till mitten av testet petriskål. Stäng locket och vänta i 5 minuter. Därefter räkna antalet larver på vänster sida, i mitten och till höger av testet petriskål.
- Upprepa steg 2,1) till 2,5) med en andra grupp av 30 matning 3: e instar larver men byta experimentella roller AM och oktober så att djuren får följande utbildning: CS2/ (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-). I detta experiment CS1 representerar oktober och CS2-koder för AM.
- Möjliga arrangemang för utbildning. Ovan presenterar vi en utbildning som finns på tre utbildnings försök med antingen oktober / (+) - AM / (-) eller i det ömsesidiga gruppen också tre utbildningar studier av AM / (+) - oktober / (-). Men för att undvika sekvens beroende effekter under träningen är det viktigt att variera sekvensen av stimuli i följande repetitioner av hela experimentet. Genom att variera CS1 eller CS2 ordning och även belöning presentationen i den presenterade första eller andra platta, fyra olika sekvenser för den utbildning prövningar är möjliga:
| Första gruppen | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Ömsesidig grupp | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
För att förhindra systematiska effekter av stimuli i omgivningen experimentella miljön bör man utföra testet i hälften av fallen så att oktober presenteras till vänster och AM till höger. Under andra hälften av fallen AM bör presenteras på vänster och oktober till höger.
3. Tester för Task-relevanta sensomotorisk fakulteter
Utformningen av de ovan beskrivna experimenten tillåter för analys lukt-socker lärande i vildtyp utfodring 3: e instar larver på egen hand. Men i dagliga forskare lab livet brukar använda två eller flera olika experimentella grupper av larver att jämföra, om lukt lärande beror på en nivåskilt gen, en specifik uppsättning nervceller, en mutant lager, en speciell kost, olika uppfödningssystem förhållanden giftiga kemikalier tillsätts under utveckling, etc. Därför, i alla fall när två eller flera experimentella grupper av larver testas en måste göra en uppsättning obligatoriska kontrollåtgärder experiment för att testa om de olika grupperna av larver visar korrekt sensomotorisk acuities. Detta blir obligatoriskt som potentiella fenotyper inte nödvändigtvis beror på minskade eller avskaffade förmåga att associera lukter med socker. Snarare kan de potentiella lärande defekter baseras på defekter i någon fas av sensomotorisk kretsar i behandlingen av lukter och / eller socker. Eller med andra ord, om en mutant larv inte kan känslan socker, kan det inte upprätta en socker minne. Men detta tillåter inte slutsatsen att larven inte kan lära sig. I detalj följande kontrollexperiment måste göras för att testa för korrekt ULT, AM och fruktos bearbetning av transgen larver.
1. Test för naiv oktober prefekomst
Samla 30 matning 3: e instar larver från ett livsmedel flaska. Tvätta dem noga i kranvatten enligt 2,1. Sätt en enda oktober lukt behållare på ena sidan av en agaros petriskål, lägger larverna på mitten av petriskålen, stäng locket och vänta i 5 minuter, så att larverna kan krypa på petriskål och orientera mot oktober lukt källa. Därefter räkna antalet larver på vänster sida, i mitten och till höger av testet petriskål.
2. Test för naiv AM-preferens
Samla 30 matning 3: e instar larver från ett livsmedel flaska. Tvätta dem noga i kranvatten enligt 2,1. Sätt en enda AM lukt behållare på ena sidan av en agaros petriskål, lägger larverna på mitten av petriskålen, stäng locket och vänta i 5 minuter, så att larverna kan krypa på petriskål och orientera mot AM lukt källa. Därefter räkna antalet literarvae på vänster sida, i mitten och till höger av testet petriskål.
3. Test för naiv socker preferens
Samla 30 matning 3: e instar larver från ett livsmedel flaska. Tvätta dem noga i kranvatten enligt 2,1. Förbered Petriskålar som innehåller 2,5% agaros i en halv och en 2M fruktos-agaros-blandningen i den andra halvan. Lägg larverna på petriskål, stäng locket och vänta i 5 minuter, så att larverna kan krypa på petriskål och orientera mot fruktos innehåller sidan. Därefter räkna antalet larver på vänster sida, i mitten och till höger av testet petriskål.
Beredning av halv-halv petriskålar: Förbered normala agarosplattor som beskrivs ovan i avsnitt 1,2. När agarosen fyllda petriskålarna kyls ned, försiktigt skära agarosen längs den vertikala axeln med en skalpell. Ta bort hälften av agarosen från petriskålen. ENdd en het fruktos-agaroslösning (för framställning se 1,3) till den tomma delen av Petri-skålen. Var försiktig så att båda halvorna passar och bildar inte en definierad kant - detta påverkar larver valet beteende och gör en beteendeanalys ganska svår 4..
Sham utbildning
Trots testa om transgen utfodring 3: e instar larver kan skilja på en vild typ nivå mellan oktober och luft (3,1), AM och luft (3,2) och socker och ren agaros (3,3), en extra uppsättning av test experiment har nyligen infördes (för diskussion se Gerber och Stocker, 2007). Den logiska grunden för dessa experiment är följande. Under utbildningen larver genomgår omfattande hantering och efterföljande lukt och socker stimulering. Således, är det väl möjligt att den observerade fenotypen inlärning är vilseledande (även naiva lukt och socker test uppfattning är på en vild typ nivå!). Det är möjligt att de transgena djuren differ från vildtyp larver med avseende på stresstålighet, motivation, trötthet, sensorisk anpassning, kontextuell lärande och förändringar i mättnad. Således införde Michels et al. (2005) kontroller som testa om en viss mutant kan (1) upptäcka AM kontra en tom lukt behållare om du behandlar larverna precis som under träning förutom att du utelämnar belöning och bara utsättas för både lukt, (2) identifiera oktober efter samma system, (3) upptäcka AM kontra en tom lukt behållare, om du behandlar larver i en utbildning-liknande sätt förutom att du utelämnar lukter och endast utsättas för belöningen, och (4 ) upptäcka oktober efter samma regim. För en omfattande diskussion och ytterligare information om de metoder se Michels et al (2005) och Gerber och Stocker (2007).
4. Dataanalys för Sugar Belöning lärande
- För att utvärdera data från socker belöning lärande protokoll beräkna ett oktober preferens index (PREF oktober) för var och en av två ömsesidighettiskt utbildade grupper:
För den första gruppen som fick Oktober / (+) - AM / (-) utbildning:
PREF oktober (oktober + / AM-) = (# av larver på oktober sida - # av larver på AM sidan) / # av alla larver i vänster, höger och mitten zoner
För den andra gruppen som fick AM / (+) - oktober / (-) utbildning:
PREF AM (AM + / oktober-) = (# av larver på AM sida - # av larver på oktober sida) / # av alla larver i vänster, höger och mitten zoner
- Beräkna en föreställning (PI) för de två pref värden från 4,1). PI är associativa inlärning genom att dra ut störande effekter lukt och straff exponering, tidens gång och hantering:
PI = (PREF oktober (oktober + / AM) + PREF AM (AM + / oktober)) / 2
Sålunda PI kan variera från -1 till 1. Betydligt negativa värden representerar aversiv lärande, medan betydligt positiva värden beskriver appetitive lärande. En komplett experiment består vanligen av 10 eller fler proteashämmare. Data är visualiseras som lådagram including alla värden av en given experimentell grupp. 50% av de värden som är belägen inuti lådan, medianvärdet index indikeras som en fet linje i lådagram.
5. Dataanalys för Task-relevanta sensomotorisk fakulteter
- Att utvärdera de data när man testar för korrekt oktober lukt bearbetning beräkna ett oktober-index lukt preferens enligt följande:
Lukt PREF oktober = (# av larver på oktober sida - # av larver på andra sidan) / # av alla larver i vänster, höger och mitten zoner - Att utvärdera de data när man testar för korrekt AM lukt uppfattning beräkna ett AM-index lukt preferens enligt följande:
Lukt PREF AM = (# av larver på AM sida - # av larver på andra sidan) / # av alla larver i vänster, höger och mitten zoner - Att utvärdera de data när man testar för korrekt fruktos uppfattning beräkna ett fruktos preferens-index enligt följande:
PREF fruktos = (# larver på fruktos sida - # av larver på den andra sidan) / # Av alla larver i vänster, höger och mitten zoner - Detaljer för bluff utbildningen ges i Michels et al. 2005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en översikt av de experimentella förfaranden för larver lukt associativa inlärning. Genom att para ihop en av de presenterade två lukter med socker belöning larver förvärva beteende potential att uttrycka en attraktiv svar mot den belönade lukt i jämförelse med belönas lukt. Två grupper av larver alltid utbildade antingen kopplar ihop förstärkare med lukt oktober eller AM. Föreställningen (PI) mäter den associativa funktion som skillnaden i preferens mellan de ömsesidigt utbildade grupperna.
I fall associativa funktion analyseras i transgena larver, är tester för grundläggande sensomotorisk förmåga som krävs. Detta görs genom att erbjuda dem att välja mellan en fylld lukt behållare och luft eller mellan ren agaros och agaros plus en socker. (Sham träning visas inte här). Den slutliga fördelningen av larver noteras i en specifik datablad (figur 2) och gentemotualized som ett lådagram (Figur 3). Positiva resultat indikerar ett attraktivt val beteende för preferensaktier index och appetitive lärande vid prestandaindex. Negativa värden indikerar en aversiv val beteendet för de beräknade preference index och aversiva lärande i fallet med prestanda index.
Figur 1. Omfattats av beteendemässiga försök att mäta larver associativ lukt lärande, naiva lukt preferenser och naiva smak preferenser.
- 30 Drosophila utfodring 3: e instar larver placeras i fem minuter på en agaros Petriskål som innehåller en socker belöning 2M fruktos. Samtidigt en första lukt åstadkommes i teflon behållares (oktober). Således larver kan associera en doft stimulans med en positiv förstärkare i den första utbildningen fasen. Därefter larver överförs till en andra agaros petriskål utan förstärkare, men med den andra lukt (AM) för igen 5 minuter. Utbildningen upprepas tre gånger. Slutligen, i testsituationen lukten föredrar larverna mäts för belönas lukt mot den icke-belönas lukt på en agaros petriskål. Detta medger beräkning av en första preferens index (PREF). En andra grupp av larver är utbildad på liknande sätt i ett ömsesidigt sätt. Här kan ett andra preferens index (PREF) beräknas. Äntligen en Performance Index (PI) beräknas som genomsnittet av de båda preferens index. För ytterligare information om sekvensen av försöken se också 2,7.
- För att analysera den naiva lukt preferens, är en enda lukt behållare fylld med antingen ULT eller AM placeras på ena sidan av en ren agaros petriskål. 30 matning 3: e instar larver är placed i mitten av petriskålen och efter 5 minuter fördelningen av larverna på petriskålen räknas. Från de erhållna data en olfaktorisk preferens index (PREF) beräknas sedan.
- För att analysera naiv smak fruktos preferens 2M fylls i en halv av en petriskål som innehåller ren agaros på sin andra sida. 30 matning 3: e instar larver placeras i mitten av petriskålen och efter 5 minuter fördelningen av larverna på petriskålen räknas. Från de erhållna data en smak Preference index (PREF) beräknas sedan.
Figur 2. Exempel på en rå datablad för registrering och bearbetning av data som erhållits för A) socker belöning lärande, B) naivalukt preferenser och C) naiva smak preferenser. För alla experiment antalet larver på vänster sida, i mitten och till höger i petriskålar noteras. Av denna information preferensaktier index (PREF) beräknas. Larver lärande avbildas som prestandaindex (PI) som härrör från computating de Prefs av två ömsesidigt utbildade grupper. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Exempel datavisualisering erhållits för A) socker belöning lärande, B) naiva preferenser lukt och C) naiva smak preferenser. Boxplots representerar data enligt följande: median (fet linje inom ruta), lådan visar 50% av alla datapunkter medan den övre och undre morrhår representerar övriga 25% vardera. Därför utan extremvärden de lägsta och högsta värdena indikeras av whisker gränser. Extremvärden visas som små cirklar som de definieras som varje punkt mer än 1,5 gånger den interkvartila allt från 1: a och 3: e kvartilerna. Statistisk analys av enskilda datapunkter görs med Wilcoxon signed-rank test, medan Wilcoxons rangsummetest användes för jämförelse av två datagrupper. Betydelse nivåer anges som NS för p> 0,05, * för p <0,05, ** för p <0,01 eller *** för p <0,001. Stickprovsstorlek på varje experiment: N = 15.
För lärande experimenten i A) alltid två preferensaktier index (PREF) av ömsesidiga experiment vidtas för att beräkna den slutliga Performance Index (PI). Performance Index (PI) är avbildade som lådagram därefter.
Figur 4. Exempel på GAL4 linjer vilka var etiketter en specifik uppsättning av celler i hjärnan larver. Alltid full z-projektioner av frontal vyer av larver hjärnan visas. Specifika uppsättningar av nervceller märks av anti-grönt fluorescerande protein (grön) i hela larver CNS som är visualiseras genom anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (magenta).) En NP225 etiketter en uppsättning andra ordningens lukt nervceller som kallas projektion neuroner (pil) och utvecklingsländerna vuxna visuella systemet (pilspets). B) NP2426 markerar en uppsättning olfaktoriska interneuroner (pil) vid den första olfaktoriska relästation, som kallas antenn loben. C) GR66a märker endast en uppsättning av smak sensoriska neuroner som projekt från perifera smak sinnesorgan till subeosophageal ganglion (pil). D) NP3128 etiketter flera uppsättningar av olika typer av nervceller. Pilen markerar lukt interneuronen av antenn loben liknande B. pilspets belyser ett antal dopaminerga neuroner som skjuter på en neuropil region som kallas svamp kropp. E) H24 markerar en uppsättning Kenyon svamp kroppens celler (pilen), neuroner som när det visas vara nödvändigt för larver lukt lärande. F) NP7493 är ett exempel på en relativt ospecifik uttryck mönster som innehåller flera uppsättningar av utvecklingsländer neuroner (pilar) som ytterligare kommer att skilja under metamorfos att bilda hjärnan av flugan. Skala barer = 50 pm.
Figur 5. Översikt sammanfattar lyckade försök att studera associativ inlärning i Drosophila larver. Olfactory stimuli samt lättare kan användas som en konditionerad stimulus skall associeras med antingen belöning eller straff (obetingat stimulus). Belöna stimuli inkluderar socker och låga koncentrationer av salt, straffa stimuli omfattar höga koncentrationer av salt, kinin, elektriska stötar, värme, mekanisk stimulering genom vibration (surr) och ljus 11,12,17-24. Klicka här för att se större bild .
| GAL4 / UAS konstruerar ofta i vårt labb | |||
| Förkortning | Protein | Funktion | Litteratur |
| Visualisering | |||
| UAS-mCD8 :: GFP | grönt fluorescerande protein | membRANE markör | Lee et al., 1999 |
| UAS-n-syb :: GFP | grönt fluorescerande protein | presynaptiska markör | Ito et al., 1998 |
| UAS-Dscam17.1 :: GFP | grönt fluorescerande protein | postsynaptiska markör | Wang et al., 2004 |
| UAS-NLS :: GFP | grönt fluorescerande protein | cellkropp markör | Robertson et al., 2003 |
| Interferens med neuronala signalering | |||
| UAS-hid | huvud involution defekt | inducerar apoptos | Zhou et al., 1997 |
| UAS-RPR | Reaper | inducerar apoptos | Zhou et al., 1997 |
| UAS-shi ts | dominant negativ dynamin | block vesicle återvinning | Kitamoto, 2001 |
| UAS-Kir.2.1 :: EGFP | inåt likriktande K + kanalen | ingen membrandepolarisering | Baines et al. 2001 |
| UAS-TRPA1 | katjon kanal | temperaturberoende aktivering | Rosenzweig et al. 2005 |
| UAS-ChR2 | Channelrhodopsin | ljusberoende aktiveringen | Schroll et al., 2006 |
Tabell 1. UAS effektor konstruktioner som ofta används i labbet för att visualisera den neuronala anatomi och manipulera synaptisk överföring 25-33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna inställning i Drosophila larver möjliggör undersökning av associativa lukt lärande inom en jämförelsevis elementära hjärna. Tillvägagångssättet är enkelt, billigt, lätt att etablera sig i ett labb och inte kräver högteknologisk utrustning 9. Vi presenterar en version av försöket, för att studera aptitskapande associativ inlärning förstärks av fruktos belöning 11. Den beskrivna inställning är baserad på en serie av parametriska studier som omfattande undersökta variationer i antalet utbildningsplatser prövningar enda analys kontra massa analys, uppehållstid, som används lukter och koncentrationer lukt och kön 9,15,34,35. Således integrerar den avbildade beteende inställningar denna information i ett exceptionellt reproducerbar metod för att studera högre hjärnfunktioner i Drosophila. Ytterst baserat på dess enkla installation av belöna eller bestraffa verkan av upplösbart ämne kan lätt testas med denna analys.
ve_content "> Dessutom har flera varianter av paradigm nyligen publicerade som tillåter undersökning av associativa visuella lärande i larverna 23,36 (etablerat i Gerber et al (2004).) och elektrisk stöt, ljus, värme, kinin eller vibrationer har också framgångsrikt genomförts som aversiva förstärkare för associativ lukt lärande 9,17,19-21,37-40. Således finns en omfattande uppsättning av experimentella uppställningar för att analysera beteende, neuronala och molekylära grunden för inlärning och minne i Drosophila larver ( Figur 5) 13,14,41,42. här har vi fokuserat enbart på lukt-fruktos lära på grund av robustheten i analysen och de relativt höga index prestanda som kan uppnås. Speciellt vissa av aversiva varianterna leder till endast små beteende förändringar. Detta begränsar i viss mån tillämpningen av metoden, förutom utvecklingsfrågor av djuren som gör studier på larver långsiktigtminne ganska omöjligt.Den larver hjärnan består av endast cirka 10.000 neuroner i sin helhet. Således grund av dess relativa enkla (i antal) organisation är det väl tillgänglig för genetisk störning, vilket i sin tur gör det möjligt för avancerade studier av molekylära och neuronala grunden för inlärning och minne. Speciellt GAL4/UAS systemen och dess senaste ändringar möjliggör genetisk manipulering av definierade uppsättningar av nervceller och upp till och med enstaka celler i en tid och rum sätt (Figur 4) 7,10. Härigenom en omfattande uppsättning effektor linjer ger möjlighet att visualisera dessa definierade uppsättningar av nervceller (Figur 4) 25,43 eller alternativt att manipulera sin neuronal utgång (tabell 1). Oftast effektor gener tillämpas som kan cell-autonomt inducera celldöd eller hämma neuronal transmission 29,30,33. Mer nyligen teknik utvecklades att allåg för en kontrollerad artificiell aktivering av neuroner som drivs av ljus eller temperatur (tabell 1) 31,32,44.
Sammanfattningsvis, tillåter en kombination av avancerade metoder för genetisk störning och de här beskrivna beteende experiment avslöja neuronala, molekylära och beteendemässiga grunden för inlärning och minne i elementära hjärna Drosophila larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill särskilt tacka medlemmarna i Gerber labb för tekniska instruktioner på deras experimentuppställning och kommentarer om manuskriptet. Vi tackar också Lyubov Pankevych för flyga skötsel och underhåll av vildtyp kantoner lager. Detta arbete stöds av DFG bidraget TH1584/1-1, SNF bidraget 31003A_132812 / 1 och Zukunftskolleg vid universitetet i Konstanz (alla till AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
References
- Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
- Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
- Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
- Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
- Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
- Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
- Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
- Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
- Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
- Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
- Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
- Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
- Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
- Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. , (2012).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
- Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
- Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
- Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
- Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. , (2011).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
- Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
- Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
- Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
- Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
- Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
