Summary
Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l'analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.
Abstract
Nel seguito sono descritti i dettagli metodologici appetitiva apprendimento associativo olfattivo nelle larve Drosophila. La configurazione, in combinazione con interferenza genetica, fornisce una maniglia per analizzare i fondamenti neuronali e molecolari di apprendimento specificamente associativo in un cervello semplice larvale.
I microrganismi possono utilizzare l'esperienza passata per regolare il comportamento presente. Tale acquisizione del potenziale comportamentale può essere definito come l'apprendimento, e le basi fisiche di questi potenziali come tracce di memoria 1-4. I neuroscienziati cercare di capire come questi processi sono organizzati in termini di cambiamenti molecolari e neuronali nel cervello, utilizzando una varietà di metodi in organismi modello che vanno dagli insetti ai vertebrati 5,6. Per tali sforzi, è utile usare sistemi di modelli che sono semplici e accessibili sperimentalmente. La larva Drosophila è rivelato soddisfare queste richieste basate sula disponibilità di solidi saggi comportamentali, l'esistenza di una varietà di tecniche transgeniche e l'organizzazione elementare del sistema nervoso che comprende solo circa 10.000 neuroni (anche se con qualche concessione: limitazioni cognitive, poche opzioni comportamentali, e la ricchezza di esperienza discutibile) 7-10 .
Larve di Drosophila possono formare associazioni tra odori e appetitiva rinforzo gustativa come lo zucchero 11-14. In un saggio standard, stabilita nel laboratorio di Gerber B., gli animali ricevono due odore formazione reciproca: Un primo gruppo di larve è esposto ad un odore Un insieme ad un rinforzo gustativo (ricompensa zucchero) e viene successivamente esposto ad un odore B senza armatura 9. Nel frattempo, un secondo gruppo di larve riceve una formazione reciproca, mentre vivendo un odore senza armatura e, successivamente, di essere esposti a B odore con rinforzo (premio zucchero). In seguito entrambi i gruppi sono testa per la loro preferenza tra i due odori. Preferenze relativamente più elevati per l'odore premiato riflettere apprendimento associativo - presentato come un indice di prestazione (PI). La conclusione in merito alla natura associativa dell'indice di prestazione è convincente, perché a parte la contingenza tra odori e sostanze sapide, altri parametri, come ad esempio l'odore e l'esposizione ricompensa, passare del tempo e la gestione non differiscono tra i due gruppi di 9.
Protocol
1. Preparazione
- Drosophila wild-type larve vengono sollevate a 25 ° C e 60% -80% di umidità in un ciclo di 14/10 chiaro / scuro. Per controllare l'età esatta delle larve sempre 20 femmine sono messi con 10 maschi in un flaconcino (6 cm di altezza e 2,5 cm di diametro) che include circa 6 ml di cibo mosca standard. Le mosche possono deporre le uova per 12 ore e sono trasferiti in un nuovo flaconcino il secondo giorno. 5-6 giorni dopo la deposizione delle uova larve raggiungere l'alimentazione 3 ° fase instar se sollevato a 25 ° C e può essere utilizzata per l'esperimento comportamentale. Tuttavia, si deve assicurare prendere solo larve che sono ancora in cibo non e le larve dal lato del flaconcino. Queste larve hanno già raggiunto il "vagabondaggio 3 ° fase instar" - poco prima impupamento - e il loro impiego complica l'interpretazione dei risultati.
- Preparazione del 2,5% agarosio capsule di Petri (altri laboratori utilizzare anche le concentrazioni di agar all'1% per tutto l'esperimento, comeconcentrazioni sempre più basse possono consentire l'alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato): Sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nel forno a microonde fino a quando tutti agarosio è sciolto. Versare la soluzione calda di agarosio in piastre Petri tali che il fondo delle piastre di Petri è completamente coperto e la soluzione di agarosio forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi.
- Preparazione di 2M fruttosio piastre di Petri: sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O (ancora una volta, l'uso della concentrazione di agar 1% è possibile, ma può autorizzare l'alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato). Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nella microonda finché tutto agarosio è sciolto. Aggiungere con cautela 35 g di fruttosio nella soluzione calda, lentamente agitare la miscela fino a quando lo zucchero è sciolto per evitare ritardo ebollizione. Versare il fruttosio hot-agarosio soluzione in piastre Petri tali che il fondo è completamente coperto e il fruttosio-agarosio soluzione forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi.
- Preparazione di 1-ottanolo (OCT) contenitori odore: riempire 10 ml di puro ottobre in un contenitore su misura odore teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l'evaporazione dell'odore. Una descrizione dettagliata dei contenitori viene dato in Gerber e Stocker 2007. Preparare tre contenitori odore di ottobre Contenitori odore consentire l'evaporazione delle sostanze chimiche inseriti, ma evitare che le larve possono contattare direttamente loro. Pertanto, gli esperimenti qui descritti specificamenteaffrontare l'apprendimento olfattivo nelle larve senza perturbare effetti collaterali gustative.
- Preparazione di Amilacetato (AM) contenitori odore: Diluire AM 1:50 in olio di paraffina. Riempire 10 ml di diluizione in un contenitore personalizzato fatto odore Teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l'evaporazione dell'odore. Preparare tre contenitori odore per AM. La diluizione è importante per ragioni pratiche, ossia evitare una forte preferenza per uno sopra l'altro odore che può mascherare un apprendimento dipendente dalla variazione nella preferenza relativa tra i due odori. L'attrazione uguale per entrambi gli odori possono devono essere confermati in laboratorio prima che l'esperimento applicando il test in seguito descritto (2.5) con gli animali naïve. Il valori qui presentati si basano su varie pubblicazioni del laboratorio di Gerber che sono stati recentemente riprodotti dal nostro laboratorio 9,15,16.
- Etichettatura delle piastre di Petri: prima gli esperimenti comportamentali tutte le piastre di Petri devono essere codificati. Ciò significa chefruttosio contenente piastre di Petri devono essere contrassegnati, ad esempio con una "X" oppure un "A" e agarosio solo piastre di Petri con una "Y" o "B". Questo codice deve essere rivelato al sperimentatore solo dopo che tutti i dati siano stati registrati. Eseguendo gli esperimenti "cieco" non è dunque possibile che le aspettative del sperimentatore può influire sulle prestazioni delle larve. Per facilitare la comprensione per i lettori ampio seguito si parla solo gli odori come stimoli condizionati (CS1 e CS2), che siano ricompensati quando viene presentato su un piatto Petri fruttosio (+) o non-premiata quando ha presentato su un solo agarosio Petri (-).
2. Zucchero Training Ricompensa e Test
- Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Trasferirli ad un primo piatto Petri contenente alcune gocce di acqua di rubinetto e con cura muoversi avanti e indietro con un pennello. Trasferimento ad un secondo piatto di Petri che contiene anche alcune gocce di rubinetto water per controllare che non pasta alimentare rimane sul bodywall delle larve, altrimenti le larve sarebbe in grado di provare l'odore cibo durante l'esperimento. Ciò probabilmente oscurare il processo di apprendimento e le loro prestazioni in situazione di test.
- Formazione: Formare larve di odori associati con una stecca di zucchero appetitivo il seguente regime viene applicato. Posizionare un contenitore odore ottobre sul lato sinistro e destro di una "X" segnato - in tal modo, ricompensa contenente fruttosio (+) Petri (esperimento "cieca", per i dettagli vedere 1.6). Posizionare il gruppo di alimentazione 30 3 rd larve instar sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a ottobre Assicurarsi che le larve non sono intrappolati all'interno della goccia d'acqua e può superare la tensione superficiale di esso. Con che le larve possono muoversi liberamente sulla piastra di Petri e sperimentare stimoli olfattivi e / o gustativa.
- Formazione: Rimuovere le larve dalla piastra di Petri con un pennello inumidito e trasferire ilm su un secondo piatto Petri che è etichettato con una "Y" - quindi, solo agarosio (-) contenente piastra Petri - e ha un contenitore AM odore situato sul lato sinistro e destro. Chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a AM.
- Formazione: Ripeti 2.2) e 2.3) per due volte, in modo tale che tutte le larve di 30 Esperienza tre cicli di formazione: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM.
- Test: Un posto AM e un contenitore odore ottobre sui siti opposti di un agarosio sola piastra di Petri. Trasferire gli animali addestrati al centro del piatto di prova Petri. Chiudere il coperchio ed attendere 5 min. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, il lato destro e centrale del piatto di prova Petri.
- Ripetere i passaggi da 2.1) a 2.5) con un secondo gruppo di 30 di alimentazione 3 ° larve instar ma scambiare i ruoli sperimentali di AM e PTOM, in modo tale che gli animali ricevano la formazione seguente: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM.
- Modalità possibili per la formazione. Sopra vi presentiamo una formazione che esiste di tre studi di formazione di entrambi OCT / (+) - AM / (-) o nel gruppo di reciproca anche tre prove di formazione di AM / (+) - Ottobre / (-). Tuttavia, per evitare effetti sequenza dipendente durante la formazione è importante variare la sequenza degli stimoli in ripetizioni seguenti dell'esperimento completo. Variando l'ordine CS1 o CS2 e anche la presentazione ricompensa nella prima piastra o secondo presentato, quattro sequenze diverse per i processi di formazione sono possibili:
| Primo gruppo | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Reciproco gruppo | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
Per evitare effetti sistematici di stimoli nell'ambiente circostante sperimentale, si dovrebbe effettuare la prova in una metà dei casi che ottobre viene presentato sulla sinistra e sulla destra AM. Nell'altra metà dei casi AM devono essere presentati sulla sinistra e sulla destra ottobre.
3. I test per attività rilevanti per senso-motorie Facoltà
La progettazione di esperimenti sopra descritti consente l'analisi di odori zucchero apprendimento nel tipo selvatico alimentazione 3 ° larve instar da solo. Tuttavia, nella vita quotidiana ricercatori laboratorio solito usano due o più differenti gruppi sperimentali di larve di confrontare, se l'apprendimento olfattivo dipende da una pargene colare, un insieme specifico di neuroni, uno stock mutante, una dieta speciale, diverse condizioni di allevamento, prodotti chimici tossici aggiunto durante lo sviluppo, ecc Così, in tutti i casi in cui due o più gruppi sperimentali di larve vengono testati si deve fare una serie di esperimenti di controllo obbligatorie per verificare, se i diversi gruppi di larve mostrano proprie senso-motorie acuità. Questo diventa obbligatorio come fenotipi potenziali non sono necessariamente a causa di capacità ridotta o abolita per gli odori associati con lo zucchero. Piuttosto, i potenziali difetti di apprendimento potrebbe essere basato su difetti in ogni fase del circuito senso-motorio nella lavorazione di odori e / o zucchero. O in altre parole, se una larva mutante non è in grado di zucchero senso, non è possibile stabilire una memoria zucchero. Ma questo non consente di concludere che la larva non può imparare. In particolare i seguenti esperimenti di controllo devono essere fatte per testare il corretto PTOM, AM e la trasformazione di fruttosio di larve transgeniche.
1. Test per ingenuo ottobre preferiscarenza
Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un contenitore odore ottobre su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l'ottobre odore sorgente. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.
2. Test per ingenuo preferenza AM
Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un odore AM contenitore su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l'AM odore sorgente. Successivamente contare il numero di larvae sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.
3. Test per la preferenza zucchero ingenuo
Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Preparare piatti Petri contenenti 2,5% agarosio in una metà e una 2M fruttosio-agarosio miscela nell'altra metà. Aggiungere le larve sul piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso il lato contenente fruttosio. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.
Preparazione di mezzo mezzo piastre di Petri: Preparare normali piastre di agarosio come descritto in precedenza nella sezione 1.2. Quando i pieni agarosio piastre Petri sono raffreddati, tagliare l'agarosio lungo l'asse verticale con un bisturi. Rimuovere una metà del agarosio dalla piastra Petri. Ladd un hot-fruttosio agarosio soluzione (per la preparazione cfr 1,3) al mezzo vuoto della piastra Petri. Fare attenzione che entrambe le metà partita e non formano un bordo definito - questo influisce sul comportamento larvale scelta e rende l'analisi del comportamento piuttosto difficile. 4.
Sham formazione
Nonostante il test se l'alimentazione transgenica 3 ° instar larve sono in grado di distinguere con un livello di selvaggia tra ottobre e aria (3.1), AM e aria (3.2) e lo zucchero e puro agarosio (3.3), un ulteriore set di esperimenti di prova è stato recentemente introdotto (per la discussione cfr. Gerber e Stocker, 2007). Il razionale di questi esperimenti è il seguente. Durante la formazione larve subiscono manipolazione massiccia e odore successive e zucchero stimolazione. Così, è ben possibile che il fenotipo osservato apprendimento è fuorviante (anche se l'odore ingenuo e prove percezione zucchero sono con un livello selvaggio!). Infatti, è possibile che gli animali transgenici differ da larve wild type rispetto alla resistenza allo stress, la motivazione, la fatica, adattamento sensoriale, l'apprendimento contestuale, e cambiamenti di sazietà. Così, Michels et al. (2005) ha introdotto controlli che verificare se un mutante dato è in grado di rilevare (1) AM rispetto a un contenitore vuoto odore se si trattano le larve esattamente come durante l'allenamento, tranne che si omette il premio e solo esporre sia odori, (2) rilevare ottobre dopo che il regime stesso, (3) rilevano AM contro un contenitore vuoto odore, se si trattano le larve in una formazione simile modo a meno che si omette gli odori e semplicemente esporre la ricompensa, e (4 ) rilevano ottobre dopo lo stesso dosaggio. Per una discussione completa e ulteriori dettagli sui metodi di vedere Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007).
4. Analisi dei dati per l'apprendimento di zucchero Ricompensa
- Per valutare i dati del protocollo di apprendimento zucchero ricompensa calcolare un indice di preferenza OCT (PREF OCT) per ciascuno dei due reciprocitàgruppi automaticamente formati:
Per il primo gruppo che ha ricevuto OCT / (+) - AM / (-) formazione:
PREF OCT (OCT + / AM-) = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato AM) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
Per il secondo gruppo che ha ricevuto AM / (+) - Ottobre / (-) formazione:
PREF AM (AM + / OCT-) = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato ottobre) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
- Calcolare un indice di prestazione (PI) per i due valori PREF da 4.1). Il PI rappresenta apprendimento associativo da annullando effetti perturbatori di odore e di esposizione punizione, passare del tempo e la gestione:
PI = (PREF ottobre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2
Così PI può variare da -1 a 1. Valori significativamente negativi rappresentano avversione di apprendimento, mentre valori significativamente positivi descrivere l'apprendimento appetitiva. Un esperimento completo comprende di solito di 10 o più inibitori della proteasi. I dati sono visualizzati come sap casella di trameg tutti i valori di un determinato gruppo sperimentale. 50% dei valori essendo situato all'interno della scatola, l'indice di prestazioni mediana è indicata come una linea in grassetto nella particella casella.
5. Analisi dei dati per l'attività rilevanti senso-motorie Facoltà
- Per valutare i dati durante il test per il corretto trattamento degli odori ottobre calcolo di un indice odore ottobre preferenze come segue:
Odore PREF ottobre = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale - Per valutare i dati durante il test per una corretta percezione degli odori AM calcolare un indice di odore AM preferenze come segue:
Odore PREF AM = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale - Per valutare i dati durante il test per la percezione fruttosio corretto calcolare un indice di preferenza fruttosio come segue:
PREF fruttosio = (# di larve lato fruttosio - # di larve dall'altra) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale - Dettagli per la formazione farsa sono in Michels et al. 2005.
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Representative Results
La figura 1A mostra una panoramica delle procedure sperimentali per l'apprendimento olfattivo larvale associativo. Accoppiando uno dei due odori presentati con un premio larve zucchero acquisire il potenziale comportamento di esprimere una risposta attraente verso l'odore ricompensati rispetto al unrewarded odore. Due gruppi di larve sono sempre formati da una associazione il rinforzo con l'odore PTOM o AM. L'indice di prestazioni (PI) misura la funzione associativa come la differenza di preferenza tra i gruppi reciprocamente addestrati.
Nel caso in cui la funzione associativa viene analizzata in larve transgenici, i test di base di senso-motorio abilità sono richieste. Questo viene fatto offrendo loro la scelta tra un contenitore riempito odore e aria pura o tra agarosio e agarosio più uno zucchero. (Formazione Sham non è mostrato qui). La distribuzione finale delle larve si nota in una scheda di dati specifico (Figura 2) e visualized come un diagramma a riquadri (Figura 3). Risultati positivi indicano un comportamento interessante scelta per gli indici di preferenza e apprendimento appetitiva in caso di indici di prestazione. I valori negativi indicano un comportamento di scelta avversione per gli indici calcolati e preferenza avversivo apprendimento in caso di indici di prestazione.
Figura 1. Schema degli esperimenti comportamentali per misurare larvale apprendimento associativo olfattivo, ingenue preferenze olfattive e gustative naïve preferenze.
- 30 alimentazione Drosophila 3 ° instar larve sono posti per cinque minuti su un piatto Petri agarosio che contiene una ricompensa di zucchero fruttosio 2M. Al tempo stesso un odore primo è fornito in Teflon contenitores (OCT). Così larve possono associare uno stimolo odore con un rinforzo positivo in fase di prima formazione. Successivamente, le larve sono trasferiti ad un secondo piatto Petri agarosio senza rinforzo, ma con l'odore secondo (AM) per 5 min nuovamente. La formazione viene ripetuta tre volte. Infine, nella situazione di prova la preferenza odore delle larve viene misurata per l'odore ricompensato contro l'odore non ricompensato su un piatto Petri agarosio. Questo permette il calcolo di un indice di preferenza prima (PREF). Un secondo gruppo di larve è addestrato in modo analogo reciprocamente. Qui, un indice di preferenza secondo (PREF) può essere calcolato. Finalmente una Performance Index (PI) è calcolato facendo la media entrambi gli indici di preferenza. Per ulteriori informazioni riguardanti la sequenza delle prove vedi anche 2,7.
- Per analizzare la preferenza ingenuo odore, un odore unico contenitore riempito con ottobre o AM è posto su un lato di una pura piatto Petri agarosio. 30 di alimentazione 3 ° larve instar sono placed nel mezzo della piastra di Petri e dopo 5 min la distribuzione delle larve sul piatto Petri viene contato. Dai dati ottenuti un indice preferenza olfattiva (PREF) viene quindi calcolata.
- Per analizzare la naïve gustativa fruttosio 2M preferenza è riempito in una metà di un piatto Petri che contiene puro agarosio sul suo lato. 30 alimentazione 3 ° larve instar sono posti al centro della piastra di Petri e dopo 5 min la distribuzione delle larve sul piatto Petri viene contato. Dai dati ottenuti un indice di preferenza gustativa (PREF) viene quindi calcolata.
Figura 2. Esempio di una scheda di dati grezzi per la registrazione e l'elaborazione dei dati ottenuti per A) apprendimento zucchero ricompensa, B) naïvepreferenze odore e C) le preferenze gustative naïve. Per tutti gli esperimenti il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro delle piastre di Petri sono noti. Fuori di indici di preferenza queste informazioni (PREF) sono calcolati. Apprendimento larvale è raffigurato come indici di prestazione (PI) derivanti dalle computating le preferenze di due gruppi reciprocamente addestrati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Esempio di visualizzazione dei dati ottenuti per A) apprendimento zucchero ricompensa, B) le preferenze odore naïve e C) le preferenze gustative naïve. Boxplot rappresentano i dati come segue: mediana (linea in grassetto nel riquadro), la casella indica il 50% di tutti i punti di dati, mentre il baffo superiore e inferiore rappresenta il restante 25% ciascuno. Quindi senza outliers i valori minimi e massimi sono indicati dai confini baffi. I valori anomali sono rappresentati da piccoli cerchi che sono definiti come qualsiasi punto di più di 1,5 volte il range interquartile dal 1 ° e 3 quartili. L'analisi statistica dei singoli punti di dati viene fatto con Wilcoxon test, mentre Wilcoxon rank test somma viene utilizzata per il confronto di due gruppi di dati. Livelli di significatività sono indicati come ns per p> 0.05, * per p <0.05, ** per p <0.01 *** o per p <0,001. Dimensione del campione di ogni esperimento: N = 15.
Per gli esperimenti di apprendimento in A) sempre due indici di preferenza (PREF) di esperimenti reciproci sono prese per il calcolo dell'indice finale di prestazioni (PI). Indici di performance (PI) sono dipinti come boxplot di conseguenza.
Figura 4. Esempi di GAL4 linee ciascuna delle quali etichette di un insieme specifico di cellule all'interno del cervello larvale. Sempre pieno z-proiezioni di vedute frontali del cervello larvale sono mostrati. Gruppi specifici di neuroni sono etichettati da anti-proteina fluorescente verde (verde) nel CNS interi larvali che viene visualizzato da doublestaining anti-FasII/anti-ChAT (magenta). A) NP225 etichette un insieme di neuroni di secondo ordine olfattivi, chiamata proiezione neuroni (freccia) e il sistema di adulti sviluppo visivo (freccia). B) NP2426 un insieme di segni olfattivi interneuroni (freccia) nella prima stazione relè olfattiva, chiamato il lobo antennale. C) GR66a etichetta esclusivamente un insieme di neuroni sensoriali gustative che progetto da organi periferici sensoriali gustative al ganglio subeosophageal (freccia). D) NP3128 etichette diverse serie di diversi tipi di neuroni. La freccia indica interneuroni olfattive del lobo antennale simili a B. La freccia mette in evidenza una serie di neuroni dopaminergici che proiettano su una regione neuropilo chiamato corpo funghi. E) H24 segna un insieme di cellule del corpo funghi Kenyon (freccia), i neuroni che, se visualizzati necessario per larvale apprendimento olfattivo. F) NP7493 è un esempio di un modello di espressione relativamente aspecifici che comprende diverse serie di neuroni in via di sviluppo (frecce) che si differenziano ulteriormente durante la metamorfosi per formare il cervello della mosca. Barre di scala = 50 micron.
Figura 5. Riepilogativa tentativi riusciti di studiare apprendimento associativo in Drosophila larve. Stimoli olfattivi così come la luce può essere usato come uno stimolo condizionato per essere associate sia con ricompensa o una punizione (stimolo incondizionato). Premiare gli stimoli sono zucchero e basse concentrazioni di sale, stimoli che puniscono comprendono alte concentrazioni di sale, chinino, scosse elettriche, calore, stimolazione meccanica attraverso la vibrazione (ronzio) e la luce 11,12,17-24. Clicca qui per ingrandire la figura .
| GAL4 / UAS costruisce spesso utilizzato nel nostro laboratorio | |||
| Abbreviazione | Proteina | Funzione | Letteratura |
| Visualizzazione | |||
| UAS-GFP mCD8 :: | proteina fluorescente verde | membrane marcatore | Lee et al., 1999 |
| UAS-n-SYB :: GFP | proteina fluorescente verde | marcatore presinaptico | Ito et al., 1998 |
| UAS-GFP Dscam17.1 :: | proteina fluorescente verde | marcatore postsinaptico | Wang et al., 2004 |
| UAS-NLS :: GFP | proteina fluorescente verde | cellula del corpo indicatore | Robertson et al., 2003 |
| Interferenza con segnalazione neuronali | |||
| UAS-hid | testa involuzione difettoso | induce apoptosi | Zhou et al., 1997 |
| UAS-RPR | mietitore | induce apoptosi | Zhou et al., 1997 |
| UAS-shi ts | dominante negativo dinamina | blocchi vesicle riciclaggio | Kitamoto, 2001 |
| UAS-Kir.2.1 :: EGFP | interiormente rettifica K + canale | no depolarizzazione della membrana | Baines et al., 2001 |
| UAS-TRPA1 | zione del canale | temperatura di attivazione dipendente | Rosenzweig et al., 2005 |
| UAS-CHR2 | Channelrhodopsin | luce di attivazione dipendente | Schroll et al., 2006 |
Tabella 1. Costrutti UAS effettori spesso utilizzati in laboratorio per visualizzare l'anatomia neuronale e manipolare trasmissione sinaptica 25-33.
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Discussion
La configurazione descritta in larve di Drosophila permette lo studio di apprendimento associativo olfattivo all'interno di un cervello relativamente elementare. L'approccio è semplice, economico, facile da stabilire in un laboratorio e non richiede attrezzature ad alta tecnologia 9. Vi presentiamo una versione dell'esperimento, per studiare appetitiva apprendimento associativo rafforzato dalla ricompensa fruttosio 11. La configurazione descritta si basa su una serie di studi parametrici che ampiamente indagato le variazioni nel numero di processi di formazione, unico dosaggio rispetto a massa test, tempo di ritenzione, gli odori utilizzati e le concentrazioni di odore e di genere 9,15,34,35. Pertanto, la configurazione descritta comportamentale integra queste informazioni in un approccio estremamente riproducibile per studiare le funzioni cerebrali superiori in Drosophila. In definitiva, in base alla sua facilità di configurazione l'effetto di premiare o punire qualsiasi sostanza dissoluble può essere facilmente testato con questa analisi.
ve_content "> Inoltre, diverse varianti del paradigma sono stati recentemente pubblicati che permettono l'indagine associativo apprendimento visivo nelle larve 23,36 (con sede in Gerber et al (2004).) e scosse elettriche, luce, calore, chinino o le vibrazioni sono state implementate con successo anche come rinforzi avverse per l'apprendimento associativo olfattivo 9,17,19-21,37-40. Così, una serie completa di apparati sperimentali esiste per analizzare la base comportamentale, neuronale e molecolari dell'apprendimento e della memoria nelle larve Drosophila ( Figura 5) 13,14,41,42. qui, ci siamo concentrati esclusivamente su odori-fruttosio di apprendimento a causa della robustezza del test e gli indici di prestazioni relativamente elevate che possono essere ottenuti. particolare alcune delle varianti di portare a spiacevoli solo comportamentale piccola modifiche. Questo limita in qualche misura l'applicazione del metodo, oltre a problemi di sviluppo degli animali che compongono studi sulla larvale lungo terminememoria piuttosto impossibile.Il cervello larvale consiste solo circa 10.000 neuroni nella sua interezza. Così dovuta alla sua organizzazione relativamente semplice (in termini di numero) è ben accessibile a interferenze genetica, che a sua volta consente per studi avanzati sulle basi molecolari e neuronali di apprendimento e memoria. Specialmente i sistemi GAL4/UAS e sue modifiche recenti consentono la manipolazione genetica di insiemi definiti di neuroni e anche fino a singole cellule in un modo spazio-temporale (Figura 4) 7,10. Presente una serie completa di linee effettrici offre la possibilità di visualizzare questi insiemi definiti di neuroni (Figura 4) 25,43 o, in alternativa, per manipolare la loro produzione neuronale (Tabella 1). Il più delle volte i geni effettori vengono applicate in grado di cellulare autonomamente indurre la morte cellulare o inibire la trasmissione neuronale 29,30,33. Più recentemente sono state sviluppate tecnologie che albassa per una attivazione controllata artificiale di neuroni guidati dalla luce o temperatura (Tabella 1) 31,32,44.
In sintesi, la combinazione di sistemi sofisticati di interferenza genetica e gli esperimenti qui descritti comportamentali permettono di scoprire la base neuronale, molecolari e comportamentali di apprendimento e memoria nel cervello elementare larve di Drosophila.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vogliamo in particolare ringraziare i membri del laboratorio di Gerber per le istruzioni tecniche per la loro impostazione sperimentale e commenti sul manoscritto. Ringraziamo anche Lyubov Pankevych per la cura della mosca e la manutenzione del parco selvaggio Cantoni tipo. Questo lavoro è supportato dalla concessione DFG TH1584/1-1, la concessione SNF 31003A_132812 / 1 e la Zukunftskolleg dell'Università di Costanza (tutti a AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
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