Summary
O
Abstract
O olho composto de Drosophila melanogaster é composto por cerca de 750 omatídeos (olhos de unidades). Cada omatídeo é composto de cerca de 20 células, incluindo as células secretoras de lente de cone, as células de pigmento, uma célula de cerdas e oito fotorreceptores (RP) R1-R8 2. A RP têm estruturas especializadas microvilares, os rhabdomeres, que contêm pigmentos sensíveis à luz, os rodopsinas (RHS). Os rhabdomeres de seis PRs (R1-R6) formar um trapézio e conter Rh1 3 4. Os rhabdomeres de R7 e R8 são posicionadas em conjunto no centro do trapézio e partilhar o mesmo caminho de luz. R7 e R8 PRs estocasticamente expressar diferentes combinações de RHS em dois principais subtipos 5: Em subtipo 'p', RH3 em p R7s é acoplado com RH5 em p R8s, enquanto no subtipo do 'y', RH4 em y R7s está associada RH6 em y R8s 6 7 8.
As primeiras especificações de RP e desenvolvimento de omatídeos começa no disco de olhos antenal larval imaginal, uma monocamada de células epiteliais. Uma onda de diferenciação varre o disco 9 e inicia a montagem de células indiferenciadas em omatídeos 10-11. R8 a "célula fundador 'é especificada primeiro e recruta R1-6 e depois R7 12-14. Posteriormente, durante o desenvolvimento pupal, diferenciação PR leva a grandes mudanças morfológicas 15, incluindo a formação rhabdomere, sinaptogênese e expressão eventualmente rh.
Neste protocolo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos definidos de desenvolvimento da retina, o que pode ser aplicada para resolver uma variedade de questões relativas à formação da retina e vias de desenvolvimento. Aqui, usamos esses métodos para visualizar a diferenciação PR gradual no nível de uma única célula em toda montagem larval, midpupal e retinas adulto (
Protocol
1. Introdução
Neste vídeo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos de desenvolvimento definidos: o terceiro ínstar, o midpupal ea fase adulta. Embora nosso protocolo também funciona para outras fases de pupa (para mais detalhes sobre etapas anteriores, consulte 16), que escolheu o palco midpupal, pois é ideal para imagens de todos os PRs em um plano focal e seus núcleos são facilmente identificáveis, o que facilita a visualização de padrões de expressão do factor de transcrição. A dissecção da retina de pupa tardia é muito semelhante à dissecção de retinas adultas.
Primeiro, vamos demonstrar como coleta de larvas e pupas em estágios desejados. Então, vamos explicar como obter dissecções ideais de larvas 17-18, midpupal e retinas adultas. Em segundo lugar, demonstrar como visualizar o desenvolvimento PR nestas fases usando microscopia confocal e imunohistoquímica.
O período de desenvolvimento dos insetos é dependente da temperatura. Para facilitar o preparo reprodutível de larvas e pupas, recomendamos levantar todas as ações da mosca a 25 ° C sob uma hr/12 hr 12 ciclo de luz / escuridão.
Terceiro-larvas: Cerca de 96 horas após a postura de ovos (a 25 ° C), final do terceiro instar alimentação parada larvas e vagar nas paredes do frasco de alimentos, onde eventualmente pupate. Use uma escova macia ou uma pinça para remover suavemente a vaguear larva do terceiro instar da parede do frasco de alimentos.
Pupas de 50% ('midpupae') são observados cerca de 48 horas após a fase de pupa. Para o tempo exato, você pode circular apenas formado pupas branco com um marcador no frasco de alimentos. Alternativamente, mova todos pupas branco para um novo frasco para obter um frasco de teste uniforme (para teste de pupas utilizando critérios morfológicos, consulte 19). Depois de 48 horas, cuidadosamente reaisove o midpupae do frasco usando uma pinça.
Moscas adultas: anestesiar moscas adultas jovens (2-5 dias após a eclosão) sobre uma almofada de CO 2. Remover cabeças usando uma pinça e armazená-los em um copo bem gelado prato contendo 1x PBS.
3. Procedimento dissecção (cerca de 1-2 horas por Experiment)
Após a coleta da amostra, coloque-os em uma gota de PBS gelado em um prato dissecção Sylgard. Dissecar cerca de 10-15 retinas por genótipo.
Por favor, consulte as Fichas de Segurança, bem como Saúde Ambiental de sua instituição e Secretaria de Segurança para o correcto manuseamento dos reagentes e equipamentos (ver tabelas ao final deste protocolo).
1. Larval Discos Eye imaginárias
- Localizar a extremidade anterior da larva, que contém os ganchos de boca. Use uma pinça para pressionar a parte do meio da larva suavemente contra a base do prato Sylgard. Use another uma pinça para agarrar os ganchos na boca e puxe devagar e com cuidado para fora do corpo. Descarte a parte principal do corpo e usar os aparelhos bucais para segurar a parte anterior a fim de remover o tecido estranho a partir dos discos imaginais que permanecem em anexo para o cérebro.
- Transferir cérebro com discos imaginais, agarrando os ganchos na boca com um fórceps para 1x PBS em um prato de vidro de três poços. Executar o passo de fixação (passo 4.1.).
- Após a fixação, remover as glândulas salivares, tecido adiposo e puxe o cérebro para longe do disco imaginal olho-antenais. Para melhorar a acessibilidade dos "difíceis" anticorpos, a membrana peripodial, que está localizado sobre a superfície do epitélio, podem ser removidos, mantendo-se a parte da antena do disco e descamação da membrana fora com um pino de dissecação. Em seguida, execute imuno-histoquímica (passo 5.1.).
2. 50% pupação / Midpupal Retinas
- Segurar extremidade posterior do processo de pupa com um fórceps.Remover suavemente a superfície anterior do caso de pupa, agarrando a cutícula com outros fórceps e lentamente se afastar do pupário. Descascar cutícula residual para expor a cabeça.
- Use as pontas dos fórceps "para furar o saco, subjacente mole na região dorsal anterior. Isto permite o acesso à cabeça. Suavemente separar a cabeça do tórax por lentamente sugando a cabeça com uma pipeta P20. Expulsar cabeça de ponta da pipeta limpa e fria 1x PBS e remover o excesso de tecido; agarrar a cutícula cabeça e remover tromba. Prossiga para a etapa de fixação (passo 4.1.).
- Pierce lóbulo da óptica com um pino para dissecar tecido estável. Inserir o outro pino de dissecação entre a lâmina e da retina para separar a retina a partir da lâmina / lóbulo óptico. Executar imunohistoquímica (passo 5.1.).
3. Olhos Adultos
- Pegue o centro da cápsula posterior da cabeça com uma pinça e remover partes da boca (tromba), TISS gorduraue e traquéia.
- Agarre a cutícula cabeça dorsal com uma pinça e usar o outro para separar os olhos do tecido cerebral, puxando levemente para o lado. Na maioria dos casos, a lâmina, uma bainha fina e transparente de neuropil cérebro, vai ficar ligado à retina. É mais fácil remover a lâmina após a fixação.
- Remover cutícula na margem do olho, mas deixam um pequeno pedaço trás para facilitar a transferência de retinas de soluções diferentes. Executar fixação (passo 4.1.).
- Remover a lâmina, agarrando-o de um lado com uma pinça e puxando para o lado com a pinça outros sem prejudicar a retina. Remover cutícula residual, uma vez que pode dobrar na retina durante a montagem. Estes dois passos são críticos para a visualização de fotorreceptores, que de outro modo seria obscurecido pela lâmina e restos de cutícula durante o processo de criação de imagens. Proceder à imuno-histoquímica (passo 5.1.).
4. Fixação e Washing (cerca de 1 hora)
- Armazenar as retinas dissecadas em 1x PBS em um prato de vidro de três bem colocada em gelo durante a preparação do fixador fresco (diluído 40 microlitros de solução de formaldeído a 37% com 360 ul de PBS 1x, vórtice e armazenar em gelo). Recomendamos para prosseguir com o protocolo de fixação e para evitar tempos de armazenamento longos em gelo (> 15 min).
- Substituir 1x PBS com 200 ul de solução de formaldeído a 3,7%. Certifique-se de que o tecido é submergido em fixador. Isto é crítico, pois de outro modo não pode ser fixado correctamente. Se for necessário, remover as bolhas de ar e as traqueias com a pinça.
- Incubar em agitador durante 15 min à temperatura ambiente.
- Substituir fixador com 1x PBS e lavar duas vezes com PBS 1x. Continuar a lavagem em PBS durante 30 min (no agitador, à temperatura ambiente).
- Substituir PBS com PBST. Lavar duas vezes com PBST.
- Proceder com a remoção da membrana peripodial a partir de discos de olho larvais (3.1.3.) E as lâminas de midpupal / adulto retinas <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Imunohistoquímica
- Bloqueio: Substituir PBS com 200 ul de 5% de soro normal em PBST e retinas incubar durante 20 min em agitador à temperatura ambiente.
- Substituir solução de bloqueio com uma solução de anticorpo primário. Selar o prato três bem com parafilm e incuba-se durante a noite no agitador à temperatura ambiente.
- Substituir solução com PBST e lavar 3 vezes. Continuar a lavagem com PBST durante um mínimo de 1 hora no agitador à temperatura ambiente.
- Transferência de solução de anticorpo secundário, e incubar em um prato de vidro selado parafilme bem no agitador durante a noite à temperatura ambiente.
- Substituir solução de anticorpo com PBST e lavar três vezes. Continuar a lavagem com PBST durante um mínimo de uma hora no agitador à temperatura ambiente. As amostras podem ser mantidas em PBST durante vários dias, mas que é crucial para adicionar PBST fresco pelo menos uma vez por dia para evitar que sequem.
6. Montar
- Para a montagem de retinas larval e midpupal, utilize a P20 para transferir retinas para o centro de uma lâmina de vidro limpa. Remover o excesso de PBST. Use uma pinça para alinhar retinas, a fim de facilitar a criação de imagens.
- Adicionar 10 ul de meio de montagem por cima das retinas. Cubra-os suavemente com um pedaço 24x40-1 de cobertura e vedação com unha polonês claro.
- Para montagem retinas adultas, preparar 'pontes' 20: Adicione duas gotas de 5 ul de glicerol a 50% em ambas as extremidades de um lado vidro e cobri-los com folhas de 22x22-1 de cobertura (0,13 a 0,17 milímetros de espessura).
- Retire o PBST com uma pipeta P20, certifique-se de que as retinas não secar. Adicionar 20 ul de meio de montagem para o poço. Use meio de montagem para transferir retinas com o P20 para a lâmina de vidro "ponte".
- Use uma pinça para orientar (lentes deve estar virada para a lâmina de vidro) e alinhar retinas, a fim de facilitar a criação de imagens. Se for necessário, remover as bolhas de ar com o P20.
- Lentamentedeslizamento lugar 24x40-1 cobertura (0,13 a 0,17 milímetros de espessura) de um lado em cima e as bordas de vedação com unha polonês claro ou fita adesiva. Armazenar as amostras a 4 ° C numa caixa de lâminas de microscópio saver (manter no escuro).
7. Resultados representativos
Como exemplo para a aplicação deste protocolo, mostramos resultados representativos para visualizar a diferenciação de fotorreceptores nos três estágios de desenvolvimento no vídeo. Um disco de olho-antenais larval e uma retina midpupal foram corados com anticorpos que rotular diferentes tipos de fotorreceptores durante o seu desenvolvimento (Figura 1A, B) e um retina adulta foi corado com dois anticorpos rodopsina para visualizar dois subtipos de fotorreceptores (Figura 1C).
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Discussion
1. Solução de problemas
Em nossa experiência, dissecções requerem prática (várias semanas) e são facilitados por alcançar uma posição confortável da mão 21 por descansar os cotovelos e antebraços sobre a mesa e com os dedos fazendo contato com o prato dissecção. Dedos Dessa forma, apenas os polegares o índice e meio realizar movimentos sutis.
Remover a lâmina sem danificar os fotorreceptores é provavelmente o passo mais desafiador. Prática com os olhos vermelhos tipo selvagem voa antes de dissecar branco de olhos mutantes, como a lâmina é muito mais fácil de ver contra a pigmentação de olhos vermelhos. Além disso, usar iluminação por trás e um fundo escuro abaixo do prato dissecção para obter um contraste ideal.
No entanto, o pigmento vermelho dos olhos é fluorescente e pode causar um fundo elevado durante o processo de criação de imagens. Isto pode enfraquecer os sinais a partir dos anticorpos secundários. Uma boa estratégia é keep lavar as retinas adultas de quatro a cinco dias e para substituir a solução de lavagem com PBST fresco pelo menos uma vez por dia. O pigmento será lavado para fora, não se esqueça de lavar genótipos experimentais e controle para a mesma duração.
2. Aplicações
Olho-specific perda e de ganho de função-aproxima 22 23 fazer o olho de Drosophila um sistema particularmente eficaz para manipulações genéticas e telas. Além disso, recentemente desenvolvidos métodos computacionais para a análise de uma única célula em reconstruções 3D de retinas inteiras permitir a análise de fenótipos mutantes em alta resolução 24. Este protocolo pode, portanto, ser aplicado a uma variedade de questões sobre o desenvolvimento do olho e os mecanismos subjacentes reguladoras 16,25-28.
Figura 1. M todo Retinalounts em três diferentes fases do desenvolvimento. A) disco olho larval imaginal marcadas com anticorpos contra a Seven-up (verde) e Runt (magenta). B) Midpupal retina. Dois anticorpos foram usados para visualizar todos os fotorreceptores R1-R8 (Elav, azul) e R7 fotorreceptores (Prospero, ciano). C) retina adulta. Expressão estocástica e mutuamente exclusiva de pigmentos fotossensíveis RH5 (ciano) e RH6 (vermelho) em dois subtipos de fotorreceptores R8.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Ehrman para HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para a comunhão de Pesquisa Médica de pós-doutorado para RJJ, NIH Grant F32EY016309 para DV, bolsa de Nova York University Dean Dissertação de DJ, NIH GrantR01 EY13010 em CD e uma bolsa DFG a JR (RI 2208/1- 1). Agradecemos Nina Vogt e Pamela Boodram para comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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