Summary
وصفنا تقنية التي زرعها قسم من الشريان الأورطي البطني من الماوس orthotopically إلى أسفل الشرايين الكلوية في مستلم خيفي أو مسانج. هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة في الدراسات التي يعتبر زرع الشرايين كبيرة من حجم موحد المفيد.
Abstract
ويعتقد عموما الإجراءات التي تنطوي على الأوعية الدموية في anastomoses الماوس لتكون صعبة وتعتمد إلى حد كبير على مهارة الجراح الفردية. هذا صحيح إلى حد كبير، ولكن هناك عددا من المبادئ الهامة التي يمكن أن تقلل من صعوبة هذه الإجراءات وتعزيز التكاثر. زرع مثلي الأبهر هو إجراء الممتازة التي لتعلم هذه المبادئ لأنها تنطوي على اثنين فقط من نهاية إلى نهاية anastomoses، ولكنها تتطلب تقنية جيدة خياطة والتعامل مع السفن لنجاح ثابت. يبدأ هذا الإجراء مع شراء بطول الشريان الأورطي البطني من حيوان المانحة، تليها شعبة من الشريان الأورطي الأصلي في المتلقي. ثم يتم وضع الشريان الأورطي شراؤها بين طرفي المقسمة الشريان الأورطي المستفيدة وخياطة في مكانها باستخدام نهاية إلى نهاية anastomoses. لتحقيق هذا الهدف يتطلب بنجاح على درجة عالية من التركيز، والأدوات الجيدة، مطرد من ناحية، وتقدير مدى سهولةيمكن أن تتلف الأوعية الدموية على فأرة الحاسوب، مما أدى إلى تجلط الدم. تعلم هذه المبادئ أهمية هو ما يشغل معظم وقته للمبتدئين عندما تعلم المجهرية في القوارض الصغيرة. طوال هذا البروتوكول، نشير إلى هذه النقاط المهمة. ويمكن استخدام هذا النموذج لدراسة أمراض الأوعية الدموية في مجموعة متنوعة من النظم التجريبية المختلفة 1-8. في سياق المعروضة هنا، وغالبا ما تستخدم لدراسة ما بعد زرع أمراض الأوعية الدموية، مشتركة على المدى الطويل مضاعفات زرع الأعضاء الصلبة التي تضخم باطنة يحدث داخل طعم خيفي. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أنه يسهل التحليلات الكمية والمظهرية السفينة المزروعة تقع متجاورة إلى السفينة الذاتية، والتي يمكن أن تكون بمثابة عنصر تحكم إضافية 9. غالبا ما يتم استخدام هذه التقنية هو موضح هنا للالفئران وزنها 18-25 جرام. تراكمت لدينا خبرة أكثر من مستخدما في ذلك C57BL/6J، BALB / CJ، وسلالات C3H/HeJ.
Protocol
1. إعداد سابق للجراحة
- الإجراءات الجراحية، مهما فعلت بعناية، نتيجة الإجهاد في كبيرة. للحد من آثار الإجهاد مثل وتعظيم الاحتياطيات، ينبغي الحفاظ الحيوانات في الحظيرة للا يقل عن 72 ساعة قبل الاستخدام 10،11.
- يجب الأدوات الجراحية والشاش، ومسحات تكون معقمة. ليس من الضروري استخدام قفازات معقمة فقط توفير نصائح من خياطة أو أدوات اتصال مجال المنطوق.
- لالإرقاء، لا بد من أن الضغوط لقط هي الحد الأدنى الضروري. والأضرار التي لحقت السفينة بسبب الضغط المفرط أو المعاملة الخشنة يسبب تخثر الدم، مما أدى إلى شلل القائمة الخلفية، نقص تروية الأمعاء، والوفاة في غضون 24 ساعة. لقد وجدنا أن استخدام المشابك مع ضغط لا يزيد عن 2 سم / جم 2 يحل المشكلة. لاحظت هذه المشابك في الجدول 1. يشار إلى الضغوط المشبك في مواصفات المشابك التي قدمتها أجهزة قياس عالية الجودة الجراحيةالشركات المصنعة ر. لقد وجدنا أن المشابك غير مكلفة أو المشابك المتاح عالميا ممارسة الكثير من الضغط.
- موقع الأوعية الجانبية فضلا عن المواقع النسبية للالشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC) هي سلالة التابعة. سوف تجد أيضا اختلافات صغيرة بين الفئران الفردية، وخاصة في الموقع للسفن ضمانات.
2. عملية المانحة
- يمكن أن تكون الفئران تخدير مع (1،5-2،5٪ الحث والصيانة 1.0٪ في الهواء) أو مع isoflurane بنتوباربيتال (55-65 مغ / كغ). بنتوباربيتال يفرض مهلة زمنية (تصل إلى 1.5 ساعة)، ولكنها توفر للجراح مع خيار تدوير لأفضل حيوان الوصول، إذا رغبت في ذلك. ويمكن تمديد الوقت إلى تخدير لتصل إلى 2 ساعة عن طريق وضع 2-3 قطرات من مخدر عند الحاجة إلى الأمعاء أو الكبد أثناء العملية الجراحية. ويمكن أيضا الكيتامين / زيلازين (100 وزن الجسم ملغ / كغ للالكيتامين و 7 مغ / كغ للزيلازين، IP) يتم استخدامها من قبل المدربين تدريبا جيدا الجراحين الذين كاليفورنيان إنهاء إجراءات في حدود 1 إلى 1.5 ساعة، لكنه لا يملك أضيق نطاق جرعة آمنة. في الولايات المتحدة، أصبح استخدام بنتوباربيتال أكثر تعقيدا في السنوات الأخيرة بسبب نقص الامدادات. لا بد من أن يتم رصد عمق التخدير لتكون على يقين أنه يكفي. منعكس إصبع القدم قرصة هو أفضل مؤشر على عمق كاف ولكن ينبغي للمرء أن يلاحظ أيضا معدل التنفس والحركات الأخرى أيضا.
- بعد تحريض التخدير، واستخدام مزيل الشعر هلام أو ماكينة حلاقة لإزالة الشعر من على البطن البطني.
- تحميل الحيوان على لوحة التشغيل باستخدام الشريط المختبر لأنه عقد في موقف الانتشار eagled. لوحة التشغيل لامع يسمح باستخدام وسادة التدفئة تحته لتقديم الدعم درجات الحرارة أثناء الجراحة. نحن التحكم يدويا في درجة حرارة سادة التدفئة، والتي هي وحدة الصف المستهلك للاستخدام في المنزل. يتم الحفاظ على درجة الحرارة بين 35-38 درجة. لوحة التشغيل لامع هو أيضا من السهل لتعقيم بين الإجراءات.
- تطهير المنطقة باستخدام مطهر مثل الكلورهيكسيدين، يعقبه غسل الايثانول. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات، لضمان التطهير كافية. وهذا أيضا إزالة أي قطع قطعة المتبقية من الشعر، إذا كان موجودا.
- مقص باستخدام إجراء شق خلال جدار الجسم لفضح أحشاء البطن.
- استخدام مسحة القطن، دفع الأحشاء جانبية لفضح الأوعية الدموية الكبرى في البطن. يتم وضع الأحشاء على قطعة من الشاش المبللة التي يتم المالحة الدافئة مع أن يبقيه رطبة.
- باستخدام تشريح حادة، بعناية فائقة تشريح الشريان الأورطي البطني بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها. كن حذرا جدا في تشريح السفينة بعيدا عن الوريد الأجوف السفلي. وسوف يكون هناك واحد أو أكثر من فروع، مثل الشريان القطني، التي يجب أن ترفع بعناية وأكتوي. ينبغي لقسم من الشريان الأورطي تشريح يكون أقل من الأوعية الكلوية وفوق التشعب من الشريان الأورطي في الشرايين الفخذية. يمكن هذا القسم بمثابة المواد المانحة للما يصل إلىق اثنين من المستلمين، اعتمادا على كيفية العديد من السفن المتفرعة الوجود، وحجم الحيوان المانحة.
- وربط الخيط أسفل الشرايين الكلوية وآخر فقط فوق التشعب. مقص باستخدام تقسيم الشريان الأورطي، وشطف تماما الكسب غير المشروع مع المالحة تحتوي على 200 U / مل الهيبارين. بعناية فائقة عقد واحدة من نهاية السفينة وبالتنقيط في محلول ملحي بحيث يتم تشغيله من خلال السفينة عن طريق الجاذبية. لا تدع فقاعات الهواء من خلال تشغيل السفينة. التعامل مع نهايات السفينة أقل قدر ممكن وإلا يمكن أن تتلف مما يؤدي إلى تخثر البطانية في وقت لاحق. إزالته من الميدان على الفور ووضع في وعاء من الثلج الباردة المالحة. السماح للحيوان المانحة ليستنزف.
3. المتلقي عملية
- تخدير الحيوان على النحو الوارد أعلاه وتطبيق هلام مزيل الشعر أو استخدام ماكينة حلاقة لإزالة الشعر على البطن. قبيل شق نحن إدارة جرعة من البوبرينورفين تحت الجلد عند 0.1 ملغ / كغ لتأسيس وعي.
- Mount الحيوان في حقل التشغيل باستخدام الشريط المختبر. يجب أن يتم تنظيمها على خشبة المسرح الحيوان التشغيل الدافئة التي سوف تساعد على الحفاظ على درجة حرارة الجسم خلال العملية.
- تطبيق جنتاميسين مرهم العيون للعيون لمنعهم من الجفاف.
- تطهير البطن، يليها غسل الايثانول. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات، لضمان التطهير كافية.
- التحقق من كفاية تخدير مرة أخرى قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد وجدار الجسم على مرحلتين، والحرص على عدم تؤثر على الأنسجة تحت.
- اضافة الى وجود رش لعقد شق البطن المفتوحة. تشير الجمعية المسمار في نهاية هند للحفاظ على الجزء الأكبر من المشبك للخروج من الطريق.
- الرطب مربع من شاش معقم مع المالحة ووضعه على الأمعاء. بإصبعك بلطف على الشاش، اضافة الى وجود مسحة القطن تحت الأمعاء وتعكس بلطف الأمعاء لأكثر من لياليIDE لذلك هم يجلسون على قمة الشاش. تأخذ قطعة أخرى من الشاش، وضعه على الأمعاء والرطب مع المالحة.
- إزالة أي نوع من الأنسجة الدهنية التي تغطي الشريان الأورطي والوريد الأجوف السفلي (IVC). أن يكون لطيف. وIVC هش للغاية.
- استخدام ملقط لتشريح بلطف الشريان الأورطي infrarenal من IVC. تطهير منطقة واسعة بما يكفي لتوفير غرفة لمدة المشابك مع السفينة كافية بينهما بحيث، عندما ينقسم، سيكون هناك ما يكفي لسفينة التي يمكن خياطة الكسب غير المشروع. عندما تشريح، والبحث عن فروع السفينة. إذا لزم الأمر كوى لهم cauterizer درجة حرارة منخفضة.
- إدراج المشبك الأوعية الدموية أقل بقليل من الشريان الكلوي وبعضها البعض فقط فوق التشعب.
- قطع الشريان الأورطي. سوف ينتهي من الشريان الأورطي تتراجع عادة، وترك مسافة حوالي 5 ملم. تحقق من وجود الإرقاء. إذا المشابك تعمل بشكل صحيح، يجب فقط كمية صغيرة من الدم الفرار بعد خفض الانتاج. إذا استمر النزيف، والتحقق من المشابك لتكون شيئا غير متأكد من التداخلجي معهم. لاحظ أن تتم إزالة أي من الشريان الأورطي. فمن مجرد تقسيم.
- شطف نهايات قطع مع المالحة heparinized (200 U / مل) ثم قم بإزالة الحل مع مسحة اضافية.
- تك الكسب غير المشروع في مكانه باستخدام ثلاثة خيوط متقطعة في كل نهاية. خياطة فقط جانب واحد من مفاغرة في كل نهاية، ومن ثم تملأ بقية مع خياطة الغرز المستمر تشغيل أو أكثر متقطع. سبعة إلى ثمانية خيوط متقطعة كافية. إذا كنت تستخدم خياطة تشغيل، تأكد أن تظل جدران الأوعية استرخاء والتي لا تسبب تضيق في مفاغرة.
- إزالة بعناية المشبك في نهاية الجمجمة والبحث عن التسريبات في خطوط الدرز. وهناك كمية صغيرة من التسرب وتوفير OK يتوقف داخل دقيقة تقريبا. إذا كان هناك أكثر من ذلك، فمن الممكن استخدام غرزة واحدة لوقف النزيف.
- اضغط بلطف على الشريان الأورطي فوق موقع مفاغرة مع قضيب من القطن المبللة، ثم قم بإزالة المشبك الثاني. اضغط بلطف والافراج عن بضع مرات وتأكد من أن الشريان الأبهر يظهر البراءة. سيتم perfused الكسب غير المشروع فورا ونبض يجب أن تكون مرئية.
- إزالة الشاش تغطي الأمعاء ونقلها إلى مكانها. تجنب التواء في الأمعاء والحفاظ على التوجه الطبيعي التشريحية.
- إغلاق طبقة العضلات باستخدام Vicryl 5-0.
- إغلاق الجلد باستخدام 5-0 أو البرولين 6-0.
- علاج الماوس تحت الجلد مع carprophen في 5 ملغ / كغ لزيادة وعي قبل إنهاء التخدير.
- إعطاء المالحة الماوس مل تحت الجلد 0،5-0،8.
- ضع الماوس في قفص ساخنة لاسترداد. رصد بعناية أثناء الاسترداد للتأكد من أنه يتعافى بشكل طبيعي. 2-3 ساعة بعد الجراحة، وينبغي أن الماوس بشكل طبيعي نسبيا. في 12 ساعة بعد العملية، وعلاج الحيوان مع البوبرينورفين تحت الجلد عند مستوى 2 مغ / كغ للوعي. إذا، في أي وقت، ومنحنية الحيوان، مما يجعل الضوضاء أو العرض مجموعة محدودة من الحركة، والتحقيق في المشكلة. إذالا يمكن أن تنشأ قضية محددة وثابتة، يجب أن يتم التخلص من الحيوانات في البروتوكولات المؤسسية. في 24 ساعة يجب أن الحيوان تلقي جرعة أخرى من تحت الجلد في carprophen 5 ملغ / كغ. هند شلل ساقه يشير إلى فشل أو خثرة مفاغرة ل. في هذه الحالة، يجب أن يتم التخلص من الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يبين الكسب غير المشروع الأبهر. الأسهم البيضاء دلالة على خطوط الدرز. وسوف تظهر براءة الكسب غير المشروع النبض مرئية. الشكل 2 يشير إلى التجربة النموذجية التي وأعقب بقاء المتلقي لمدة 56 يوما. تتألف مجموعة واحدة من الفئران المتلقية البرية من نوع (C57BL / 6 × FVB) مع زرع BALB / ج الشريان الأورطي. المجموعة الأخرى، المعين "KO" يتكون من المتلقين (C57BL / 6 × FVB) نقص في التعبير عن الهيم أوكسيجيناز-1، والذي ينتج من تجلط الدم خلال 24 ساعة الطعوم. والجدير بالذكر أن هذه النتائج في وفاة جميع المستفيدين كما هو موضح في الشكل. ويبين الشكل 3 صدى قياسات IVC والشريان الأورطي البطني في الحيوانات العادية وزرع في المتلقي. نلاحظ أن الكسب غير المشروع هو البراءة وتشبه في مظهرها الشريان الأورطي غير المزروعة.
الشكل 1.عرض للالأبهر المزروعة. الأسهم البيضاء دلالة على خطوط الدرز.
الشكل 2. كابلان ماير تصوير البقاء بعد زرع الأبهر في مجموعتين من الفئران زرع الشريان الأورطي مع من الماوس BALB / ج. "KO" يعين المستفيدين من نقص في التعبير عن الهيم أوكسيجيناز-1، والذي ينتج من تجلط الدم الأبهري ترقيع في غضون 24-48 ساعة. "WT" يعين تتزاحم من النوع البري. طبع من: أول أكسيد الكربون إنقاذ الهيم أوكسيجيناز-1-ناقص الفئران من تجلط الدم الشرياني في الأبهر خيفي زرع، تشن B، L قوه، فان C، Bolisetty S، R جوزيف، رايت MM، أغاروال A، جورج JF. J Pathol صباحا. يوليو 2009؛ 175 (1) :422-9 بإذن من السيفير.
الارقام ..ه 3. صدى التصوير من الوريد الأجوف السفلي (IVC) والشريان الأورطي البطني في الجسم الحي في الماوس العادي (اللوحة اليسرى) ومستلم في زرع الأبهر (اللوحة اليمنى). تم إنتاج الصور مع صك Visualsonics 660 VEVO. العلامات النجمية دلالة على تجويف السفن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج الماوس من زرع الأبهر توفير عدد من المزايا بشكل جيد للغاية لأن تعريف الفئران immunogenetically 9،12،13، ويمكن التلاعب بها بسهولة أنها لتغيير التعبير عنها من جينات معينة، إذا رغبت في ذلك. كما ذكر في المقدمة، جراحة الأوعية الدموية في الماوس هو أكثر صعوبة من معظم النماذج بسبب حجم السفن. حتى الشرايين الكبيرة، مثل الشريان الأورطي وعادة ما تكون أكثر لا يتجاوز 100-200 ميكرون في القطر الداخلي، لذا التلاعب هذه السفن يتطلب قدرا كبيرا من المهارة والبراعة 8،14. أكثر المضاعفات شيوعا لوحظ في هذه الجراحة من قبل أولئك مجرد بداية لتطبيق نظام القائمة الخلفية هو الشلل، عادة ما يتسبب في تخثر الناتجة عن إصابة البطانية من المعاملة الخشنة أو تحامل. معظم المشابك تسويقها من قبل الشركات التي تبيع أدوات مناسبة لخلق المجهرية الكثير من الضغط لاستخدامها في الفئران، مع ضغوط أكبر عادة من 25 جرام / سم 2. القانون المدنيالنواب التي نستخدمها هي على نحو سلس، مع الضغط من 2 جم / سم 2، والضغط الذي يكفي لتحقيق الإرقاء وليس إلى تلف الأوعية. بعض الجراحين يفضلون استخدام خياطة بدلا من المشابك. لا نوصي هذه الممارسة لأنها الطريقة التي تعتمد بشكل كبير على قدرة الجراح لقياس الضغط والصحيح، في رأينا، يمكن أن تسهم في خفض معدل النجاح. مع الممارسة، ينبغي أن نتوقع معدل البقاء على قيد الحياة من 90٪ أو أفضل منه.
خياطة تقنية لanastomoses نهاية إلى نهاية هو المهارة الهامة التي يتم الحصول من ذوي الخبرة. اعتمادا على الخبرة السابقة مع التقنيات الجراحية والبراعة اليدوية، يمكن تحقيق الكفاءة الكاملة بعد 50-100 الإجراءات. المزيد من الدراسات الأخيرة تشير إلى التكنولوجيات البديلة لanastomoses قد تصبح متاحة في ال 15 المقبلة.
القيد الأساسي من هذا الإجراء هو، مثل الإجراءات الأكثر المجهرية في الفئران، التي على مستوى عال من المهارةقد يتطلب التنفيذ الناجح للوالأفراد دون ممتاز المهارات الحركية الدقيقة أبدا تحقيق مستوى عال من الكفاءة. ومع ذلك، مع ممارسة، يمكن لمعظم الأفراد على تحقيق معدل البقاء على قيد الحياة مقبولة. حجم صغير من الأنسجة يؤدي أيضا إلى قيود إضافية لأن حجم الكسب غير المشروع صغيرة جدا، وبالتالي فإن كمية المواد للتحليل لاحق يقيد و. أكبر ميزة لنموذج هو الوراثيات المناعية تتميز جيدا من الفئران، وتوافر واسعة من السلالات الفطرية عديدة، الفئران المعدلة وراثيا، والفئران خروج المغلوب، والسماح لتجارب مفيدة جدا لمعالجة الآليات الجزيئية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الموارد الأساسية للمركز NIH اوبراين P30 (DK 079337).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| 10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
| Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
| Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
| Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
References
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
- Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
- Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
- Benza, R. L., George, J. F. Aortic graft transplantation in mice. J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
- Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
- Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
- Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
- Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).
