Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית doi: 10.3791/4334 Published: February 18, 2013

Summary

זחלי תסיסנית מסוגלים לשייך גירויי ריח בתגמול בטעם. כאן אנו מתארים הפרדיגמה התנהגות פשוטה המאפשרת הניתוח של למידה אסוציאטיבית אפטטיבית הרחה.

Abstract

בחלק הבא אנו מתארים את הפרטים מתודולוגיים של למידה אסוציאטיבית הרחת אפטטיבית בזחלי דרוזופילה. ההתקנה, בשילוב עם הפרעות גנטיות, מספקת ידית כדי לנתח את היסודות עצביים ומולקולריים של למידה במיוחד אסוציאטיבית במוח זחל פשוט.

אורגניזמים יכולים להשתמש בניסיון העבר כדי להתאים את התנהגותו בהווה. רכישה כזאת של פוטנציאל התנהגותי יכולה להיות מוגדרת כלמידה, ואת הבסיסים הפיסיים של פוטנציאלים אלה כעקבות זיכרון 1-4. חוקרי מוח מנסים להבין כיצד תהליכים אלה מאורגנים במונחים של שינויים מולקולריים ועצביים במוח על ידי שימוש במגוון של שיטות באורגניזם מודל הנע בין חרקים לבעלי חוליות 5,6. למאמצים אלה כדאי להשתמש במערכות מודל פשוט ונגישים באופן ניסיוני. זחל תסיסנית התברר כדי לספק דרישות אלה בהתבסס עלהזמינות של מבחנים התנהגותיים חזקים, קיומה של מגוון טכניקות מהונדסות והארגון היסודי של מערכת העצבים הכוללים רק כ -10,000 תאי עצב (אם כי עם ויתורים מסוימים: מגבלות קוגניטיביות, כמה אפשרויות התנהגות, ואת העושר של חוויה מפוקפקת) 7-10 .

זחלי תסיסנית יכולים להיוצר קשר בין ריחות וחיזוקים התעוררו אצל אפטטיבית כמו סוכר 11-14. בבדיקה סטנדרטית, שהוקם במעבדה של B. גרבר, בעלי חיים מקבלים הכשרה הדדית של שני ריח: קבוצה ראשונה של זחלים חשוף לריח יחד עם מחזקת התעוררה אצל (גמול סוכר) ולאחר מכן נחשפה לריח ב 'בלי חיזוקים 9. בינתיים קבוצה שנייה של זחלים מקבלת הכשרה הדדית תוך התנסות ריח בלי חיזוק, ולאחר מכן נחשף לריח B עם חיזוק (גמול סוכר). בשתי הקבוצות הבאות הן tesטד להעדפתם בין שני ריחות. העדפות גבוהות יחסית לריח המתוגמל משקפות למידה אסוציאטיבית - מוצג כמדד ביצועים (PI). המסקנה ביחס לאופי האסוציאטיבי של מדד ביצועים היא משכנעת, כי חוץ מהמגירה בין ריחות וtastants, פרמטרים אחרים, כגון ריח וחשיפת גמול, חלוף הזמן והטיפול אינו שונה בין שתי קבוצות 9.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנה

  1. זחלים פראיים מסוג דרוזופילה גדלים ב 25 ° C ו 60% לחות ב% -80 14/10 אור / חושך מחזור. לשליטה על הגיל המדויק של הזחלים תמיד 20 נקבות לשים עם 10 גברים לתוך בקבוקון 1 (6 סנטימטרי גובה וקוטר 2.5 סמ) הכולל כ 6 מ"ל של אוכל זבוב סטנדרטי. זבובים מותרים להטיל ביצים עבור 12 שעות ומועברים לבקבוקון חדש ביום השני. 5-6 ימים לאחר הטלת ביצי זחלים מגיעים לשלב 3 בהאכלת instar אם גדל ב 25 ° C וכעת ניתן להשתמש לצורך הניסוי התנהגותי. עם זאת, יש להבטיח לקחת זחלים שעדיין נמצאים במזון ולא הזחלים מהצד של הבקבוקון בלבד. זחלים אלה כבר הגיעו "שוטטות 3 rd instar במה" - זמן קצר לפני ההתגלמות - והשימוש שלהם מסבך את הפרשנות של התוצאות.
  2. הכנת מאכלי 2.5% agarose פטרי (מעבדות אחרות להשתמש בריכוזים אגרו של 1% גם לאורך הניסוי, כיצדריכוזים נמוכים אי פעם עשויים לאפשר האכלת זחלי -3 instar לחפור לתוך המצע): ממסים 2.5 הגר agarose ב100 המ"ל DDH 2 O. לחמם את הפתרון במיקרוגל עד שהוא מתחיל רותח. זהירות להתסיס את הפתרון ולהחזיר אותו למיקרוגל עד שכל agarose מתמוסס. יוצק את פתרון agarose החם למאכלים כאלה שתחתית צלחות פטרי מכוסית לגמרי ופתרון agarose יוצר משטח חלק פטרי. בואו הפתרון להתקרר לטמפרטורת חדר ולסגור את המכסים. אל תסגרו מייד את המכסים, משום שהיא תאפשר לעיבוי מים במכסים.
  3. הכנת מאכלי 2M פרוקטוז פטרי: ממס 2.5 הגר agarose ב100 מ"ל DDH 2 O (שוב, שימוש של 1% ריכוז אגר הוא אפשרי, אך זה עשוי לאפשר האכלת זחלי -3 instar לחפור לתוך המצע). לחמם את הפתרון במיקרוגל עד שהוא מתחיל רותח. זהירות להתסיס את הפתרון ולהחזיר אותו למייקרוגל עד שכל agarose מתמוסס. בזהירות להוסיף 35 גרם של פרוקטוז לפתרון החם; להתסיס את התערובת לאט עד שהסוכר נמס, כדי למנוע פיגור רותח. יוצק את התמיסה החמה פרוקטוז-agarose לתוך מנות כאלה שהתחתית מכוסית לגמרי ופתרון פרוקטוז-agarose יוצר משטח חלק פטרי. בואו הפתרון להתקרר לטמפרטורת חדר ולסגור את המכסים. אל תסגרו מייד את המכסים, משום שהיא תאפשר לעיבוי מים במכסים.
  4. הכנה של מכולות 1-octanol (אוקטובר) ריח: מלא 10 μl של אוקטובר הטהור למנהג עשה מכל ריח טפלון ולסגור אותו עם מכסה שיש כמה חורים קטנים כדי לאפשר לאידוי הריח. תיאור מפורט של המכולות ניתן בגרבר וסטוקר 2007. הכן שלושה מכליי ריח לאוקטובר מכולות ריח מאפשרות אידוי של הכימיקלים שהוכנסו, אך להימנע שזחלים יכולים לפנות אליהם ישירות. לפיכך, הניסויים פה תואר במפורשלהתייחס למידת הרחה בזחלים ללא תופעות לוואי מדאיג טעם.
  5. הכנה של מכולות amylacetate (AM) ריח: דלל AM 1:50 בשמן פרפין. מלא 10 μl של הדילול לתוך מכולת ריח טפלון תוצרת מותאמת אישית ולסגור אותו עם מכסה שיש כמה חורים קטנים כדי לאפשר לאידוי הריח. הכן שלושה מכליי ריח עבור AM. הדילול הוא חשוב מסיבות מעשיות, כלומר, כדי למנוע העדפה חזקה לריח אחד על הפנים השניים שעלול להסוות שינוי הלמידה תלויה בהעדפה היחסית בין שני ריחות. האטרקציה השווה לשני הריחות ייתכן שיהיה הצורך אשרה במעבדה לפני הניסוי על ידי יישום המבחן תאר מאוחר יותר (2.5) עם בעלי חיים תמימים. ערכים כאן מוצג מבוססים על מספר פרסומים של מעבדת גרבר שהתרבו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו 9,15,16.
  6. תיוג של צלחות פטרי: לפני הניסויים התנהגותיים כל צלחות פטרי צריכות להיות מקודדות. זה אומר שפרוקטוז המכיל צלחות פטרי צריך להיות מסומן למשל עם "X" או "" וagarose רק צלחות פטרי עם "Y" או "B". קוד זה אמור להיחשף לנסיין רק לאחר שכל הנתונים נרשמו כבר. על ידי ביצוע הניסויים "עיוור" הוא לכן לא ייתכן שהציפיות של הנסיין יכולות להשפיע על הביצועים של הזחלים. כדי להקל על הבנה לקהל הקוראים הרחבים בפעולות הבאות אנחנו נדבר רק על הריחות כגירויים מותנים (CS1 או CS2) שמתוגמלים גם כאשר הציגו בפרוקטוז צלחת פטרי (+) או שאינם מתוגמל, כשהציג בagarose בלבד צלחת פטרי (-).

2. הדרכה ומבחן זכה סוכר

  1. איסוף זחלי 30 האכלה 3 rd instar מבקבוקון מזון. להעביר אותם לצלחת פטרי ראשונה שמכילה כמה טיפין של מים ברז ולהעביר אותם בזהירות קדימה ואחורה עם מברשת. להעביר אותם לצלחת הפטר שמכיל 2 כמה טיפין של הרז ווא גםter כדי לבדוק ששום משחת אוכל נשארת על bodywall של הזחלים, אחרת זחלים יהיו מסוגלים לחוות את ריח האוכל במהלך הניסוי. זה מן הסתם לטשטש את תהליך למידה ואת הביצועים שלהם במצב המבחן.
  2. הדרכה: כדי להכשיר זחלים לריחות להתרועע עם מקל סוכר אפטטיבית המשטר הבא היא מיושמת. שים את מכל ריח אוקטובר בצד השמאל וימין של "X" מסומנים - כך, המכיל פרוקטוז גמול (+) צלחת פטרי (ניסוי "עיוור", לפירוט ראה 1.6). שים את הקבוצה של זחלי 30 האכלה 3 rd instar לאמצע צלחת פטרי, לסגור את המכסה ולהמתין 5 דקות בעוד בעלי החיים נחשפים לאוקטובר ודא שהזחלים לא נלכדו בתוך טיפת מים ויכולים להתגבר על מתח הפנים שלו. על ידי שזחלים יכול לעבור בחופשיות צלחת הפטר ולחוות גירויי ריח ו / או טעם.
  3. אימון: הסר את הזחלים מצלחת פטרי עם מברשת טבולה ולהעבירמ 'על צלחת פטרי 2 שכותרתו עם "Y" - וכך, agarose בלבד (-) המכילה צלחת פטרי - ויש לו ריח מיכל הבוקר ממוקם בצד ימני והשמאלי שלו. סגור את המכסה ולהמתין 5 דקות בעוד בעלי החיים נחשפים לבוקר.
  4. הדרכה: חזור על 2.2) ו -2.3) פעמים, באופן שכל 30 השלושה מחזורי אימון ניסיון הזחלים: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). בניסוי זה מייצג קודי CS1 CS2 אוקטובר ועבור AM.
  5. בדיקה: מקום אחד בבוקר וריח מכל 1 אוקטובר באתרים המנוגדים של צלחת פטרי agarose בלבד. העבר את החיות המאולפות לאמצע צלחת פטרי בדיקה. סגור את המכסה ולהמתין למשך 5 דקות. כתוצאה מכך לספור את מספר הזחלים בצד השמאל, בצד ימין של האמצע וצלחת פטרי בדיקה.
  6. חזור על שלבים 2.1) ל 2.5) עם קבוצה שנייה של זחלי 30 האכלה 3 rd instar אבל להחליף את התפקידים הניסיוניים של AM ואוקטובר כך שבעלי החיים מקבלים ההכשרה הבאה: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). בניסוי זה מייצג קודי CS1 CS2 אוקטובר ועבור AM.
  7. הסדרים אפשריים לאימונים. לעיל אנו מציגים אימונים שקיימים בשלושת ניסויי הדרכתו של מי מאוקטובר / (+) - AM / (-) או בקבוצה ההדדית של שלושה ניסויים גם הכשרה של AM / (+) - אוקטובר / (-). עם זאת, כדי למנוע תופעות רצף תלויות באימון חשוב לגוון את הרצף של הגירויים בחזרות הבאות של ניסוי המלא. על ידי שינוי סדר CS1 או CS2 וגם מצגת הפרס בצלחת הראשונה או שנייה שהוצגה, ארבעה רצפים שונים עבור ניסויי ההדרכה אפשריים:
קבוצה ראשונה CS1 / (+) - CS2 / (-) גומלין קבוצה CS2 / (+) - CS1 / (-)
CS1 / (-) - CS2 / (+) CS2 / (-) - CS1 / (+)
CS2 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-)
CS2 / (-) - CS1 / (+) CS1 / (-) - CS2 / (+)

כדי למנוע השפעות שיטתיות של גירויים בסביבה הניסויית שמסביב, יש לבצע את הבדיקה בחצי אחד מהמקרים כאלה שאוקטובר מוצג בצד השמאל ובבוקר ועד ימין. במחצית השנייה של המקרים בבוקר צריך להיות מוצג בצד השמאל ואוקטובר בצד ימין.

3. בדיקות ל-Task פקולטות רלוונטיות חושיות מוטוריות

העיצוב של הניסויים שתוארו לעיל מאפשר לניתוח למידת ריח סוכר בסוג הפראי האכלת זחלי 3 rd instar בכוחות עצמו. עם זאת, חוקרים במעבדת חיי היומיום בדרך כלל להשתמש שתיים או יותר קבוצות ניסוי שונות של זחלים כדי להשוות, אם למידת הרחה תלויה בנשימה אחתגן ticular, קבוצה מסוימת של תאי עצב, מניית מוטציה, דיאטת מזון מיוחדת, תנאי גידול שונים, כימיקלים רעילים נוסף במהלך פיתוח, וכו 'לכן, בכל המקרים, כאשר שתיים או יותר קבוצות ניסוי של זחלים נבדקות אחד יש לעשות סט של ניסויים שליטים חובה לבדוק, אם הקבוצות השונות של זחלים להראות חדות ראויות חושיות מוטוריות. זה הופך חובה כפנוטיפים פוטנציאליים אינם בהכרח בשל יכולות מופחתות או בוטלו לריחות לשייך סוכר. במקום זאת, ליקויי למידה פוטנציאליים יכולים להיות מבוססים על פגמים בכל שלב במעגל החושי המוטורי בעיבוד של ריחות ו / או סוכר. או במילים אחרות, אם זחל מוטציה אינו מסוגל סוכר מובן מסוים, הוא אינו יכול לקבוע את זכרון סוכר. אבל זה אינו מאפשר להגיע למסקנה שהזחל לא יכול ללמוד. בפירוט הניסויים השליטים הבאים צריכים להיעשות על מנת לבדוק לאוקטובר נכון, AM ועיבוד של פרוקטוז זחלים מהונדסים.

1. מבחן לאוקטובר prefe נאיבילורנס

איסוף זחלי 30 האכלה 3 rd instar מבקבוקון מזון. לשטוף אותם היטב במים ברז, כמתואר ב2.1. שים את מכל ריח אוקטובר בודד בצד אחד של צלחת פטרי agarose, הוסף את הזחלים לאמצע צלחת פטרי, לסגור את המכסה ולהמתין 5 דקות, כך שהזחלים יכולים לזחול על צלחת הפטר ולכוון לכיוון אוקטובר מקור ריח. כתוצאה מכך לספור את מספר הזחלים בצד השמאל, באמצע ובצד ימין של צלחת פטרי בדיקה.

2. מבחן להעדפה שאני נאיבית

איסוף זחלי 30 האכלה 3 rd instar מבקבוקון מזון. לשטוף אותם היטב במים ברז, כמתואר ב2.1. שים את מכל ריח AM בודד בצד אחד של צלחת פטרי agarose, הוסף את הזחלים לאמצע צלחת פטרי, לסגור את המכסה ולהמתין 5 דקות, כך שהזחלים יכולים לזחול על צלחת הפטר ולכוון לכיוון AM מקור ריח. כתוצאה מכך לספור את מספר larvae בצד השמאל, באמצע ובצד ימין של צלחת פטרי בדיקה.

3. מבחן להעדפת סוכר נאיבית

איסוף זחלי 30 האכלה 3 rd instar מבקבוקון מזון. לשטוף אותם היטב במים ברז, כמתואר ב2.1. הכן את צלחות פטרי המכילות 2.5% agarose במחצית ותערובת פרוקטוז-agarose 2M במחצית השנייה. הוסף זחלים על צלחת פטרי, לסגור את המכסה ולהמתין 5 דקות, כך שהזחלים יכולים לזחול על צלחת הפטר ולכוון לעבר הצד המכיל פרוקטוז. כתוצאה מכך לספור את מספר הזחלים בצד השמאל, באמצע ובצד ימין של צלחת פטרי בדיקה.

הכנה של צלחות פטרי חצי חצי: הכן את צלחות agarose רגילות כפי שתואר לעיל בסעיף 1.2. כאשר agarose צלחות פטרי המלא הם התקררו, לחתוך agarose בקפידה לאורך הציר האנכי עם אזמל. הסר מחצית agarose מצלחת פטרי.dd פתרון חם פרוקטוז-agarose (להכנה ראה 1.3) למחצית הריקה של צלחת פטרי. היזהר ששני החצאים תואמים ואינם מהווים קצה מוגדר - זה משפיע על התנהגות בחירת הזחל והופך את ניתוח די קשה התנהגותי 4..

שאם אימונים

למרות בדיקות אם האכלת זחלים מהונדסים 3 rd instar מסוגלים להבחין ברמת סוג פרועה בין אוקטובר ואוויר (3.1), בבוקר ובאוויר (3.2) וסוכר והטהור agarose (3.3), סדרה נוספת של ניסויי בדיקה באחרונה הציג (לדיון לראות גרבר וסטוקר, 2007). הרציונל לניסויים אלה הוא הבאים. במהלך אימון הזחלים לעבור טיפול מסיבי וריח וסוכר ברציפות גירוי. לכן, זה גם אפשרי כי הפנוטיפ הלמידה הנצפה מטעה (אם כי ריח נאיבי ובדיקות סוכר תפיסה הם ברמת סוג פראית!). ואכן, זה אפשרי שבעלי החיים המהונדסים דiffer מזחלי סוג פראיים ביחס להתנגדות ללחץ, מוטיבציה, הסתגלות עייפות, חושית, למידת קשר, ושינויים בתחושת שובע. לפיכך, מיכלס et al. (2005) הציג פקדים שיבדקו אם מוטציה מסוימת היא מסוגלת (1) לזהות AM לעומת מכל ריח ריק אם אתה מתייחס זחלים בדיוק כפי במהלך אימון פרט לכך שאתה משמיט את השכר ורק לחשוף לשניהם ריחות; (2) לזהות אוקטובר אחריו המשטר; (3) לזהות AM לעומת מכל ריח ריק, אם מטפל ברימות בדרך הכשרה דמוית חוץ מזה שאתה משמיט את הריחות ורק לחשוף לפרס; ו( 4 ) לזהות אוקטובר לאחר אותו המשטר. לדיון מקיף ופרטים נוספים על השיטות עיינו מיכלס ואח' (2005) וגרבר וסטוקר (2007).

4. ניתוח נתונים ללמידה זכה סוכר

  1. כדי להעריך את הנתונים של פרוטוקול למידת גמול הסוכר לחשב מדד העדפת אוקטובר (PREF אוקטובר) לכל אחת משני reciproקבוצות אומנו קאלי:
    לקבוצה הראשונה שקבלה אוקטובר / (+) - AM / (-) אימון:
    PREF אוקטובר (אוקטובר + /-AM) = (# של זחלים בצד אוקטובר - # של זחלים בצד בבוקר) / # של כל הרימות בתוך שמאל, ימין ואמצע האזורים
    לקבוצה השנייה, שקבלה בבוקר / (+) - אוקטובר / (-) אימון:
    PREF בבוקר (בבוקר + /-אוקטובר) = (# של זחלים בצד AM - # של זחלים בצד אוקטובר) / # של כל הרימות בתוך שמאל, ימין ואמצע האזורים
  1. חישוב מדד ביצועים (PI) לשני ערכי Pref מ4.1). PI מייצג למידה אסוציאטיבית ידי מבטל את התופעות מדאיגות של ריח וחשיפת עונש, חלוף הזמן וטיפול:
    PI = (PREF אוקטובר (אוקטובר + / AM) + PREF בבוקר (בבוקר + / אוקטובר)) / 2
    לכן חוקרים פרטיים יכולים לנוע מ -1 עד 1. ערכים שליליים משמעותי מרתיעים מייצגים למידה, ואילו ערכים חיוביים משמעותי לתאר למידת אפטטיבית. ניסוי מלא בדרך כלל כולל של 10 או יותר חוקרים פרטיים. נתונים הם דמיינו כincludin חלקות התיבהגרמתי כל הערכים של קבוצת ניסוי ניתן. 50% מהערכים שממוקמים בתוך התיבה; מדד ביצועי חציון מצוין כקו מודגש בתוך עלילת התיבה.

5. ניתוח נתונים עבור משימות פקולטות רלוונטיות חושיות מוטוריות

  1. כדי להעריך את הנתונים בעת בדיקה לעיבוד ריח אוקטובר הנכון לחשב מדד העדפת ריח אוקטובר כדלקמן:
    ריח PREF אוקטובר = (# של זחלים בצד אוקטובר - # של זחלים בצד השני) / # של כל הרימות בתוך שמאל, ימין ואמצע האזורים
  2. כדי להעריך את הנתונים בעת בדיקה לתפיסת ריח בבוקר נכון לחשב מדד העדפת ריח AM כדלקמן:
    ריח PREF AM = (# של זחלים בצד AM - # של זחלים בצד השני) / # של כל הרימות בתוך שמאל, ימין ואמצע האזורים
  3. כדי להעריך את הנתונים בעת בדיקה לתפיסת פרוקטוז נכונה לחשב מדד העדפת פרוקטוז כדלקמן:
    PREF פרוקטוז = (# של זחלים בצד פרוקטוז - # של זחלים בצד השני) / # של כל הרימות בתוך שמאל, ימין ואמצע האזורים
  4. פרטים עבור אימון הדמה ניתנים במיכלס et al. 2005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

האיור 1 א מציג סקירה של הפרוצדורות ללמידה אסוציאטיבית הרחת זחל. על ידי זיווג אחד משני הריחות שהוצגו עם זחלי גמול סוכר לרכוש את התנהגות הפוטנציאל להביע תגובה אטרקטיבית לכיוון הריח המתוגמל בהשוואה לריח סתם ככה. שתי קבוצות של זחלים תמיד מאומנות על ידי זיווג המחזקת עם הריח אוקטובר או בבוקר או. מדד הביצועים (PI) מודד את התפקוד האסוציאטיבי כהבדל בהעדפה בין הקבוצות הדדיות המאומנות.

במקרה פונקציה אסוציאטיבית הוא נתח בזחלים מהונדסים, מבחנים ליכולת בסיסית חושית מוטורית נדרשים. הדבר נעשה על ידי המציע להם את הבחירה בין מכל ואוויר ריח מלא או בין הטהור agarose וagarose תוספת סוכר. (אימון שאם לא מוצג כאן). החלוקה הסופית של הזחלים תצוין בגיליון נתונים ספציפי (איור 2) ומולualized כמזימת תיבה (איור 3). תוצאות חיוביות מצביעות על התנהגות בחירה אטרקטיבית עבור מדדי הבכורה ולמידת אפטטיבית במקרה של מדדי ביצועים. ערכים שליליים מצביעים על התנהגות בחירה מרתיעה עבור מדדי ההעדפה המחושבת ומרתיעים את הלמידה במקרה של מדדי ביצועים.

איור 1
איור 1. תכנית של הניסויים התנהגותיים למדוד למידה אסוציאטיבית זחל חוש ריח, חוש ריח העדפות נאיביות והעדפות התעוררו אצל תמימות.

  1. זחלי 30 תסיסנית האכלת 3 rd instar מונחים במשך חמש דקות על צלחת הפטר שמכיל agarose גמול סוכר של פרוקטוז 2M. במקביל ריח ראשון ספק בטפלון המכלs (אוקטובר). לכן זחלים יכולים לקשר גירוי עם ריח מחזקת חיובית בשלב האימון הראשון. , הזחלים הבאים מועברים לצלחת פטרי 2 agarose ללא מחזקת אבל עם הריח השני (בבוקר) לשוב 5 דקות. האימון חוזר על עצמו שלוש פעמים. לבסוף, במצב מבחן העדפת הריח של הזחלים נמדדת לריח המתוגמל נגד הריח שאינם מתוגמל על צלחת פטרי agarose. זה מאפשר חישוב של מדד עדיפות הראשון (PREF). קבוצה שנייה של זחלים הוא אימן באופן דומה באופן הדדי. הנה, מדד עדיפות שני (PREF) יכול להיות מחושב. לבסוף מדד ביצועים (PI) מחושב לפי ממוצע שני מדדי בכורה. למידע נוסף לגבי הרצף של הניסויים ראו גם 2.7.
  2. לניתוח העדפת הריח הנאיבית, מכל ריח אחת מלא או אוקטובר או שאני ממוקם בצד אחד של צלחת פטרי טהורה agarose. האכלת זחלים 30 3 rd instar הם PLACED באמצע צלחת הפטר ולאחר 5 דקות ההפצה של הזחלים על צלחת פטרי נספרת. מהנתונים שהתקבלו ראשי העדפת הרחה (PREF) לאחר מכן, מחושב.
  3. לניתוח פרוקטוז 2M הנאיבי התעורר אצל ההעדפה מלא במחצית מצלחת הפטר שמכילה הטהור agarose על צידו השני. זחלי 30 האכלה 3 rd instar ממוקמים באמצע צלחת הפטר ולאחר 5 דקות ההפצה של הזחלים על צלחת פטרי נספרת. מהנתונים שהתקבלו אינדקס העדפות התעורר אצל (PREF) לאחר מכן, מחושב.

איור 2
איור 2. דוגמה לגיליון נתונים גולמי לרישום ועיבוד נתונים המתקבלים ל) למידת גמול סוכר, B) נאיביהעדפות ריח וC) העדפות התעוררו אצל תמימות. לכל הניסויים במספר הזחלים בצד השמאל, באמצע ובצד ימין של צלחות פטרי מצוין. מתוך מדדי בכורה במידע זה (PREF) מחושבים. למידת זחל מתוארת כמדדי ביצועים (PI), הנובעים מcomputating את prefs של שתי קבוצות אומנו הדדי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. נתונים להדמית דוגמה להושגה) למידת סוכר גמול, B) העדפות ריח נאיביות וC) העדפות התעוררו אצל תמימות. Boxplots לייצג נתונים כדלקמן: חציון ( קו מודגש בתוך תיבה); התיבה מציינת 50% מכלל נקודתי הנתונים אילו זיף העליון ותחתון מייצג את 25% האחרים כל אחד. לכן, ללא חריגות בערכי המינימום ומקסימום מסומנים על ידי גבולות השפם. חריגים מצטיירים כעיגולים קטנים הם מוגדרים ככל נקודה יותר מפי 1.5 ממגוון הרבעונים 1 ו 3 רבעונים. ניתוח סטטיסטי של נקודתי נתונים בודדות נעשה עם מבחן Wilcoxon-דרגה נחתמה, ואילו מבחן סכום דרגת Wilcoxon משמש להשוואה בין שתי קבוצות נתונים. רמות משמעות מסומנות כns עבור p> 0.05, * לp <0.05, ** לp <<0.01 או *** לp = 0.001. גודל מדגם של כל ניסוי: N = 15.

לניסויים בלמידה) תמיד שני מדדי בכורה (PREF) של ניסויי גומלין נלקחים לחישוב מדד הביצוע הסופי (PI). מדדי ביצועים (PI) מצטיירים כעלילות תיבה בהתאם.

= "תמיד"> איור 4
איור 4. דוגמאות לGAL4 שורות כל אחת מהן תוויות סדרה ספציפית של תאים בתוך מוח הזחל. תמיד Z-תחזיות מלאות של נופים קדמיים של מוח הזחל מוצגות. קבוצות ספציפיות של הנוירונים מסומנות על ידי חלבון פלואורסצנטי אנטי ירוק (ירוק) במערכת עצבים מרכזי הזחל השלמה כי הוא דמיין ידי doublestaining anti-FasII/anti-ChAT (מגנט).) NP225 תוויות קבועות של תאי עצב הרחה מסדר השנייה, הנקרא היטל הנוירונים (חץ) וB מערכת פיתוח המבוגר החזותי (ראש החץ).) NP2426 סימני קבוצה של interneurons ריח (חץ) בתחנת ממסר ההרחה הראשונה, שנקראו אונת המחושים. C) GR66a מתייג קבוצה של תאי עצב תחושתיים שהתעוררו אצל באופן בלעדי פרויקט מאברי חישה התעוררו אצל היקפיים לגנגליון subeosophageal (חץ). ד) NP3128 תוויות כמה סטים של סוגים שונים של תאי עצב. החץ מסמן interneurons ריח של אונת מחושים דומה ל-B מדגיש ראש חץ קבוצה של נוירונים דופאמין שמשליך על אזור neuropil נקרא גוף פטרייה. ה) h24 סימני קבוצה של תאי גוף פטריות קניון (חץ), שבו נוירונים המוצגים להיות הכרחי ללמידת הרחת זחל. F) NP7493 הוא דוגמה לדפוס ביטוי נוקב יחסית שכוללת מספר קבוצות של נוירונים מתפתחים (חיצים) שיהיה עוד יותר לבדל במהלך המטמורפוזה צורת המוח של הזבוב. ברי קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איור 5
איור 5. סקירה מסכמת ניסיונות מוצלחים ללמוד למידה אסוציאטיבית בDזחלי rosophila. גירויי ריח, כמו גם אור יכולים לשמש כגירוי מותנה להיות מזוהים גם עם שכר או עונש (גירוי בלתי מותנה). גירויים מתגמלים כוללים סוכר וריכוזים נמוכים של מלח; גירויי ענישה מהווים ריכוזים גבוהים של מלח, כינין, הלם חשמלי, חום, גירוי מכאני באמצעות רטט (באז) ואור 11,12,17-24. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

GAL4 / כטב"מ בונה משמש לעתים קרובות במעבדה שלנו
נוטריקון חלבון פונקציה ספרות
ראיה
כטב"מ-GFP mCD8 :: חלבון פלואורסצנטי ירוק membRANE סמן Lee et al., 1999
כטב"מ-n-syb :: GFP חלבון פלואורסצנטי ירוק סמן presynaptic איטו et al., 1998
כטב"מ-GFP Dscam17.1 :: חלבון פלואורסצנטי ירוק סמן postsynaptic וואנג et al., 2004
כטב"מ-GFP NLS :: חלבון פלואורסצנטי ירוק סמן גוף תא רוברטסון et al., 2003
התערבות באיתות עצבית
כטב"מ-התחבא פוף הראש פגום גורם אפופטוזיס ג'ואו et al., 1997
כטב"מ-RPR קוצר גורם אפופטוזיס ג'ואו et al., 1997
כטב"מ ש.י. ts דומיננטי שלילי dynamin vesicl לוקיםדואר מחזור קיטמוטו, 2001
כטב"מ-Kir.2.1 :: EGFP בתוך תוך תיקון K + הערוץ לא שלילת קוטביות הממברנה יינס et al., 2001
כטב"מ-TRPA1 ערוץ קטיון טמפרטורת הפעלה תלויה רוזנצוויג et al., 2005
כטב"מ-ChR2 Channelrhodopsin הפעלה תלויה אור Schroll et al., 2006

טבלת 1. מבני מפעיל כטב"מ המשמשים לעתים קרובות במעבדה כדי להמחיש את האנטומיה העצבית ולטפל הולכה סינפטית 25-33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההתקנה המתוארת בזחלי תסיסנית מאפשרת חקירה של למידת הרחה אסוציאטיבית בתוך מוח comparably יסודי. הגישה היא פשוטה, זולה, קלה להקמה במעבדה ואינה דורשת ציוד מתוחכם 9. אנחנו מציגים גרסה של הניסוי, כדי ללמוד למידה אסוציאטיבית אפטטיבית חיזוק גמול פרוקטוז 11. ההתקנה המתוארת מתבססת על שורה של מחקרים שחקרו צדי וריאציות במספר ניסויי הדרכה, assay אחת לעומת מסת assay, זמן שמירה, ריחות ומשמשים ריכוזי ריח ומגדר 9,15,34,35 מקיפים. לכן, הגדרת ההתנהגות המתוארת משלבת את המידע הזה בגישה יוצאת דופן לשחזור ללמוד פונקציות מוח גבוהות בדרוזופילה. סופו של דבר, המבוסס על ההגדרה הפשוטה שלו ההשפעה לתגמל או להעניש בכל חומר dissoluble ניתן לבדוק בקלות עם assay זה.

ve_content "> כמו כן, מספר גרסות של הפרדיגמה פורסמו לאחרונה המאפשרות החקירה של למידה אסוציאטיבית חזותית בזחלי 23,36 (הוקם בגרבר ואח' (2004).); והלם חשמלי, אור, חום, או כינין תנודות גם יושמו בהצלחה כחיזוקים אברסיביים ללמידה אסוציאטיבית 9,17,19-21,37-40 הרחה. כך, מערך מקיף של מערכים ניסיוניים קיים כדי לנתח את הבסיס התנהגותי, עצבי ומולקולרי של למידה וזיכרון בזחלי דרוזופילה ( איור 5) 13,14,41,42. כאן, אנו מתמקדים באופן בלעדי על ריח פרוקטוז למידה בשל החוסן של assay ומדדי ביצועים הגבוהים יחסית שניתן להשיג. במיוחד חלק מהגרסות אברסיביים להוביל להתנהגות קטנה בלבד שינויים. זה מגביל במידה מסוימת את היישום של השיטה, מלבד בעיות התפתחותיות של הבעלים החיים הנמצאים במחקרים ארוך טווח זחלזיכרון לא בלתי אפשרי.

המוח מורכב מהזחל רק כ -10,000 נוירונים בשלמותו. כך בשל הארגון יחסי פשוט (במונחים של מספרים) הוא גם נגיש להפרעות גנטיות, אשר בתורו מאפשרת ללימודים מתקדמים על בסיס המולקולרי ועצבי של למידה וזיכרון. במיוחד את מערכות GAL4/UAS והשינויים האחרונים שלה לאפשר למניפולציה הגנטית של קבוצות מוגדרות של תאי עצב ועד אפילו תאים בודדים באופן זמני spatio (איור 4) 7,10. הנני סדרה מקיפה של קווי מפעיל מציעה את האפשרות לדמיין אלה קבוצות מוגדרות של תאי עצב (איור 4) 25,43 או לחלופין לתמרן הפלט העצבי שלהם (טבלה 1). לרוב גני המפעיל מיושמים שתא אוטונומי יכול לגרום למוות של תאים או לעכב העברה עצבית 29,30,33. לאחרונה פותחו טכנולוגיות שאלנמוך להפעלה מלאכותית מבוקרת של תאי עצב המונעים על ידי אור או חום (טבלה 1) 31,32,44.

לסיכום, שילוב של דרכים מתוחכמות של הפרעות גנטיות והניסויים התנהגותיים כאן המתוארים מאפשר לחשוף את הבסיס העצבי, מולקולרי והתנהגותיות של למידה וזיכרון במוח היסודי של זחלי דרוזופילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לאנשי מעבדת גרבר להוראות טכניות בהתקנה וההערות על כתב היד של הניסוי שלהם. אנו מודים גם ליובוב Pankevych לטיפול זבוב ותחזוקה של מניית קנטונים הסוג הפראית. עבודה זו נתמכת על ידי DFG מענק TH1584/1-1, SNF 31003A_132812 המענק / 1 וZukunftskolleg של אוניברסיטת קונסטנץ (כל לAST).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fructose Sigma 47740 57-48-7
NaCl Fluka 71350 7647-14-5
Agarose Sigma A5093 9012-36-6
1-octanol Sigma 12012 111-87-5
Amylacetate Sigma 46022 628-63-7
Paraffin oil Sigma 18512 8012-95-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
  2. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
  3. Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
  4. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
  5. Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
  6. Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
  7. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  8. Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
  9. Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
  10. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  11. Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
  12. Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
  13. Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
  14. Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
  15. Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
  16. Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
  17. Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
  18. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
  19. Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
  20. Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
  21. Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
  22. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
  23. Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
  24. Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. (2012).
  25. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
  26. Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
  27. Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
  28. Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
  29. Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
  30. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  31. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  32. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  33. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  34. Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
  35. Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
  36. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. (2011).
  37. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
  38. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
  39. Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
  40. Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
  41. Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
  42. Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
  43. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
  44. Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).More

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter