Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

विच्छेदन और लारवल, पोटा संबंधी और प्रौढ़ immunohistochemistry Published: November 14, 2012 doi: 10.3791/4347
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biology, New York University
* These authors contributed equally

Summary

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की यौगिक आँख के बारे में 750 ommatidia (इकाई आँखों) के होते हैं. प्रत्येक ommatidium लेंस स्रावित शंकु कोशिकाओं, वर्णक कोशिकाओं, एक बाल खड़े सेल और आठ (पीआरएस) photoreceptors R1-R8 2 सहित के बारे में 20 कोशिकाओं से बना है. पीआरएस विशेष microvillar संरचनाओं, rhabdomeres, जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील pigments, rhodopsins (RHS) शामिल है. छह पीआरएस rhabdomeres (R1-R6) एक trapezoid फार्म और 3 RH1 4 होते हैं. R7 और R8 की rhabdomeres अग्रानुक्रम में trapezoid के केंद्र में तैनात हैं और प्रकाश की एक ही पथ का हिस्सा है. R7 और R8 पीआरएस stochastically दो मुख्य 5 उपप्रकारों में RHS के विभिन्न संयोजनों व्यक्त: 'पी' के उप में, Rh3 पी R7s में पी R8s में Rh5 साथ युग्मित है, जबकि 'y उप में, y R7s में Rh4 साथ जुड़ा हुआ है Rh6 y में 8 7 6 R8s.

पीआरएस और ommatidia के विकास के प्रारंभिक विनिर्देश लार्वा आंख antennal imaginal डिस्क, उपकला कोशिकाओं के एक monolayer में शुरू होता है. भेदभाव की एक लहर 9 डिस्क भर sweeps और 10-11 ommatidia undifferentiated कोशिकाओं की विधानसभा में शुरू की है. R8 'संस्थापक सेल' 1 निर्दिष्ट किया जाता है और R1-6 और फिर 12-14 R7 रंगरूटों. इसके बाद, पोटा संबंधी विकास के दौरान, पीआर भेदभाव व्यापक morphological 15 rhabdomere गठन, synaptogenesis और अंततः rh अभिव्यक्ति सहित परिवर्तन, की ओर जाता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम रेटिना रेटिना विकास के तीन से परिभाषित अवधि, जो रेटिना गठन और विकास के रास्ते से संबंधित सवालों की एक किस्म का पता करने के लिए लागू किया जा सकता है और dissections immunohistochemistry के लिए विधियों का वर्णन. यहाँ, हम इन तरीकों का उपयोग करने के लिए पूरे माउंट लार्वा, midpupal और वयस्क retinas में एकल कोशिका के स्तर पर stepwise पीआर भेदभाव कल्पना (

Protocol

1. परिचय

3 instar लार्वा, midpupal और वयस्क चरण: इस वीडियो में, हम रेटिना तीन परिभाषित विकास समय पर और dissections immunohistochemistry के लिए तरीकों का वर्णन. हालांकि हमारे प्रोटोकॉल भी अन्य pupal चरणों (पहले चरण पर जानकारी के लिए, 16) के लिए काम करता है, हम midpupal मंच चुना है, के रूप में यह इमेजिंग के लिए इष्टतम है एक नाभीय विमान और उनके नाभिक में सभी पीआरएस आसानी से पहचाने जा सकते हैं, जो के दृश्य की सुविधा प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति पैटर्न. देर पोटा संबंधी retinas के विच्छेदन बहुत ही वयस्क retinas के विच्छेदन के लिए इसी तरह की है.

सबसे पहले, हम प्रदर्शन कैसे और वांछित चरणों में लार्वा pupae इकट्ठा करने के लिए. तो, हम व्याख्या कैसे प्राप्त करने के लिए 17-18 लार्वा, midpupal और वयस्क retinas के इष्टतम dissections. दूसरा, हम प्रदर्शन कैसे इन immunohistochemistry और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग चरणों में पीआर विकास कल्पना करने के लिए.

कीड़ों के विकास की अवधि के तापमान पर निर्भर है. लार्वा और pupae की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मचान की सुविधा के लिए, हम एक 12 घंटा hr/12 / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत 25 में सभी मक्खी शेयरों डिग्री सेल्सियस को ऊपर उठाने की सलाह देते हैं.

तीसरी instar लार्वा: अंडे बिछाने के बाद लगभग 96 घंटे (25 डिग्री सेल्सियस), देर से 3 instar लार्वा रोक खिला और भोजन शीशी, जहाँ वे अंततः होमकोश्या बन जाना की दीवारों पर भटकना. एक नरम ब्रश या एक संदंश का प्रयोग करने के लिए धीरे खाद्य शीशी की दीवार से एक भटक तीसरे instar लार्वा को दूर करने के लिए.

50% pupae ('midpupae') प्यूपीकरण के बारे में 48 घंटे के बाद मनाया जाता है. सही समय के लिए, आप भोजन शीशी पर एक मार्कर के साथ बस का गठन सफेद pupae सर्कल कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक नई शीशी सभी सफेद pupae को स्थानांतरित करने के लिए वर्दी मचान की एक शीशी (रूपात्मक मानदंड का उपयोग कर pupae के मंचन के लिए, 19 को देखें) प्राप्त करने के. के बाद 48 घंटा, ध्यान लोकलक्षीएक संदंश का उपयोग कर शीशी से midpupae ove.

वयस्क मक्खियों anesthetize एक सीओ 2 पैड पर युवा वयस्क मक्खियों (2-5 दिनों के eclosion के बाद). एक संदंश का उपयोग सिर निकालें और उन्हें एक गिलास में स्टोर के लिए अच्छी तरह से ठंड 1x पीबीएस युक्त पकवान.

3. विच्छेदन की प्रक्रिया (प्रयोग प्रति 1-2 घंटे के बारे में)

नमूना इकट्ठा करने के बाद, उन्हें एक Sylgard विच्छेदन पकवान पर ठंड पीबीएस की एक बूंद में जगह है. जीनोटाइप प्रति 10-15 retinas के बारे में काटना.

सामग्री सुरक्षा डाटा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अभिकर्मकों और उपकरणों के समुचित से निपटने के लिए अपनी संस्था पर्यावरण, स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय शीट्स (इस प्रोटोकॉल के अंत में टेबल देखें) से परामर्श करें.

1. लारवल नेत्र imaginal डिस्क

  1. लार्वा, जिसमें मुंह हुक के पूर्वकाल अंत का पता लगाएँ. एक संदंश प्रयोग Sylgard पकवान के आधार के खिलाफ लार्वा के मध्य भाग धीरे दबाएँ. Anoth का प्रयोग करेंएर मुंह हुक हड़पने के लिए और शरीर से और धीरे धीरे दूर खींच संदंश. शरीर के मुख्य भाग त्यागें और mouthparts का उपयोग करने के लिए पूर्वकाल हिस्सा पकड़ imaginal डिस्क है कि मस्तिष्क के लिए संलग्न रहते से बाहरी ऊतकों को हटाने के क्रम में है.
  2. Imaginal डिस्क के साथ 1x पीबीएस तीन अच्छी तरह से एक गिलास पकवान में एक संदंश के साथ मुंह हुक हथियाने के द्वारा मस्तिष्क स्थानांतरण. प्रदर्शन निर्धारण कदम (4.1 कदम है.).
  3. निर्धारण के बाद, लार ग्रंथियों को निकालने के लिए, वसा ऊतकों और मस्तिष्क आंख - antennal imaginal डिस्क से दूर खींच. 'मुश्किल' एंटीबॉडी की पहुंच में सुधार, peripodial झिल्ली, जो उपकला की सतह पर स्थित है, नीचे डिस्क की antennal भाग पकड़ और झिल्ली एक विदारक पिन के साथ दूर छीलने द्वारा हटाया जा सकता है. अगला, immunohistochemistry (5.1 कदम) करते हैं.

2. 50% / Midpupal प्यूपीकरण retinas

  1. एक संदंश के साथ पोटा संबंधी मामले के पीछे के अंत पकड़ो.धीरे एक और संदंश साथ छल्ली हथियाने से पोटा संबंधी मामले के पूर्वकाल सतह को हटा दें और धीरे puparium से दूर खींच. दूर करने के लिए सिर बेनकाब पील अवशिष्ट छल्ली.
  2. अंतर्निहित पृष्ठीय पूर्वकाल क्षेत्र में नरम बोरी बेध संदंश युक्तियों का उपयोग करें. यह सिर के लिए पहुँच प्रदान करता है. धीरे से छाती से धीरे - धीरे एक P20 विंदुक के साथ सिर चूसने से सिर अलग. ताजा ठंड 1x पीबीएस में विंदुक टिप से सिर को निष्कासित और अतिरिक्त ऊतक को हटाने, सिर छल्ली हड़पने और सूंड को हटा दें. नियतन कदम (4.1 कदम) के लिए आगे बढ़ें.
  3. पियर्स एक विदारक पिन स्थिर ऊतक के साथ ऑप्टिक पालि. लामिना और लामिना / ऑप्टिक पालि से रेटिना अलग रेटिना के बीच अन्य विदारक पिन डालें. प्रदर्शन immunohistochemistry (5.1 कदम).

3. वयस्क आंखें

  1. एक संदंश के साथ पीछे सिर कैप्सूल के केंद्र को पकड़ो और मुँह (सूंड) भागों, वसा tiss हटाue और tracheae.
  2. एक संदंश के साथ पृष्ठीय सिर छल्ली पकड़ो और धीरे बग़ल में खींच द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों से आंखों को अलग करने के लिए अन्य का उपयोग करने के लिए. ज्यादातर मामलों में, लामिना, मस्तिष्क neuropil की एक पतली और पारदर्शी म्यान, रेटिना से जुड़े रहेंगे. यह आसान है निर्धारण के बाद लामिना हटाने.
  3. आँख मार्जिन पर छल्ली निकालें, लेकिन एक छोटा सा टुकड़ा retinas अलग समाधान करने के लिए हस्तांतरण की सुविधा के पीछे छोड़ने के लिए. प्रदर्शन निर्धारण (4.1 कदम है.).
  4. यह एक संदंश के साथ एक पक्ष में हथियाने और अन्य संदंश के साथ धीरे बग़ल में रेटिना आई. बिना खींच द्वारा लामिना निकालें. अवशिष्ट छल्ली निकालें, के रूप में यह रेटिना पर बढ़ते के दौरान गुना सकता है. इन दो चरणों photoreceptors, जो अन्यथा लामिना द्वारा छिप जाएगा और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान छल्ली की बनी हुई है visualizing के लिए महत्वपूर्ण हैं. Immunohistochemistry (5.1 कदम) के लिए आगे बढ़ें.

4. फिक्सेशन और WASHIएनजी (बारे में 1 घंटा)

  1. एक गिलास तीन अच्छी तरह से थाली में बर्फ पर रखा गया है, जबकि ताजा लगानेवाला की तैयारी (1x पीबीएस, और बर्फ पर भंवर दुकान के 360 μl के साथ 37% formaldehyde समाधान के 40 microliters पतला) 1x पीबीएस में dissected retinas स्टोर. हम नियतन प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना है और बर्फ (> 15 मिनट) पर लंबे भंडारण समय से बचने की सलाह देते हैं.
  2. 3.7% formaldehyde समाधान के 200 μl 1x पीबीएस के साथ बदलें. सुनिश्चित करें कि ऊतक लगानेवाला में डूबे हुए है. यह महत्वपूर्ण है, के रूप में इसे अन्यथा ठीक से तय नहीं किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो, संदंश के साथ हवाई बुलबुले और tracheae हटा दें.
  3. हिलनेवाला पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. 1x पीबीएस के साथ लगानेवाला बदलें और 1x पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला. 30 मिनट (हिलनेवाला पर, कमरे के तापमान पर) के लिए पीबीएस में धोने जारी.
  5. पीबीएस PBST साथ बदलें. PBST के साथ दो बार कुल्ला.
  6. लार्वा आंख (3.1.3) डिस्क और / midpupal वयस्क retinas से LAMINAS से peripodial झिल्ली को हटाने के साथ आगे बढ़ें <मजबूत> (3.2.3, 3.3.4).

5. विशेष तकनीक द्वारा ऊतकों में विशिष्ट एन्टिजनों का प्रदर्शन

  1. अवरुद्ध: हिलनेवाला पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 5% PBST और सेते retinas में सामान्य सीरम के 200 μl के साथ पीबीएस बदलें.
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें. Parafilm साथ पकवान तीन अच्छी तरह से सील और हिलनेवाला पर रात भर कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  3. PBST समाधान के साथ बदलें और 3 बार कुल्ला. PBST साथ कमरे के तापमान पर हिलनेवाला पर 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए धोने जारी.
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी और एक गिलास parafilm सील हिलनेवाला पर अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर रातोंरात पकवान में समाधान सेते में स्थानांतरण.
  5. PBST के साथ एंटीबॉडी समाधान बदलें और तीन बार कुल्ला. PBST साथ कमरे के तापमान पर हिलनेवाला पर एक घंटा की एक न्यूनतम के लिए धोने जारी. नमूने PBST में कई दिनों के लिए रखा जा सकता है, लेकिन यह ताजा PBST प्रति दिन कम से कम एक बार जोड़ने के लिए उन्हें बाहर सुखाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.

6. एमounting

  1. लार्वा और midpupal retinas बढ़ते के लिए P20 उपयोग करने के लिए एक साफ़ कांच की स्लाइड के केंद्र retinas हस्तांतरण. अतिरिक्त PBST निकालें. एक संदंश प्रयोग retinas संरेखित करें क्रम में इमेजिंग की सुविधा.
  2. Retinas के शीर्ष पर बढ़ते मध्यम के 10 μl जोड़ें. उन्हें धीरे एक 24x40-1 कवर और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ पर्ची मुहर के साथ कवर.
  3. बढ़ते वयस्क retinas के लिए, 'पुलों' 20 तैयारी: एक गिलास पक्ष के दोनों सिरों पर दो 50% ग्लिसरॉल के 5 μl बूंदों जोड़ें और उन्हें 22x22-1 कवर फिसल जाता है (.१३ 0.17 मिमी मोटी) के साथ कवर.
  4. एक P20 विंदुक के साथ PBST निकालें, यकीन है कि retinas बाहर सूखी नहीं. अच्छी तरह से करने के लिए मध्यम बढ़ते 20 μl जोड़ें. बढ़ते माध्यम का उपयोग करने के लिए 'पुल' गिलास स्लाइड P20 साथ retinas हस्तांतरण.
  5. उन्मुख करने के लिए एक संदंश (लेंस गिलास स्लाइड का सामना करना चाहिए) का उपयोग करें और retinas पंक्ति क्रम में इमेजिंग की सुविधा. यदि आवश्यक हो, P20 के साथ हवाई बुलबुले को दूर.
  6. धीरे - धीरेजगह एक तरफ से 24x40-1 (.१३ 0.17 मिमी मोटी) को कवर और स्पष्ट नेल पॉलिश या स्कॉच टेप के साथ शीर्ष सील किनारों पर पर्ची. स्टोर नमूने 4 बजे ° एक खुर्दबीन स्लाइड सेवर बॉक्स में सी (अंधेरे में रखने के लिए).

7. प्रतिनिधि परिणाम

इस प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए एक उदाहरण के रूप में, हम वीडियो में तीन विकास के चरणों में फोटोरिसेप्टर भेदभाव दृश्यमान करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं. लार्वा डिस्क आंख antennal और एक midpupal रेटिना एंटीबॉडी कि उनके विकास (चित्रा 1 ए, बी) के दौरान विभिन्न फोटोरिसेप्टर प्रकार लेबल और एक वयस्क रेटिना दो Rhodopsin एंटीबॉडी के साथ दाग दो फोटोरिसेप्टर उपप्रकारों (चित्रा 1C) कल्पना के साथ दाग थे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. समस्या निवारण

हमारे अनुभव में, dissections अभ्यास (कई हफ्तों के लिए) की आवश्यकता होती है और मेज पर कोहनी और forearms आराम से और उंगलियों विच्छेदन पकवान के साथ संपर्क बनाने के साथ एक आरामदायक हाथ 21 स्थान प्राप्त करने के द्वारा सुविधा. इस तरह, केवल सूचकांक, अंगूठे और उंगलियों के बीच सूक्ष्म आंदोलनों प्रदर्शन करते हैं.

Photoreceptors को नुकसान पहुँचाए बिना लामिना हटाना शायद सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है. लाल आंखों wildtype के साथ अभ्यास से पहले सफेद आंखों म्यूटेंट विदारक 1 मक्खियों, के रूप में लामिना लाल आँख pigmentation के खिलाफ देखना बहुत आसान है. इसके अलावा, विच्छेदन पकवान के नीचे के पीछे और एक अंधेरे पृष्ठभूमि से प्रकाश इष्टतम विपरीत प्राप्त करने के लिए उपयोग.

हालांकि, लाल आँख वर्णक फ्लोरोसेंट है और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान उच्च पृष्ठभूमि पैदा कर सकता है. यह माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेतों को कमजोर कर सकते हैं. एक अच्छी रणनीति के लिए हैep चार से पांच दिनों के लिए वयस्क retinas धोने और प्रति दिन ताजा PBST से धोने के समाधान में कम से कम एक बार की जगह. वर्णक बाहर धोया जाएगा, उसी अवधि के लिए प्रयोगात्मक और नियंत्रण जीनोटाइप धो लें.

2. अनुप्रयोग

नेत्र विशेष हानि और लाभ का समारोह 23 22 ड्रोसोफिला आंख आनुवंशिक जोड़तोड़ और स्क्रीन के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली प्रणाली बनाने के दृष्टिकोण. इसके अलावा, पूरे retinas के 3D पुनर्निर्माण में एकल कोशिका विश्लेषण के लिए हाल ही में विकसित कम्प्यूटेशनल विधियों उच्च संकल्प 24 पर उत्परिवर्ती phenotypes का विश्लेषण की अनुमति देते हैं. यह प्रोटोकॉल इसलिए आंख विकास और अंतर्निहित 16,25-28 नियामक तंत्र के विषय में प्रश्नों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 रेटिना पूरी मी.तीन विभिन्न विकासात्मक चरणों में ounts. ए) लारवल आंख imaginal सात - अप (हरा) और छोटा सा व्यक्ति (मैजंटा) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग डिस्क. बी) Midpupal रेटिना. दो एंटीबॉडी (ELAV, नीला) R1-R8 और R7 photoreceptors (Prospero, सियान) photoreceptors कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. सी) वयस्क रेटिना. द्वारा सहज Rh5 (सियान) और R8 photoreceptors के दो उपप्रकारों में (लाल) Rh6 pigments के Stochastic और परस्पर अनन्य अभिव्यक्ति.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम एक Ehrman हरियाणा के लिए फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. एच., एक जेन ताबूत चिकित्सा अनुसंधान postdoctoral फैलोशिप के लिए बच्चों मेमोरियल RJJ, NIH अनुदान F32EY016309 फंड DV, एक न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय के डीन निबंध डीजे फैलोशिप, GrantR01 NIH EY13010 सीडी और जूनियर फैलोशिप DFG (2208/1- आरआई ) 1. हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए नीना Vogt और पामेला Boodram धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571		 Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
  3. O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

Tags

तंत्रिका विज्ञान 69 अंक एनाटॉमी फिजियोलॉजी इम्यूनोलॉजी विकास जीवविज्ञान, imaginal डिस्क लार्वा प्यूपा confocal माइक्रोस्कोपी immunohistochemistry
विच्छेदन और लारवल, पोटा संबंधी और प्रौढ़ immunohistochemistry<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Retinas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiao, H. Y., Johnston Jr., R. J.,… More

Hsiao, H. Y., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter