Summary
Drosophila larven zijn in staat om geur stimuli associëren met smaak beloning. Hier beschrijven we een eenvoudige gedragsmatige paradigma dat de analyse van appetitieve associatief olfactorische leren mogelijk maakt.
Abstract
In het volgende beschrijven we de methodologische details van appetitieve associatief olfactorische leren in Drosophila larven. De opstelling in combinatie met genetische storingen is een handvat om de neuronale en moleculaire grondslagen van specifiek associatief leren analyseren in eenvoudige larvale hersenen.
Organismen kunnen gebruiken ervaringen uit het verleden aan de huidige gedrag aan te passen. Deze verwerving van potentiële gedrag kan worden gedefinieerd als leren en de fysieke bases van deze mogelijkheden als geheugen sporen 1-4. Neurowetenschappers te begrijpen hoe deze processen zijn georganiseerd in termen van moleculaire en neuronale veranderingen in de hersenen door verschillende methoden in modelorganismen variërend van insecten tot 5,6 vertebraten. Voor deze inspanningen is het handig om te gebruiken modelsystemen die eenvoudig en experimenteel toegankelijk. De Drosophila larve bleek deze eisen voldoen gebaseerd opde beschikbaarheid van krachtige gedrag assays, het bestaan van verschillende transgene technieken en de elementaire organisatie van het zenuwstelsel die slechts ongeveer 10.000 neuronen (met enige voordelen: cognitieve beperkingen, weinig gedragsalternatieven en rijke ervaring bedenkelijk) 7-10 .
Drosophila larven kunnen vormen associaties tussen geuren en appetitieve smaak versterking zoals suiker 11-14. In een standaard assay, die in het lab van B. Gerber krijgen de dieren twee geur wederzijdse training: Een eerste groep van larven wordt blootgesteld aan een geur A samen met een smaak bekrachtiger (suiker beloning) en vervolgens blootgesteld aan een geur B zonder wapening 9. Inmiddels is er een tweede groep van larven krijgt wederzijdse opleiding, terwijl het ervaren van geur A zonder wapening en vervolgens worden blootgesteld aan geur B met versterking (suiker beloning). In de volgende twee groepen tested voor hun voorkeur tussen de twee geuren. Relatief hogere voorkeuren voor de beloonde geur weerspiegelen associatief leren - gepresenteerd als een prestatie-index (PI). De conclusie met betrekking tot de associatieve aard van de prestatie-index is dwingend, want afgezien van de contingentie tussen geuren en tastants, andere parameters, zoals geur en beloning blootstelling, verstrijken van de tijd en de behandeling verschilt niet tussen de twee groepen 9.
Protocol
1. Voorbereiding
- Drosophila wild-type larven worden opgewekt bij 25 ° C en 60% -80% vochtigheid in een 14/10 licht / donker-cyclus. Voor het regelen van de exacte leeftijd van de larven altijd 20 vrouwtjes worden gebracht met 10 mannen in een flacon (6 cm hoog en 2,5 cm diameter) dat ongeveer 6 ml van de standaard vlieg voedsel bevat. Vliegen mogen eieren gedurende 12 uur en overgebracht naar een nieuw buisje op de tweede dag. 5-6 dagen na eierleggende larven bij de voeding 3e instar stadium als verhoogd bij 25 ° C en kan nu worden gebruikt voor de gedrags experiment. Echter, men moet ervoor zorgen alleen larven die nog in het voedsel en niet de larven van de wand van de flacon. Deze larven zijn al bereikt "zwervende 3 e instar stadium" - kort voor de verpopping - en het gebruik ervan bemoeilijkt de interpretatie van de resultaten.
- Bereiding van 2,5% agarose petrischalen (andere laboratoria gebruiken ook agar concentraties van 1% gedurende het experiment, hoesteeds lagere concentraties kunnen toestaan dat de voeding 3 e instar larven te graven in de ondergrond): Los 2,5 g agarose in 100 ml ddH 2 O. Verwarm de oplossing in een magnetron tot het begint te koken. Voorzichtig schudden van de oplossing en zet het terug in de magnetron totdat alle agarose is opgelost. Giet de hete agarose oplossing in petrischalen zodat de bodem van de petrischalen geheel bedekt en de agarose oplossing vormt een glad oppervlak. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en sluit de deksels. Niet onmiddellijk sluit de deksels, want het zou voor de condensatie van water mogelijk te maken op de deksels.
- Bereiding van 2M fructose petrischalen: Los 2,5 g agarose in 100 ml ddH 2 O (opnieuw gebruik van 1% agar concentratie mogelijk, maar kan hij de voeding 3e instar larven te graven in het substraat). Verwarm de oplossing in een magnetron tot het begint te koken. Voorzichtig schudden van de oplossing en zet het terug in de micro-golf totdat alle agarose is opgelost. Voeg voorzichtig 35 g fructose in de hete oplossing; langzaam beweeg het mengsel tot de suiker is opgelost aan de kook retardatie voorkomen. Giet de hete fructose-agarose oplossing in petrischalen zodat de bodem volledig bedekt en fructose-agarose oplossing vormt een glad oppervlak. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en sluit de deksels. Niet onmiddellijk sluit de deksels, want het zou voor de condensatie van water mogelijk te maken op de deksels.
- Bereiding van 1-octanol (OCT) geur containers: Vul 10 pi zuivere oktober een maat Teflon geur container en een deksel dat meerdere kleine gaten zorgen voor verdamping van de geur heeft sluiten. Een gedetailleerde beschrijving van de houders wordt in Gerber en Stocker 2007. Bereid drie geur containers voor oktober Geur-containers voor de verdamping van het ingebrachte chemicaliën, maar vermijden dat larven direct hen. Dus de hier beschreven experimenten specifiekaan te pakken olfactorische leren in larven zonder verstorende smaak bijwerkingen.
- Voorbereiding van amylacetate (AM) geur containers: Verdun AM 1:50 in paraffine-olie. Vul 10 ul van de verdunning in een custom made Teflon geur container en sluiten met een deksel dat meerdere kleine gaten zorgen voor verdamping van de geur heeft. Bereid drie geur containers voor AM. De verdunning is belangrijk om praktische redenen, namelijk voorkomen een sterke voorkeur voor een geur op de andere die een leer-afhankelijke verandering in de relatieve voorkeur tussen de twee geuren kan maskeren. De gelijke trekpleister voor zowel geuren moet mogelijk worden bevestigd in het laboratorium vóór de proef door het toepassen van de latere beschreven test (2.5) met naïeve dieren. De waarden die hier zijn gebaseerd op een aantal publicaties van de Gerber lab die onlangs werden gereproduceerd door ons lab 9,15,16.
- Labeling van de petrischalen: Voor de gedragsexperimenten alle petrischalen gecodeerd moeten worden. Dat betekent datfructose bevattend petrischalen moeten worden gemarkeerd met bijvoorbeeld een "X" of een "A" en agarose alleen petrischalen met een "Y" of "B". Deze code moet worden geopenbaard aan de experimentator nadat alle gegevens zijn opgenomen. Door het uitvoeren van de experimenten "blind" is dus niet mogelijk dat de verwachtingen van de onderzoeker kan de prestaties van de larven. Om inzicht te krijgen gemak voor de brede lezerspubliek in de volgende zullen we alleen praten over de geuren als geconditioneerde stimuli (CS1 of CS2) die ofwel worden beloond wanneer gepresenteerd op een fructose petrischaal (+) of niet-beloond toen gepresenteerd op een agarose alleen petrischaal (-).
2. Suiker Beloning Training en Test
- Verzamel 30 voeding 3 e instar larven van een levensmiddel flacon. Overbrengen naar een eerste petrischaal dat sommige druppels kraanwater bevat en voorzichtig verplaatsen naar voren en naar achteren met een borstel. Overbrengen naar een tweede petrischaal dat bevat ook een aantal druppels van leidingwater water controleren of geen voedsel pasta blijft de bodywall van de larven, anders larven zou kunnen het voedsel geur ervaren tijdens het experiment. Dit zou waarschijnlijk verduisteren het leerproces en hun prestaties in de test situatie.
- Training: Om larven trainen om associëren geuren met een appetitieve suiker cue de volgende regeling wordt toegepast. Plaats een LGO geur container op de linker-en rechterkant van een "X" aangeduid - dus, fructose beloning met (+) petrischaal ("blind" experiment, voor details 1,6 te zien). Plaats de groep van 30 voeding 3e instar larven op het midden van de petrischaal, sluit het deksel en wacht 5 min terwijl de dieren blootgesteld aan oktober Zorg ervoor dat de larven niet bent gevangen in een druppel water en kan de oppervlaktespanning van het te overwinnen. Tegen die larven kunnen zich vrij bewegen op de petrischaal en ervaar olfactorische en / of smaak stimuli.
- Training: Verwijder de larven uit de petrischaal met een vochtige borstel en breng dem op een tweede petrischaal dat is gemerkt met een "Y" - dus alleen agarose (-) met petrischaal - en heeft een AM geur container op de linker-en rechterzijde. Sluit het deksel en wacht 5 min, terwijl de dieren worden blootgesteld aan AM.
- Training: Repeat 2.2) en 2.3) tweemaal, zodat alle 30 larven bieden drie vormingscycli: CS1 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-). In dit experiment CS1 vertegenwoordigt LGO en CS2 codes voor AM.
- Test: Plaats een uur en een enkele LGO geur container op de tegengestelde sites van een agarose-only petrischaal. Breng de getrainde dieren naar het midden van de test petrischaal. Sluit het deksel en wacht 5 minuten. Vervolgens telt het aantal larven links, midden en rechts van de test petrischaal.
- Herhaal de stappen 2,1) tot 2,5) met een tweede groep van 30 voeding 3 e instar larven, maar wisselen de experimentele rol van AM-en LGO zodanig dat de dieren de volgende training te ontvangen: CS2/ (+) - CS1 / (-) CS2 / (+) - CS1 / (-) CS2 / (+) - CS1 / (-). In dit experiment CS1 vertegenwoordigt LGO en CS2 codes voor AM.
- Mogelijke regelingen voor de opleiding. Hierboven hebben we een training die bestaat uit drie trainingen proeven van een van beide LGO / (+) te presenteren - AM / (-) of in de wederzijdse groep van eveneens drie opleidingen proeven van AM / (+) - OCT / (-). Maar om sequentieafhankelijk te vermijden tijdens de training is het belangrijk te variëren de volgorde van de stimuli in volgende herhalingen van het volledige experiment. Door variatie van de CS1 of CS2 en ook om de beloning presentatie in de eerste of tweede plaat gepresenteerd, vier verschillende sequenties voor de training trials mogelijk:
| Eerste groep | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Wederzijdse groep | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
Systematische effecten van stimuli in de omringende experimentele omgeving te voorkomen, moet men de test in de helft van de gevallen dat LGO wordt gepresenteerd links en rechts uur. In de andere helft van de gevallen AM moet worden gepresenteerd aan de linkerkant en OCT rechts.
3. Tests voor taakrelevante sensomotorische Faculteiten
Het ontwerp van de hierboven beschreven experimenten maakt analyse geur-suiker leren in wild type voeden 3e instar larven op zichzelf. Echter, in het dagelijks leven lab onderzoekers gewoonlijk twee of meer verschillende experimentele groepen larven te vergelijken, indien olfactorische leren afhankelijk van een parname gen, een specifieke set van neuronen, een mutant stock, een speciaal dieet, verschillende kweekomstandigheden, giftige chemicaliën toegevoegd tijdens de ontwikkeling, etc. Dus, in alle gevallen waarin twee of meer experimentele groepen larven getest men doen set van verplichte controle-experimenten om te testen, als de verschillende groepen van larven vertonen een goede sensomotorische acuities. Dit wordt verplicht als potentiële fenotypes zijn niet per se te wijten aan verlaagd of afgeschaft mogelijkheden om associëren geuren met suiker. Vrij zouden mogelijke defecten leren gebaseerd op gebreken in elke stap van de sensomotorische circuits in de verwerking van geuren en / of suiker. Of met andere woorden als een mutant larve niet kan sense suiker kan vestigen geen suiker geheugen. Maar dit staat niet toe dat de conclusie dat de larve niet kan leren. In detail de volgende controle experimenten moeten worden uitgevoerd om te testen voor de juiste oktober, AM en fructose verwerking van transgene larven.
1. Test voor naïeve oktober prefeschil
Verzamel 30 voeding 3 e instar larven van een levensmiddel flacon. Zorgvuldig wassen in kraanwater, zoals beschreven in 2.1. Doe een oktober geur container aan een zijde van een agarose petrischaal, voeg de larven op het midden van de petrischaal, sluit het deksel en 5 minuten wachten, zodat de larven op de petrischaal en oriënteren kruipen naar de LGO geurbron. Vervolgens telt het aantal larven aan de linkerkant, in het midden en aan de rechterkant van de test petrischaal.
2. Test voor naïeve AM voorkeur
Verzamel 30 voeding 3 e instar larven van een levensmiddel flacon. Zorgvuldig wassen in kraanwater, zoals beschreven in 2.1. Doe een AM geur container aan een zijde van een agarose petrischaal, voeg de larven op het midden van de petrischaal, sluit het deksel en 5 minuten wachten, zodat de larven op de petrischaal en oriënteren kruipen naar de AM geurbron. Vervolgens tellen het aantal larvae links, midden en rechts van de test petrischaal.
3. Test voor naïeve suiker voorkeur
Verzamel 30 voeding 3 e instar larven van een levensmiddel flacon. Zorgvuldig wassen in kraanwater, zoals beschreven in 2.1. Bereid Petrischalen die 2,5% agarose bevatten helft of 2M fructose-agarose mengsel in de andere helft. Voeg de larven op de petrischaal, sluit het deksel en 5 minuten wachten, zodat de larven kruipen op de Petrischaal en oriënteren op de fructose bevattend kant. Vervolgens telt het aantal larven aan de linkerkant, in het midden en aan de rechterkant van de test petrischaal.
Voorbereiding van half-half petrischalen: Bereid normale agarose platen zoals hierboven in paragraaf 1.2 beschreven. Wanneer de agarose gevulde Petrischalen worden afgekoeld, knip de agarose langs de verticale as met een scalpel. Verwijder een helft van de agarose uit de petrischaal. Eendd a hot fructose-agarose-oplossing (voor de bereiding zie 1.3) naar de lege helft van de petrischaal. Zorg ervoor dat beide helften passen en vormen geen gedefinieerde rand - dit beïnvloedt de larvale keuzegedrag en maakt een gedragsanalyse nogal moeilijk. 4.
Sham training
Ondanks het testen als transgene voeding 3 e instar larven zijn in staat om onderscheid te maken op een wild-type niveau tussen LGO en lucht (3,1), AM en lucht (3,2) en suiker en pure agarose (3,3), een extra set van test experimenten is onlangs ingevoerd (voor discussie zie Gerber en Stocker, 2007). De redenen voor deze experimenten is de volgende. Tijdens de training larven ondergaan enorme behandeling en opeenvolgende geur en suiker stimulatie. Aldus is het goed mogelijk dat de waargenomen fenotype leren misleidend (hoewel naïef geur en suiker perceptie tests op wildtype niveau!). Het is immers mogelijk dat de transgene dieren differ van wild-type larven met betrekking tot stressbestendigheid, motivatie, vermoeidheid, zintuiglijke aanpassing, contextueel leren, en veranderingen in de verzadiging. Zo Michels et al.. (2005) controles ingevoerd die test of een bepaalde mutant kan (1) detecteren uur versus een lege container geur als u behandelen larven precies als tijdens training behalve dat de beloning weggelaten en slechts bloot aan beide geuren, (2) te detecteren Okt Na hetzelfde regime, (3) te detecteren AM versus een lege container geur, als u de behandeling van de larven in een training-achtige manier, behalve dat u weglaten van de geuren en alleen maar bloot te stellen aan de beloning, en (4 ) op te sporen Okt Na dezelfde dosis kregen. Voor een uitgebreide discussie en verdere details over de methoden zie Michels et al. (2005) en Gerber en Stocker (2007).
4. Data Analyse voor Sugar Reward Learning
- De gegevens van de suiker beloning leren protocol evalueren berekenen oktober voorkeur index (PREF OCT) voor elk van de twee wederkerigheidtisch opgeleid groepen:
Voor de eerste groep dat LGO / (+) ontvangen - AM / (-) opleiding:
PREF OCT (OCT + / AM-) = (# van larven op OCT kant - aantal larven op AM zijde) / # van alle larven in de linker-, rechter-en middelste zones
Voor de tweede groep die AM / (+) ontvangen - OCT / (-) opleiding:
PREF AM (AM + / LGO-) = (# van larven op AM kant - aantal larven op OCT zijde) / # van alle larven in de linker-, rechter-en middelste zones
- Bereken een prestatie-index (PI) voor de twee PREF waarden van 4,1). De PI is associatief leren door intrekking van storende effecten van geur en straf blootstelling, verstrijken van de tijd en de behandeling:
PI = (PREF LGO (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / OCT)) / 2
Zo kan PI van -1 tot 1. Aanzienlijk negatieve waarden vertegenwoordigen aversieve leren, terwijl significant positieve waarden beschrijven appetitieve leren. Een complete experiment bestaat meestal uit 10 of meer PI's. De gegevens worden gevisualiseerd als boxplots including alle waarden van een bepaalde experimentele groep. 50% van de waarden zijn gelegen binnen het vak, de mediaan prestatie-index wordt aangegeven als een dikke lijn in de boxplot.
5. Data Analyse voor taakrelevante sensomotorische Faculteiten
- Om de gegevens te evalueren bij het testen voor een correcte oktober geur verwerking een LGO geur voorkeur index te berekenen als volgt:
Geur PREF oktober = (# van larven op OCT kant - aantal larven aan de andere kant) / # van alle larven in de linker-, rechter-en middelste zones - Om de gegevens te evalueren bij het testen voor een goede AM geurwaarneming een AM geur voorkeur index te berekenen als volgt:
Geur PREF AM = (# van larven op AM kant - aantal larven aan de andere kant) / # van alle larven in de linker-, rechter-en middelste zones - Om de gegevens te evalueren bij het testen voor een goede fructose perceptie van een fructose voorkeur index te berekenen als volgt:
PREF fructose = (# van larven op fructose side - aantal larven anderzijds) / # Van alle larven in de linker-, rechter-en middelste zones - Details voor de sham training worden gegeven in Michels et al.. 2005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een overzicht van de experimentele procedures voor larvale olfactorische associatief leren. Door de combinatie van een van de twee voorgestelde geuren een suiker beloning larven verwerven gedrag potentieel een aantrekkelijk antwoord naar de beloning geur in vergelijking met de expressie beloond geur. Twee groepen larven worden altijd getraind door een van beide het koppelen van de bekrachtiger met de geur LGO of AM. De prestatie-index (PI) meet de associatieve functie als het verschil in voorkeur tussen de heen en weer opgeleide groepen.
In het geval dat associatieve functie wordt geanalyseerd in transgene larven, zijn tests voor elementaire sensomotorische vereiste bekwaamheid. Dit wordt gedaan door hen de keuze tussen een gevulde geur container en lucht of tussen zuivere agarose en agarose plus een suiker. (Sham opleiding is hier niet getoond). De uiteindelijke verdeling van de larven wordt opgemerkt in een specifieke data sheet (figuur 2) en tenualized als boxplot (figuur 3). Positieve resultaten wijzen op een aantrekkelijke keuze gedrag van de preferente indices en begerend leren bij de kengetallen. Negatieve waarden duiden op een aversieve keuzegedrag van de berekende voorkeur indexen en aversieve leren in het geval van de prestatie-indicatoren.
Figuur 1. Schema van de gedragsexperimenten om larvale associatieve olfactorische leren, naïef olfactorische voorkeuren en naïef smaak voorkeuren te meten.
- 30 Drosophila voeding 3 e instar larven worden geplaatst gedurende vijf minuten op een agarose petrischaal die een suiker beloning van 2M fructose bevat. Tegelijkertijd een eerste geur wordt in Teflon containers (LGO). Zo larven kunnen associëren een geur stimulus met een positieve bekrachtiger in de eerste trainingsfase. Vervolgens larven worden overgebracht naar een tweede agarose petrischaal zonder bekrachtiger maar bij de tweede geur (AM) voor het opnieuw 5 min. De training wordt drie keer herhaald. Tenslotte in de testsituatie de geur voorkeur van de larven wordt gemeten voor de geur beloond tegen het niet beloond geur op een agarose petrischaal. Dit maakt de berekening van een eerste voorkeur index (PREF). Een tweede groep van larven wordt eveneens getraind in een wederzijds manier. Hier kan een tweede voorkeur index (PREF) berekend. Eindelijk een Performance Index (PI) wordt berekend door het gemiddelde te beiden voorkeur indices. Voor meer informatie over de volgorde van de proeven zie ook 2.7.
- Voor het analyseren van de naïeve geur voorkeur wordt een geur container gevuld met LGO of AM aan een zijde van een pure agarose petrischaal. 30 voeding 3 e instar larven zijn placed in het midden van de petrischaal en na 5 min de verdeling van de larven op de petrischaal wordt geteld. Uit de verkregen gegevens een olfactorisch voorkeur index (PREF) wordt dan berekend.
- Voor het analyseren van de naïeve smaak voorkeur 2M fructose gevuld in een helft van een petrischaal die pure agarose bevat aan zijn andere zijde. 30 geeft 3e instar larven in het midden van de petrischaal en na 5 min de verdeling van de larven op de petrischaal wordt geteld. Uit de verkregen gegevens een smaak voorkeur Index (PREF) wordt dan berekend.
Figuur 2. Voorbeeld van een ruwe data sheet voor het registreren en verwerken van gegevens voor A) suiker beloning leren, B) naïefgeur voorkeuren en C) naïef smaak voorkeuren. Voor alle experimenten het aantal larven aan de linkerkant, in het midden en aan de rechterkant van de petrischalen worden genoteerd. Uit deze informatie voorkeur indices (PREF) worden berekend. Larvale leren wordt afgeschilderd als prestatie-indexen (PI) die voortvloeien uit computating de prefs van twee wederzijds opgeleid groepen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Voorbeeld data visualisatie voor A) suiker beloning leren, B) naïef geur voorkeuren en C) naïef smaak voorkeuren. Boxplots vertegenwoordigen gegevens als volgt: mediaan (dikke lijn binnen box), het vak, geeft 50% van alle data punten, terwijl de bovenste en onderste whisker vertegenwoordigt de overige 25% elk. Dus zonder uitschieters de minimum en maximum waarden aangegeven door de whisker grenzen. Uitschieters worden afgeschilderd als kleine cirkels ze gedefinieerd als elk punt meer dan 1,5 keer de interkwartielafstand van de 1e en 3e kwartielen. Statistische analyse van enkele datapunten gebeurt met Wilcoxon signed-rank test, terwijl Wilcoxon rank sum test wordt gebruikt ter vergelijking van twee gegevensgroepen. Significantieniveaus aangeduid als ns voor p> 0,05, * voor p <0,05, ** voor p <0,01 *** of voor p <0,001. Steekproefgrootte van elk experiment: N = 15.
Voor het leren proeven in A) altijd twee voorkeuren indices (PREF) van wederzijdse experimenten worden genomen om de uiteindelijke prestatie-index (PI) te berekenen. Prestatie Index (PI) worden afgebeeld als boxplots dienovereenkomstig.
Figuur 4. Voorbeelden van GAL4 lijnen die elk een specifieke set van cellen etiketten binnen larvale hersenen. Altijd vol z-projecties van frontale uitzicht op de larvale hersenen worden weergegeven. Specifieke sets van neuronen worden aangeduid met anti-green fluorescent protein (groen) in het hele CNS larvale dat wordt voorgesteld door anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (magenta). A) NP225 labels een aantal tweede orde olfactorische neuronen, genaamd projectie neuronen (pijl) en de ontwikkeling van volwassen visuele systeem (pijlpunt). B) NP2426 markeert een reeks olfactorische interneuronen (pijl) in de eerste olfactorische relaisstation genoemd antennelid kwab. C) GR66a labels uitsluitend een reeks smaak sensorische neuronen die project uit de perifere smaak zintuigen om de subeosophageal ganglion (pijl). D) NP3128 labels meerdere sets van verschillende soorten neuronen. De pijl markeert olfactorische interneuronen van de antennaal kwab vergelijkbaar met de pijlpunt B. wijst op een reeks van dopaminerge neuronen dat project op een neuropil regio genaamd paddestoel lichaam. E) H24 merken een set van paddestoel lichaam Kenyon cellen (pijl), neuronen die waar getoond noodzakelijk larven olfactorische leren. F) NP7493 is een voorbeeld van een relatief niet-specifiek expressiepatroon dat meerdere reeksen van ontwikkelende neuronen (pijlen) die verder differentiëren tijdens metamorfose naar de hersenen van de vlieg vormen omvat. Schaal bar = 50 um.
Figuur 5. Overzicht samenvatten succesvolle pogingen om associatief leren in D studerenrosophila larven. Olfactorische stimuli en licht kan worden gebruikt als een geconditioneerde stimulus geassocieerd te worden met ofwel beloning of straf (ongeconditioneerde stimulus). Belonende stimuli bestaan uit suiker en lage concentraties van zout; straffen prikkels bevatten hoge concentraties van zout, kinine, elektrische schokken, warmte, mechanische stimulatie door middel van trillingen (buzz) en lichte 11,12,17-24. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| GAL4 / UAS bouwt vaak gebruikt in ons lab | |||
| Afkorting | Eiwit | Functie | Literatuur |
| Visualisatie | |||
| UAS-mCD8 :: GFP | green fluorescent protein | membrane marker | Lee et al.., 1999 |
| UAS-n-SYB :: GFP | green fluorescent protein | presynaptische marker | Ito et al.., 1998 |
| UAS-Dscam17.1 :: GFP | green fluorescent protein | postsynaptische marker | Wang et al.., 2004 |
| UAS-NLS :: GFP | green fluorescent protein | cellichaam marker | Robertson et al.., 2003 |
| Interferentie met neuronale signalering | |||
| UAS-hid | hoofd involutie defect | apoptose induceert | Zhou et al.., 1997 |
| UAS-RPR | maaier | apoptose induceert | Zhou et al.., 1997 |
| UAS-shi ts | dominant negatieve dynamine | blokken vesicle recycling | Kitamoto, 2001 |
| UAS-Kir.2.1 :: EGFP | innerlijk rectificeren K + kanaal | no membraandepolarisatie | Baines et al.., 2001 |
| UAS-TRPA1 | kationenkanaal | temperatuur afhankelijke activering | Rosenzweig et al.., 2005 |
| UAS-ChR2 | Channelrhodopsin | licht afhankelijke activering | Schroll et al.., 2006 |
Tabel 1. UAS effector constructies vaak gebruikt in het lab naar de neuronale anatomie visualiseren en synaptische transmissie te manipuleren vijfentwintig-drieëndertig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven opstelling in Drosophila larven maakt voor het onderzoek naar associatieve olfactorische leren in een relatief lagere hersenen. De aanpak is eenvoudig, goedkoop, eenvoudig vast te stellen in een lab en vereist geen high-tech apparatuur 9. Wij presenteren een versie van het experiment om begerend associatief leren versterkt door fructose beloning 11 bestuderen. De beschreven opstelling is gebaseerd op een reeks parametrische studies die uitvoerig onderzocht variaties in het aantal opleidingen onderzoeken zijn enkele assay versus massa-assay, retentietijd, die geuren en geurconcentraties en geslacht 9,15,34,35. Zo is de afgebeelde gedrag setup integreert deze informatie in een uitzonderlijk reproduceerbare benadering van hogere hersenfuncties in Drosophila bestuderen. Uiteindelijk, gebaseerd op de eenvoudige set-up van de belonen of te straffen effect van oplosbaar stof gemakkelijk kan worden getest met deze test.
ve_content "> Daarnaast zijn verschillende varianten van het paradigma recent verschenen die het mogelijk maken het onderzoek naar associatieve visueel leren in de larven 23,36 (opgericht in Gerber et al. (2004).), en elektrische schokken, licht, warmte, kinine of trillingen werden eveneens met succes toegepast als aversieve versterkers voor associatieve olfactorische leren 9,17,19-21,37-40. Zo wordt een uitgebreide set van experimentele opstellingen bestaat om het analyseren van de gedrags-, neuronale en moleculaire basis van leren en geheugen in Drosophila larven ( figuur 5) 13,14,41,42. Hier wordt uitsluitend gericht op geur-fructose leren door de robuustheid van de test en de relatief hoge prestatie-indexen kunnen worden bereikt. Vooral aan de aversieve varianten slechts tot kleine gedrags veranderingen. Dit beperkt enigszins de toepassing van de werkwijze naast ontwikkelingskwesties van de dieren die studies maken op larvale langdurigegeheugen in plaats onmogelijk.De larvale hersenen bestaan uit slechts ongeveer 10.000 neuronen in zijn geheel. Dus vanwege de relatief eenvoudige (in termen van aantallen) organisatie is het goed toegankelijk is voor genetisch ingrijpen, wat op zijn beurt zorgt voor geavanceerde studies over de moleculaire en neurale basis van leren en geheugen. Vooral de GAL4/UAS systemen en de recente wijzigingen mogelijk voor de genetische manipulatie van gedefinieerde sets van neuronen en tot zelfs enkele cellen in een ruimte-tijd-wijze (Figuur 4) 7,10. Hierbij een uitgebreide reeks effector lijnen biedt de mogelijkheid om deze gedefinieerde sets van neuronen (figuur 4) 25,43 of eventueel visualiseren hun neuronale output (tabel 1) te manipuleren. Meestal effector genen worden toegepast die cel-autonoom celdood induceren of remmen neuronale transmissie 29,30,33. Meer recent technieken ontwikkeld die allaag voor een gecontroleerde kunstmatige activering van neuronen aangedreven door licht of temperatuur (tabel 1) 31,32,44.
Kortom, laat de combinatie van geavanceerde manieren van genetisch ingrijpen en de hier beschreven gedragsexperimenten het blootleggen van de neuronale, moleculaire en gedragsmatige basis van leren en geheugen in de elementaire hersenen van Drosophila larven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen vooral de leden van de Gerber lab bedanken voor technische instructies op hun experimentele opstelling en commentaar op het manuscript. We danken ook Lyubov Pankevych voor fly-verzorging en het onderhoud van het wild-type kantons voorraad. Dit werk wordt ondersteund door de DFG subsidie TH1584/1-1, de SNF subsidie 31003A_132812 / 1 en de Zukunftskolleg van de Universiteit van Konstanz (alle tot AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
References
- Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
- Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
- Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
- Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
- Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
- Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
- Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
- Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
- Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
- Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
- Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
- Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
- Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
- Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. , (2012).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
- Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
- Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
- Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
- Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. , (2011).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
- Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
- Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
- Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
- Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
- Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
