El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Summary

Se describe una técnica en la que se trasplanta una sección de la aorta abdominal de un ratón ortotópicamente a justo por debajo de las arterias renales en un receptor alogénico o singénico. Esta técnica puede ser útil en estudios en que se considera el trasplante de las grandes arterias de tamaño uniforme ventajosa.

Abstract

Procedimientos vasculares que implican anastomosis en el ratón se cree generalmente que ser difícil y depende en gran medida de la habilidad del cirujano individual. Esto es cierto en gran medida, pero hay una serie de principios importantes que puede reducir la dificultad de estos procedimientos y aumentar la reproducibilidad. Trasplante aórtico ortotópico es un excelente procedimiento en el que aprender estos principios, ya que implica sólo dos de extremo a extremo anastomosis, pero requiere una buena técnica de sutura y la manipulación de los vasos para el éxito consistente. Este procedimiento comienza con la adquisición de una longitud de aorta abdominal de un animal donante, seguido por la división de la aorta nativa en el receptor. La aorta adquiridos se coloca entonces entre los extremos divididos de la aorta receptor y se sutura en su lugar con extremo a extremo anastomosis. Para lograr este objetivo con éxito requiere un alto grado de concentración, buenas herramientas, una mano firme y una apreciación de la facilidad con lavasculatura de un ratón puede ser dañada, resultando en trombosis. El aprendizaje de estos importantes principios es lo que ocupa la mayor parte del tiempo el principiante al aprender microcirugía en los roedores pequeños. A lo largo de este protocolo, nos referimos a estos puntos importantes. Este modelo puede ser utilizado para estudiar la enfermedad vascular en una variedad de diferentes sistemas experimentales ^1-8. En el contexto que se muestra aquí, que es la más utilizada para el estudio de la enfermedad después del trasplante vascular, una común complicación a largo plazo del trasplante de órgano sólido en el que la hiperplasia intimal se produce dentro del aloinjerto. La ventaja principal del modelo es que facilita análisis morfométricos cuantitativos y el vaso trasplantado se encuentra contiguo al recipiente endógeno, que puede servir como un control adicional ^9. La técnica mostrada aquí es la más utilizada para los ratones de peso 18-25 gramos. Hemos acumulado la mayor parte de nuestra experiencia en el uso de la C57BL/6J, BALB / cJ, y las cepas C3H/HeJ.

Protocol

1. Preparación prequirúrgica

1. Los procedimientos quirúrgicos, no importa cuán cuidadosamente hecho, dan lugar a un estrés significativo. Para minimizar los efectos del estrés tal y para maximizar las reservas, los animales deben ser mantenidos en el vivero durante al menos 72 horas antes de su uso ^10,11.
2. Instrumentos quirúrgicos, gasas y torundas deben ser estériles. No es necesario el uso de guantes estériles proporcionan sólo las puntas de la sutura toque instrumentos o el campo operatorio.
3. Para la hemostasia, es imperativo que las presiones de sujeción son el mínimo necesario. Daños en el vaso debido a la presión excesiva o manipulación brusca se causar trombosis, lo que resulta en la parálisis pata trasera, isquemia intestinal, y la muerte en 24 horas. Hemos encontrado que el uso de abrazaderas con una presión de no más de 2 g / cm ² elimina el problema. Estas abrazaderas se indica en la Tabla 1. Presiones Clamp se indican en las especificaciones de las abrazaderas hechas por instrumental quirúrgico de alta calidadt fabricantes. Se ha encontrado que las abrazaderas o grapas desechables baratos universalmente ejercer demasiada presión.
4. La ubicación de los vasos colaterales, así como las ubicaciones relativas de la aorta abdominal y la vena cava inferior (IVC) son dependiente de la cepa. También encontrará pequeñas variaciones entre los ratones individuales, especialmente en la ubicación de los vasos colaterales.

2. Donante de Operación

1. Los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano (inducción 1.5-2.5%, 1,0% de mantenimiento en el aire) o con pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital impone un límite de tiempo (hasta 1,5 horas), pero proporciona al cirujano la opción de hacer girar el animal para un mejor acceso, si se desea. Tiempo de anestesia se puede extender a un máximo de 2 horas mediante la colocación de 2-3 gotas de la anestesia cuando sea necesario en el intestino o el hígado durante la cirugía. La ketamina / xilazina (100 mg / kg de peso corporal para la ketamina y 7 mg / kg de xilazina, ip) también puede ser utilizada por cirujanos bien entrenados que can terminar el procedimiento dentro de 1 a 1,5 horas, pero tiene un rango más estrecho dosis segura. En los EE.UU., el uso de pentobarbital se ha vuelto más problemática en años recientes debido a la escasez de suministros. Es imperativo que la profundidad de la anestesia ser controlados para estar seguro de que es suficiente. El reflejo del dedo del pie-pinch es el mejor indicador de la profundidad adecuada, pero también se debe tener en cuenta la tasa de respiración y otros movimientos también.
2. Después de la inducción de anestesia, use un gel depilatorio o una máquina de afeitar para eliminar el vello en el abdomen ventral.
3. Montar el animal en el tablero de operación con cinta laboratorio para mantenerlo en una posición con las piernas abiertas. Un tablero operativo metálico permite el uso de una almohadilla de calefacción por debajo de ella para proporcionar apoyo temperatura durante la cirugía. Nos controlar manualmente la temperatura de la almohadilla de calefacción, que es una unidad de consumo de grado para uso en el hogar. La temperatura se mantiene entre 35-38 °. La placa metálica de funcionamiento es también fácil de esterilizar entre procedimientos.
4. Desinfectar el área con un desinfectante como la clorhexidina, seguido de un lavado con etanol. Repita este procedimiento tres veces, para asegurar una desinfección adecuada. Esto también eliminará todos los trozos residuales de corte de pelo, si está presente.
5. Usando tijeras hacer una incisión a través de la pared del cuerpo para exponer las vísceras abdominales.
6. Use un hisopo de algodón, empuje las vísceras a un lado para dejar al descubierto los grandes vasos del abdomen. Las vísceras se colocan en un trozo de gasa que se humedece con solución salina caliente para mantenerlo húmedo.
7. Utilizando disección roma, con mucho cuidado diseccionar la aorta abdominal lejos del tejido circundante. Sea muy cuidadoso en la disección de la embarcación lejos de la vena cava inferior. Habrá una o más ramas, tales como la arteria lumbar, que debe ser extraído cuidadosamente y cauterizado. La sección de aorta disecada debe estar por debajo de los vasos renales y por encima de la bifurcación de la aorta a las arterias femorales. Esta sección puede servir como material donante para un mayor números de dos receptores, dependiendo de la cantidad de ramificación vasos existen y el tamaño del animal donante.
8. Atar una sutura debajo de las arterias renales y otra justo encima de la bifurcación. Usando tijeras dividir la aorta, enjuague completamente el injerto con solución salina que contenía 200 U / ml de heparina. Muy cuidadosamente mantener un extremo del recipiente y gotear la solución salina para que se ejecute a través del recipiente por gravedad. No deje que las burbujas de aire correr a través del vaso. Manejar los extremos del recipiente tan poco como sea posible de otro modo la íntima puede ser dañado resulta en trombosis después. Retírelo del campo e inmediatamente colóquelo en un recipiente con solución salina helada. Deje que el animal donante a exsanguinate.

3. Receptor Operación

1. Se anestesia el animal como anteriormente y se aplica un gel depilatorio o utilizar una máquina de afeitar para eliminar el vello en el abdomen. Justo antes de la incisión que administrar una dosis de buprenorfina por vía subcutánea a 0,1 mg / kg para establecer analgesia.
2. Mim porte del animal en el campo operatorio con cinta laboratorio. El animal debe ser montado en una fase de funcionamiento caliente que ayudará a mantener la temperatura corporal durante la operación.
3. Aplicar ungüento oftálmico de gentamicina a los ojos para evitar que se seque.
4. Desinfectar el abdomen, seguido de un lavado con etanol. Repita este procedimiento tres veces, para asegurar una desinfección adecuada.
5. Comprobar la adecuación de la anestesia, una vez más antes de proceder al siguiente paso.
6. Hacer una incisión de línea media a través de la piel y la pared del cuerpo en dos etapas, teniendo cuidado de no afectar a los tejidos subyacentes.
7. Inserte un separador para mantener la incisión abdominal abierta. Punto el conjunto tornillo hacia el extremo trasero para mantener la mayor parte de la abrazadera fuera del camino.
8. Humedezca un trozo de gasa estéril con solución salina y colóquelo sobre los intestinos. Con el dedo suavemente sobre la gasa, inserte un palillo de algodón bajo los intestinos y suavemente reflejar los intestinos a la side para que se sienta encima de la gasa. Toma otro pedazo de gasa, colóquelo en el intestino y humedecerla con solución salina.
9. Retire cualquier tejido graso que cubre la aorta y la vena cava inferior (VCI). Sea amable. El IVC es muy frágil.
10. Suavemente utilizar pinzas de disecar la aorta infrarrenal de la vena cava inferior. Borrar un área suficientemente grande para proporcionar espacio para dos abrazaderas con recipiente de suficiente entre ellos de tal manera que, cuando se divide, habrá vaso lo suficiente como para que se puede suturar el injerto. Cuando disección, busque las ramas del recipiente. Si es necesario que cauterizar con un cauterizador baja temperatura.
11. Insertar una pinza vascular justo por debajo de la arteria renal y otra justo por encima de la bifurcación.
12. Cortar la aorta. Los extremos de la aorta por lo general se retrae, dejando un espacio de aproximadamente 5 mm. Compruebe la hemostasis. Si las pinzas están funcionando correctamente, sólo una pequeña cantidad de sangre debe escapar después del corte. Si el sangrado continúa, compruebe las abrazaderas que no haya nada interferenciasING con ellos. Nótese que ninguna de la aorta se retira. Es simplemente dividido.
13. Enjuague los extremos cortados con solución salina heparinizada (200 U / ml) y luego se retira la solución extra con un bastoncillo de algodón.
14. Tack el injerto en su lugar con tres suturas discontinuas en cada extremo. Sólo suturar un lado de la anastomosis en cada extremo, y luego rellene el resto con una sutura continua o más suturas discontinuas. De siete a ocho suturas discontinuas es suficiente. Si utiliza una sutura continua, asegúrese de que las paredes de los vasos permanecer relajado y que no causan estenosis en la anastomosis.
15. Retire con cuidado la pinza en el extremo craneal y ver si hay fugas en las líneas de sutura. Una pequeña cantidad de filtración está bien proporcionando que se detenga dentro de aproximadamente un minuto. Si no es más que eso, es posible utilizar una sola puntada para detener el sangrado.
16. Presione suavemente la aorta por encima del sitio de la anastomosis con un aplicador de algodón humedecido, y luego retire la segunda abrazadera. Presione suavemente yliberar un par de veces y comprobar que la aorta aparece patente. El injerto se perfundieron inmediatamente y un pulso debe ser visible.
17. Retire la gasa que cubre los intestinos y mover de nuevo en su lugar. Evitar la torsión del intestino y mantener la orientación anatómica normal.
18. Cierre la capa de músculo con Vicryl 5-0.
19. Cierre la piel con prolene 5-0 o 6-0.
20. Tratar el ratón por vía subcutánea con carprophen a 5 mg / kg para aumentar la analgesia antes de terminar la anestesia.
21. Dar el ratón 0,5-0,8 ml de solución salina por vía subcutánea.
22. Coloque el ratón en una jaula caliente para recuperarse. Monitorear cuidadosamente durante la recuperación para estar seguro de que se está recuperando con normalidad. 2-3 horas después de la cirugía, el ratón debe comportarse con relativa normalidad. A las 12 horas post-op, tratar al animal con buprenorfina por vía subcutánea de 2 mg / kg para la analgesia. Si, en cualquier momento, el animal se encogió, haciendo ruido o exhibir un rango limitado de movimiento, investigar el problema. Siuna causa definitiva no puede ser establecida y fijada, el animal debe ser sacrificado por los protocolos institucionales. A las 24 h el animal debe recibir otra dosis de carprophen por vía subcutánea a 5 mg / kg. Patas parálisis indica una anastomosis fallado o un trombo. En esta situación, el animal debe ser sacrificado.

Representative Results

La figura 1 muestra un injerto aórtico. Las flechas blancas indican las líneas de sutura. Un injerto de patente mostrará un pulso visible. Figura 2 indica un experimento típico en el que se siguió la supervivencia receptor durante un periodo de 56 días. Un grupo consistía en ratones receptores de tipo salvaje (C57BL / 6 x FVB) transplantados con ratones BALB / c aorta. El otro grupo, designado "KO" se compone de los destinatarios (C57BL / 6 x FVB) deficientes en la expresión de hemo oxigenasa-1, lo que resulta en trombosis de los injertos dentro de 24 hr. En particular, esto resulta en la muerte de todos los receptores como se muestra en la figura. Figura 3 muestra eco mediciones de la IVC y la aorta abdominal en un animal normal y en un receptor de trasplante. Tenga en cuenta que el injerto es patente y similares en apariencia a la aorta no trasplantado.

Figura 1.Una vista de una aorta trasplantado. Las flechas blancas indican las líneas de sutura.

Figura 2. Kaplan-Meier representaciones de supervivencia después del trasplante aórtico en dos grupos de ratones transplantados con la aorta de un ratón BALB / c. "KO" designa los receptores deficientes en la expresión de hemo oxigenasa-1, lo que resulta en trombosis de los injertos aórticos dentro de 24-48 horas. "WT" designa a los compañeros de camada de tipo salvaje. Tomado de: Monóxido de carbono rescata hemo oxigenasa-1-ratones deficientes de trombosis arterial en la aorta trasplante alogénico, Chen B, Guo L, Ventilador C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 con permiso de Elsevier.

Figure 3. Echo formación de imágenes de la vena cava inferior (IVC) y la aorta abdominal in vivo en un ratón normal (panel izquierdo) y en un receptor de trasplante aórtico (panel derecho). Las imágenes fueron producidas con un instrumento Visualsonics Vevo 660. Los asteriscos denotan el lumen de los vasos.

Discussion

Los modelos de ratón de trasplante aórtico proporcionar una serie de ventajas porque los ratones son muy definidas inmunogenéticamente ^9,12,13, y que puedan ser fácilmente manipulados para alterar la expresión de genes específicos, si se desea. Como se ha señalado en la introducción, la cirugía vascular en el ratón es más difícil que la mayoría de los modelos, debido al tamaño de los vasos. Incluso las grandes arterias, tales como la aorta son por lo general no más de 100-200 m de diámetro interior, de modo que la manipulación de estos vasos requiere una cantidad significativa de habilidad y destreza ^8,14. La complicación más común que se observa en este tipo de cirugía en los que empiezan a implementar el sistema está patas traseras parálisis, causada generalmente por trombosis resultante de una lesión de la íntima por una mala manipulación o de sujeción. La mayoría de las abrazaderas comercializados por compañías que venden herramientas adecuadas para microcirugía crear demasiada presión para ser utilizado para los ratones, con presiones normalmente son mayores que 25 gm / cm ^2. La claMPS que utilizamos son suaves, con una presión de 2 gm / cm ^2, una presión que es suficiente para lograr la hemostasia y no dañar los vasos. Algunos cirujanos prefieren utilizar sutura en lugar de grapas. No se recomienda esta práctica debido a que es un método que es altamente dependiente de la habilidad del cirujano a la presión correcta y, en nuestra opinión, pueden contribuir a una menor tasa de éxito. Con la práctica, las tasas de supervivencia de 90% o más se debe esperar.

Técnica de sutura para la anastomosis de extremo a extremo es una habilidad crítica que se adquiere con la experiencia. En función de la experiencia previa con las técnicas quirúrgicas y la destreza manual, la plena capacitación se puede lograr después de 50 a 100 procedimientos. Estudios más recientes sugieren tecnologías alternativas para la anastomosis pueda estar disponible en el futuro ^15.

La limitación principal de este procedimiento es, como la mayoría de los procedimientos de microcirugía en ratones, que un alto nivel de habilidad esnecesario para la ejecución exitosa y personas sin excelentes habilidades de motricidad fina nunca puede alcanzar un alto nivel de competencia. Sin embargo, con la práctica, la mayoría de las personas pueden lograr una supervivencia aceptable. El pequeño tamaño de los tejidos también se traduce en limitaciones adicionales debido a que el tamaño del injerto es muy pequeña, por lo que la cantidad de material para su posterior análisis se limita. La mayor ventaja de este modelo es la inmunogenética bien caracterizados de ratones, la amplia disponibilidad de numerosas cepas puras, los ratones transgénicos y ratones knock-out, permitiendo experimentos muy útiles para abordar mecanismos moleculares in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240