Summary
Användning av Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) för övervakning preklinisk cancerbehandling beskrivs här. Denna metod utnyttjar Cerenkov strålning (CR) och optisk avbildning (OI) för att visualisera radiomärkta prober och ger därmed ett alternativ till PET i preklinisk terapeutisk övervakning och drog screening.
Abstract
I molekylär avbildning, positronemissionstomografi (PET) och optisk avbildning (OI) är två av de viktigaste och därmed mest använda formerna 1-3. PET kännetecknas av utmärkt känslighet och kvantifiering förmåga medan OI är noterbar för icke-strålning, relativt låg kostnad, kort skanning tid, hög genomströmning, och bred tillgänglighet till grundforskare. Men båda metoderna har sina brister också. PET lider av dålig rumslig upplösning och hög kostnad, medan OI är huvudsakligen begränsat till prekliniska applikationer på grund av sin begränsade vävnadspenetration tillsammans med framstående spridning optiska signaler genom tjockleken av levande vävnader.
Nyligen en bro mellan PET och OI har vuxit med upptäckten av Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) 4-6. CLI är en ny avbildning modalitet som utnyttjar Cerenkov strålning (CR) för bilden radionuklider med OI instrument. Ryska Nobel Laureate Alekseyevich Cerenkov och hans kollegor upptäckte ursprungligen CR 1934. Det är en form av elektromagnetisk strålning som utsändes när en laddad partikel färdas med en hastighet superluminal i ett dielektriskt medium 7,8. Den laddade partikeln, vare positron eller elektron, stör det elektromagnetiska fältet i mediet genom att förskjuta elektroner i sina atomer. Efter att ha passerat av störningar fotoner emitteras som de fördrivna elektronerna återgår till grundtillståndet. Till exempel var en 18 F sönderfall uppskattas ge ett genomsnitt på 3 fotoner i vatten 5.
Sedan dess uppkomst har CLI undersökts för dess användning i en mängd olika prekliniska applikationer inklusive in vivo tumöravbildning, reportergen bildbehandling, radiotracer utveckling, multimodalitet avbildning, bl.a. 4,5,9,10,11. Den viktigaste anledningen till CLI har haft stor framgång hittills är att den nya tekniken drar nytta av den låga COst och bred tillgång till OI till bild radionuklider som används för att avbildas endast dyrare och mindre tillgängliga nukleära avbildningsmetoder såsom PET.
Här presenterar vi metoden för att använda CLI för att övervaka cancer läkemedelsterapi. Vår grupp har nyligen undersökt denna nya ansökan och validerade dess genomförbarhet av en proof-of-concept studien 12. Vi visade att CLI och PET uppvisade utmärkta korrelationer mellan olika tumörxenografter och sonder avbildning. Detta överensstämmer med den övergripande principen om CR som CLI huvudsak visualiserar samma radionuklider som PET. Vi valde bevacizumab (Avastin, Genentech / Roche) som vår terapeutiskt medel eftersom det är ett välkänt angiogeneshämmare 13,14. Mognad av denna teknik inom en snar framtid kan tänkas ha en betydande inverkan på preklinisk läkemedelsutveckling, screening, samt terapi övervakning av patienter som får behandling.
Protocol
1. Tumörmodell
- Kultur H460-celler (American Type Culture Collection) i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen Life Technologies). Det bör noteras att de val av cellinjer, medier kultur, platser för ympning, antal xenograft per mus, och andra överväganden är alla anpassas till målen för en viss studie. Här kommer vi bara presentera ett specifikt projekt utformning för att tjäna som en illustration.
- Behåll cellinjer i en fuktad atmosfär av 5% CO 2 vid 37 ° C och förändring till färskt medium varannan dag.
- När en 75% sammanflytande monoskikt av celler bildas, lossa monolagret med trypsin och dissociera cellerna till en enda cellsuspension för ytterligare cellodling.
- Suspendera ca 1 x 10 6 H460 celler i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Invitrogen) och implantatet subkutant ibåde vänster och höger axlar nakna möss (honkön atymiska nakna möss (nu / nu), 4 - 6 veckor gamla, Charles River Laboratories, Inc.).
- Tillåt tumörer att växa till 150 - 200 mm 3. Det tar ca 2 veckor för H460 tumörxenografter att växa till denna storlek. Standard tjocklek Mätningen utförs för att spåra tumörstorlekar.
- När tumörerna når den ideala storleken på tumörbärande möss är nu redo för behandling och in vivo avbildning genom både PET och CLI.
2. PET
- Utför PET-studier enligt detta schema eller någon variant av det beroende på det specifika projektet (figur 1) 12. Ett antal faktorer kan påverka utformningen av schemat, inklusive, men inte begränsat till, val av tumörlinjer xenograft cell, cancer läkemedel och doseringsregimer. Här kommer vi bara presentera en specifik avbildning schema. De CLI studierna ska utföras i enlighet medsamma schema som de i PET-studier, med CLI utförs omedelbart efter motsvarande PET. Det bör också noteras att syftet med PET-studier är främst för validering av CLI resultat. För vanliga användare som bara vill använda OI instrument för avbildning radiomärkta prober, ingen PET nödvändig. Men om man gör validering önskar PET bör understrykas att PET och CLI instrument måste placeras inom mycket nära för validering ska lyckas på grund av den korta halveringstiden på 18 F (109,77 min).
- Dela upp möss i behandlings-och kontrollgrupper (n ≥ 3 vardera). Behandla möss i behandlingsgruppen med 2 injektioner av bevacizumab av 20 mg / kg på dag 0 och 2. Dag 0 definieras av den första injektionen. Observera att på dag -1 en pre-scan bör utföras via både PET och CLI.
- Små djur PET av tumörbärande möss skall utföras med en R4 gnagarmodell skanner (Siemens Medical Solutions USA, Inc.).
- Bedöva alla möss med 2% isofluran (Aerrane, Baxter) och injicera med 3'-deoxi-3'-18 F-fluortymidin (18 F-FLT, 7,3 till 8,0 MBq [198 till 215 pCi]) via svansvenen. Den PET-proben är spädas i PBS före injektion.
- Efter 1 timme, söva möss igen och placera bedövade möss benägna och nära centrum av synfältet för den lilla djuret PET-kamera.
- Skaffa tre-minuten statiska skannar och rekonstruera bilder från en 2-dimensionell beställt-delmängder förväntan maximal algoritm. Bakgrund korrigering inte är nödvändig.
- Rita områden av intresse (ROI, 5 pixlar för koronala och tranaxiellt skivor) över tumörerna på förfall-korrigerade hela kroppen koronala bilder. Erhålla den maximala pulser per pixel per minut från ROI och konvertera till pulser per milliliter per minut genom användning av en kalibreringskonstant. Med antagandet om en vävnad densitet av 1 g / ml, konvertera ROI för räknasper gram per minut. Bestäm image ROI-härledda% ID / g värden genom att dividera counts per gram per minut genom injicerad dos. Dämpning korrigering inte är nödvändig.
3. CLI
- CLI är att utföras med ett IVIS Spectrum systemet (Caliper Life Sciences). Förvärv och analys av bilder som ska utföras med levande bild 3,0 programvara (Caliper Life Sciences). Våglängd-resolved spektral avbildning är att utföras med användning av en 18-set smalbandigt emissionsfilter (490 till 850 nm). Återigen, för varje mus, utför CLI omedelbart efter PET för att minimera mängden av radioaktivt sönderfall om PET-studier ingår i protokollet.
- Placera djur i en ljustät kammare under isoflurananestesi. Flera möss kan placeras samtidigt för att öka genomströmningen.
- Acquire bilder med 3 tid min exponering (f / stop = 1, binning = 4). Använd samma belysning inställningar (lampspänningen, filter, f / stop, synfält, Binnning) att förvärva samtliga bilder. Använd den dorsala hudområdet att beräkna signalintensiteten av bakgrund vävnad. Normalisera fluorescensemission till fotoner per sekund per kvadratcentimeter per steradian (P / S / cm 2 / sr).
4. Representativa resultat
Visuell jämförelse mellan CLI och PET-bilderna kan lätt utföras. Efter att ena skalan bar över bilder från samma modalitet och plats CLI och PET bilder sida vid sida kan man se i den här representativ panel (Figur 2A) att både CLI och PET avslöjade signifikant minskade signaler från H460 xenograft i behandlade möss från förbehandling till dag 3, vilket tyder på signifikant terapeutisk effekt. Som en jämförelse, var måttligt ökade till oförändrade signaler observerades i obehandlade möss under samma tidsperiod (data ej visade). Genom visuell inspektion ensam kan man konstatera att det finns en god konsistens mellan tumör kontraster som är visuelltized från CLI och PET. I själva verket har denna visuella korrelationen tillräcklig upplösning för att visa central nekros av tumören sekundärt till den cancer behandling (Jämför gärna CLI och PET-bilderna från Dag 3). Att validera imaging fynd kvantifieringar och korrelationsanalys kan utföras.
Kvantifieringar av CLI och PET bilder och en enkel montering via linjär regression visade att de två formerna verkligen hade en utmärkt korrelation (figur 2B, R2 = 0,9309 för 18 F-FLT sonderade behandlingsgrupp). Noterbart i alla våra CLI och PET-studier avbildning med olika tumörmodeller och olika cancer läkemedel sluttningarna av anfall är också anmärkningsvärt nära, vilket tyder på en utmärkt passning av linjär regression även om alla data konglomerade (data visas inte). Båda representativa bilder är anpassade från vår tidigare publikation 12.
er.within-page = "alltid"> 
Figur 1. Schematisk av experimentell design av PET och CLI studier. Tumörer implanterades bilateralt i skulderpartiet och fick växa till 150-200 mm 3, och tumörbärande möss utsattes för in vivo-avbildning via PET och CLI vid dag -1, 1, och 3. Bevacizumab behandling utfördes med 2 injektioner av 20 mg / kg på dagarna 0 och 2.
Figur 2. (A) In vivo CLI och PET bilder av möss med H460 xenografter behandlade med bevacizumab före behandling (pre-scan) och efter behandling (dag 3). (B) motsvarande kvantitativa analys av CLI-och PET-resultat (n = 3) och deras korrelationer. Bilder anpassas från (6).arge.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI framstår som en lovande molekylär avbildning teknik som har funnit möjligheter i många grundläggande applikationer forskningsinstitut och även kliniska användning 4,5,15,16,17. De stora fördelarna med CLI jämfört med traditionella nukleära avbildningsmetoder såsom PET härrör från användningen av OI instrument som är lättare att använda, som kännetecknas av korta förvärv och hög genomströmning, betydligt billigare och mer allmänt tillgängliga för forskare. Dessutom vad som skiljer CLI bortsett från OI i allmänhet är dess användning av β-emitterande märkta molekyler som avbildning sonder, av vilka många har godkänts av Food and Drug Administration (FDA), till skillnad från traditionella OI medel. Med dessa unika och önskvärda egenskaper, har CLI samlat snabbt uppmärksamhet från området molekylär avbildning. Men dess potential i prekliniska och kliniska tillämpningar ännu inte helt utredda.
Cancerterapi övervakning är ett av de områdendär CLI kan ha några betydande nytta. Det är ett mycket viktigt område som är nyckeln till sond utveckling, drog screening och även skräddarsy cancer behandling för patienterna. För närvarande är prekliniska cancerbehandling övervakning som genomförts nästan uteslutande via nukleära avbildningsmetoder såsom PET. Därför CLI ger ett mycket attraktivt alternativ till PET, särskilt med tanke på att det finns en utmärkt korrelation mellan CLI och PET-bilder. Ändå, ligger en annan fördel av CLI för terapi övervakning i det faktum att CLI kan bilden inte bara β +-emittrar, utan även β - sändare såsom 32 P, 90 Y och 131 jag, vilka alla är kliniskt relevanta.
Dock är CLI inte utan brister. Beroendet av OI instrument kräver att CLI lider vissa brister som är inneboende i optisk avbildning som signaldämpning och spridning i levande vävnader. Dessutom, den speciella spektrum avCR resulterar också i begränsad signalintensitet och därefter, den djupare signalen från kroppsytan, den lägre känslighet och den sämre kvantifieringen förmåga 6. Men medan bristerna kan ses som betydande, kan en förbi i hög grad dessa hinder i den prekliniska forskningen genom att använda små djur såsom möss. Ännu viktigare, det finns minst ett par kliniska områden som potentiellt kan dra nytta av CLI cancerbehandling övervakning. Övervakning ytliga sjukdomar enheter såsom dermatologiska inflammatoriska tillstånd och cancer kan tjäna som ett bra exempel. Dessutom, sjukdom enheter som djupt ännu nås med laddningskopplad anordning eller fiberoptiska tekniker kan använda utmärkt känslighet och kvantifiering förmåga CLI också. Ännu en spännande möjlighet ligger i att använda CLI för att hjälpa kirurgen erhåller anatomisk och funktionell information om tumörer i operationssalen. Två nya proof-of-concept studör har visat detektering och resektion av tumörer hos möss med intraoperativa tack bildstyrning vare CLI 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd från National Cancer Institute (NCI) R01 CA128908 och Stanford Medical Scholar Research Fellowship. Ingen annan potentiell intressekonflikt relevant för den här artikeln har rapporterats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H460 Cell Line | American Type Culture Collection | ATCC Number: HTB-177 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen Life Technologies | 12633-012 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10091-148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15640-055 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Life Technologies | 10010-023 | |
| Female Athymic Nude Mice | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 088 | |
| Bevacizumab (Avastin) | Genentech/Roche | N/A | |
| MicroPET Rodent R4 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | N/A | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | Baxter Number: AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper Life Sciences | N/A |
References
- Weissleder, R., Mahmood, U.
- Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70 (2011).
- Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470 (2010).
- Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355 (2009).
- Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009 (2011).
- Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451 (1934).
- Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378 (1937).
- Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505 (2010).
- Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863 (2010).
- Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312 (2012).
- Ellis, L. M.
- Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
- Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300 (2010).
- Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441 (2010).
- Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321 (2011).
- Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177 (2011).
- Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).
