Summary
La
Abstract
L'œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d'environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d'environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 3 4. Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux 5: Dans le sous-type 'p', p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type 'y', y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S 6 7 8.
Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque 9 et déclenche l'ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies 10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d'importantes modifications morphologiques 15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d'expression finalement rh.
Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines (
Protocol
1. Introduction
Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d'autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir 16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l'imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux sont facilement identifiables, ce qui facilite la visualisation des les modèles d'expression de facteurs de transcription. La dissection des rétines fin nymphe est très similaire à la dissection des rétines adultes.
Tout d'abord, nous montrer comment recueillir les larves et les nymphes aux étapes souhaitées. Ensuite, nous expliquons comment obtenir des dissections optimales de larves 17-18, midpupal et rétines adultes. Deuxièmement, nous démontrons comment visualiser développement PR à ces étapes en utilisant la microscopie confocale et immunohistochimie.
La période de développement des insectes est dépendant de la température. Afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et des nymphes, nous vous recommandons de soulever tous les stocks de mouche à 25 ° C sous un 12 h/12 h de lumière / obscurité cycle.
Troisième stade larvaire: Environ 96 heures après la ponte (à 25 ° C), à la fin du troisième stade d'arrêt d'alimentation des larves et se promener sur les parois du flacon alimentaire, où ils finissent par se nymphosent. Utilisez une brosse douce ou une pince pour enlever délicatement une errance de troisième stade larvaire de la paroi du flacon de nourriture.
Pupes de 50% («midpupae ') sont observées environ 48 heures après la nymphose. Pour timing exact, vous pouvez entourer juste formé pupes blanc avec un marqueur sur le flacon de nourriture. Vous pouvez également déplacer les pupes blanc à un nouveau flacon pour obtenir un flacon de mise en scène uniforme (pour la stadification des pupes à l'aide des critères morphologiques, voir 19). Après 48 heures, bien réelsove l'midpupae du flacon à l'aide d'une pince.
Les mouches adultes: anesthésier les mouches adultes jeunes (2-5 jours après l'éclosion) sur un pad CO 2. Enlever les têtes à l'aide d'une pince et de les stocker dans un verre bien plat froid contenant du PBS 1x.
3. Procédure Dissection (À propos de 1-2 heures par expérience)
Après la collecte du spécimen, les placer dans une goutte de PBS froid sur un plat de dissection Sylgard. Disséquer environ 10-15 rétines par génotype.
S'il vous plaît consulter les fiches signalétiques ainsi que la santé environnementale de votre institution et sécurité pour la manipulation des réactifs et du matériel (voir les tableaux à la fin de ce protocole).
1. Disques yeux larvaires Imaginal
- Localiser l'extrémité antérieure de la larve, qui contient les crochets buccaux. Utilisez une pince à appuyer sur la partie centrale de la larve doucement contre le fond du plat Sylgard. Utilisez another Pince pour saisir les crochets buccaux et tirez doucement et lentement loin du corps. Jeter la partie principale du corps et utiliser les pièces buccales pour maintenir la partie antérieure afin d'éliminer les tissus étrangers à partir des disques imaginaux qui restent attachées au cerveau.
- Transfert du cerveau avec des disques imaginaux en saisissant les crochets buccaux avec une pince à 1x PBS dans une cuve en verre de trois puits. Effectuez l'étape de fixation (étape 4.1.).
- Après fixation, enlever les glandes salivaires, le tissu adipeux et tirez le cerveau loin du disque œil-antennaire imaginale. Pour améliorer l'accessibilité des anticorps "difficiles", la membrane peripodial, qui se trouve sur la surface de l'épithélium, peut être enlevé en appuyant sur la partie du disque antennaire et le pelage de la membrane de distance avec une broche de dissection. Ensuite, effectuez l'immunohistochimie (étape 5.1.).
2. 50% nymphose / Midpupal Rétines
- Tenez extrémité postérieure de la coque de nymphose avec une pince.Retirez délicatement la surface antérieure de la coque de nymphose en saisissant la cuticule avec un autre pince et tirer lentement loin de la pupe. Décollez cuticule résiduelle pour exposer la tête.
- Utilisez les conseils forceps »pour percer le sous-jacent, sac mou dans la région dorsale antérieure. Ceci permet d'accéder à la tête. Séparez délicatement la tête du thorax par aspirer lentement la tête avec une pipette P20. Expulser la tête de la pointe de la pipette dans du PBS frais froid 1x et enlever l'excès de tissu; saisir la cuticule tête et retirer trompe. Passez à l'étape de fixation (étape 4.1.).
- Percer le lobe optique avec une broche de dissection pour stabiliser le tissu. Insérer la goupille d'autres dissection entre la lame et la rétine de séparer la rétine de la lame / lobe optique. Effectuer immunohistochimie (étape 5.1.).
3. Yeux adultes
- Prenez le centre de la capsule postérieure de la tête avec une pince et retirer des pièces buccales (trompe), Tiss graisseue et trachées.
- Prenez la cuticule dorsale tête avec une pince et utiliser l'autre pour séparer les yeux du tissu cérébral en tirant doucement sur le côté. Dans la plupart des cas, la lame, une gaine mince et transparente des neuropile cerveau, restera attaché à la rétine. Il est plus facile d'enlever la lame après fixation.
- Retirer cuticule à la marge œil, mais laisser un petit morceau arrière pour faciliter le transfert de la rétine à des solutions différentes. Effectuer la fixation (étape 4.1.).
- Retirer la lame en le saisissant sur un côté avec une pince et tirant légèrement sur le côté avec les pinces autres sans nuire à la rétine. Retirer cuticule résiduelle, car il pourrait se replier sur la rétine lors du montage. Ces deux étapes sont essentielles pour la visualisation de photorécepteurs, qui, autrement, seraient masqués par la lame et reste de la cuticule pendant le processus d'imagerie. Passez à l'immunohistochimie (étape 5.1.).
4. Fixation et Washing (environ 1 h)
- Stocker les rétines disséqués dans du PBS 1x dans un plat en verre de trois puits placé sur la glace tout en préparant le fixateur frais (dilué 40 microlitres de solution de formaldéhyde à 37% avec 360 ul de PBS 1x, vortex et stocker de la glace). Nous vous recommandons de procéder à la fixation de protocole et d'éviter les longues périodes d'entreposage sur glace (> 15 min).
- Remplacer 1x PBS avec 200 pi de solution de formaldéhyde à 3,7%. Assurez-vous que le tissu est immergé dans un fixateur. Cela est essentiel, car il ne peut être autrement fixé correctement. Si nécessaire, enlever les bulles d'air et les trachées avec la pince.
- Incuber sur agitateur pendant 15 min à température ambiante.
- Remplacer fixateur avec 1x PBS et rincer deux fois avec du PBS 1x. Continuer lavage dans du PBS pendant 30 min (le shaker, à la température ambiante).
- Remplacer PBS avec du PBST. Rincer deux fois avec du PBST.
- Procéder à l'enlèvement de la membrane peripodial de disques yeux larvaires (3.1.3.) Et les lamelles de midpupal / adulte rétines <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunohistochimie
- Blocage: Remplacer PBS avec 200 pi de sérum normal de 5% dans du PBST et incuber rétines pendant 20 min sur agitateur à température ambiante.
- Remplacer la solution de blocage avec une solution d'anticorps primaire. Sceller le plat de trois puits avec du parafilm et incuber une nuit sur agitateur à température ambiante.
- Remplacer la solution avec du PBST et rincer 3 fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum de 1 heure sur agitateur à température ambiante.
- Transfert dans une solution d'anticorps secondaire et incuber dans un plat en verre scellé parafilm et le shaker nuit à température ambiante.
- Remplacer solution d'anticorps avec PBST et rincer trois fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum d'une heure sur agitateur à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBST pendant plusieurs jours, mais il est essentiel d'ajouter PBST frais au moins une fois par jour pour les empêcher de se dessécher.
6. Montage
- Pour le montage rétines larvaires et midpupal, utilisez la P20 pour transférer les rétines au centre d'une lame de verre propre. Retirer l'excès PBST. Utiliser une pince à aligner la rétine en vue de faciliter l'imagerie.
- Ajouter 10 ul de milieu de montage sur le dessus de la rétine. Recouvrez-les délicatement avec un glissement 24x40-1 couvercle et le joint avec du vernis à ongles transparent.
- Pour montage rétines adultes, préparer des «ponts» 20: Ajoutez deux gouttes 5 ul de glycérol à 50% sur les deux extrémités d'un côté verre et recouvrez-les avec des lamelles de 22x22-1 (0,13 à 0,17 mm d'épaisseur).
- Retirez le PBST avec une pipette P20, assurez-vous que les rétines ne se dessèchent pas. Ajouter 20 ul de milieu de montage pour le bien. Utilisez un milieu de montage pour transférer les rétines avec le P20 à la diapositive «pont» en verre.
- Utilisez une pince à orienter (lentilles doivent faire face à la lame de verre) et aligner la rétine afin de faciliter l'imagerie. Si nécessaire, retirer les bulles d'air à la P20.
- Lentementglissement lieu 24x40-1 couvercle (0,13 à 0,17 mm d'épaisseur) d'un côté sur le dessus et sceller les bords avec vernis à ongles ou du scotch. Conserver les échantillons à 4 ° C dans une boîte lame de microscope économiseur (garder dans le noir).
7. Les résultats représentatifs
A titre d'exemple de l'application de ce protocole, nous montrons des résultats représentatifs pour visualiser la différenciation des photorécepteurs dans les trois stades de développement dans la vidéo. Une larve eye-antennaire disque et une rétine midpupal ont été colorés avec des anticorps qui étiqueter types différents photorécepteurs au cours de leur développement (figure 1A, B) et une rétine adulte a été coloré avec des anticorps Rhodopsin deux sous-types de visualiser deux photorécepteurs (figure 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Dépannage
D'après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main 21 par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils.
Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs est probablement l'étape la plus difficile. Pratique avec les yeux rouges de type sauvage vole d'abord avant de disséquer mutants aux yeux blancs, comme la lame est beaucoup plus visible sur la pigmentation des yeux rouges. Vous pouvez également utiliser l'éclairage par l'arrière et un fond sombre en dessous de la boîte de dissection pour obtenir un contraste optimal.
Toutefois, le pigment des yeux rouges est fluorescent et peuvent causer de fond élevé au cours du processus d'imagerie. Cela peut affaiblir les signaux des anticorps secondaires. Une bonne stratégie consiste à keep laver les rétines adultes pour quatre à cinq jours et de remplacer la solution de lavage avec PBST frais au moins une fois par jour. Le pigment est lavé, n'oubliez pas de laver génotypes expérimentaux et de contrôle pour la même durée.
2. Applications
Eye-spécifique de perte et de gain-de-fonction se rapproche de 22 23 faire de l'œil chez la drosophile un système particulièrement performant pour les manipulations génétiques et les écrans. De plus, récemment mis au point des méthodes de calcul pour analyse unicellulaire dans les reconstructions 3D des rétines entières permettre l'analyse des phénotypes mutants à haute résolution 24. Ce protocole peut donc être appliquée à une variété de questions concernant le développement des yeux et les mécanismes sous-jacents de réglementation 16,25-28.
Figure 1. Rétine m entierontants à trois différents stades de développement. Un disque) imaginale des larves oeil colorées avec des anticorps contre le Seven-up (vert) et Runt (magenta). B) Midpupal rétine. Deux anticorps ont été utilisés pour visualiser toutes les photorécepteurs R1-R8 (Elav, bleu) et R7 photorécepteurs (Prospero, cyan). Rétine adulte C). Expression stochastique et mutuellement exclusive de pigments photosensibles RH5 (cyan) et RH6 (rouge) en deux sous-types de photorécepteurs R8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse Ehrman à HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale postdoctorale bourse de JJR, des subventions du NIH F32EY016309 au format DV, Bourse de Thèse Université de New York doyen de DJ, NIH GrantR01 EY13010 de CD et une bourse de recherche DFG à JR (RI 2208/1- 1). Nous remercions Nina Vogt et Pamela Boodram des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
