Summary
Il
Abstract
L'occhio composto di Drosophila melanogaster è composto da circa 750 ommatidi (occhi unità). Ogni ommatidium è composto da circa 20 cellule, inclusa la lente-secernenti coni, cellule del pigmento, una cella a setole e otto fotorecettori (PR) R1-R8 2. Il PRS hanno le strutture di microvillar, le rhabdomeres, che contengono pigmenti sensibili alla luce, i rodopsine (sd). Le rhabdomeres di sei PR (R1-R6) formano un trapezio e contengono Th1 3 4. Le rhabdomeres di R7 e R8 sono posizionati in tandem nel centro del trapezio e condividono lo stesso percorso della luce. R7 e R8 PR stocasticamente esprimono diverse combinazioni di Rhs in due sottotipi principali 5: Nel sottotipo la 'p', in p RH3 R7s è accoppiato con RH5 in p R8s, mentre nel sottotipo del 'y', Rh4 in y R7s è associato RH6 in y R8S 6 7 8.
Prime caratteristiche di PR e sviluppo di ommatidi inizia nella larvale eye-antennali disco immaginale, un monostrato di cellule epiteliali. Un'ondata di differenziazione spazza tutto il disco 9 e avvia l'assemblaggio di cellule indifferenziate in ommatidi 10-11. La R8 'cella fondatore' è specificato prima e recluta R1-6 e poi R7 12-14. Successivamente, durante lo sviluppo pupale, PR differenziazione porta a vasti cambiamenti morfologici 15, tra cui la formazione di rhabdomere, sinaptogenesi e di espressione alla fine rh.
In questo protocollo, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo della retina, che possono essere applicati per affrontare una serie di questioni concernenti la formazione della retina e percorsi di sviluppo. Qui, usiamo questi metodi per visualizzare la differenziazione graduale PR a livello di singola cellula per intero monte larvale, midpupal e adulti retine (
Protocol
1. Introduzione
In questo video, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo: il terzo instar larvali, la midpupal e la fase adulta. Anche se il nostro protocollo funziona anche per le altre fasi di pupa (per i dettagli su fasi precedenti, vedi 16), abbiamo scelto lo stadio midpupal, come è ottimale per l'imaging tutte le PR in un unico piano focale e la loro nuclei sono facilmente identificabili, che facilita la visualizzazione di fattore di trascrizione espressione modelli. La dissezione di ritardo pupa retina è molto simile alla dissezione dei retine adulti.
In primo luogo, si dimostra come raccogliere larve e pupe nelle fasi desiderati. Poi, ci spiega come ottenere dissezioni ottimali di larvale 17-18 midpupal e retine adulti. In secondo luogo, si dimostra come visualizzare sviluppo PR in queste fasi usando la microscopia confocale e immunoistochimica.
Il periodo di sviluppo degli insetti dipende dalla temperatura. Per facilitare la messa in scena riproducibile di larve e pupe, si raccomanda di mettere tutte le scorte di mosca a 25 ° C sotto un hr/12 12 ore ciclo luce / buio.
Terzo instar larve: A proposito di 96 ore dopo la deposizione delle uova (a 25 ° C), fine del III alimentazione larve instar stop e vagare sulle pareti della fiala alimentare, dove alla fine pupate. Utilizzare una spazzola morbida o una pinza per rimuovere delicatamente un vagare terzo instar larve dalla parete del flaconcino cibo.
50% pupe ('midpupae') sono stati osservati circa 48 ore dopo impupamento. Per i tempi esatti, si può girare intorno appena formata pupe bianco con un pennarello sul flaconcino cibo. In alternativa, spostare tutti pupe bianco a un nuovo flacone per ottenere una fiala di messa in scena uniforme (per la messa in scena di pupe in base a criteri morfologici, vedere 19). Dopo 48 ore, con attenzione remove il midpupae dal flacone utilizzando una pinza.
Mosche adulte: anestetizzare mosche giovani adulti (2-5 giorni dopo eclosion) su un tappetino di CO 2. Rimuovere testine di stampa utilizzando una pinza e memorizzarli in un bicchiere e servire freddo contenente 1x PBS.
3. Dissezione Procedura (Circa 1-2 ore per Experiment)
Dopo aver raccolto il campione, metterli in una goccia di PBS freddo su un piatto dissezione Sylgard. Dissect circa 10-15 retine per genotipo.
Si prega di consultare le schede di sicurezza, nonché la salute ambientale del proprio istituto e Office di sicurezza per la corretta manipolazione dei reagenti e delle attrezzature (vedi tabelle alla fine di questo protocollo).
1. Dischi Eye larvali immaginale
- Individuare l'estremità anteriore della larva, che contiene i ganci bocca. Utilizzare una pinza per premere la parte centrale della larva dolcemente contro la base del piatto Sylgard. Utilizzare another pinza per afferrare i ganci bocca e tirare delicatamente e lentamente dal corpo. Scartare la parte principale del corpo e utilizzare l'apparato boccale per tenere la parte anteriore in modo da rimuovere il tessuto estraneo dai dischi immaginali che rimangono attaccate al cervello.
- Trasferimento cervello con i dischi immaginali afferrando i ganci bocca con una pinza a 1x PBS in un tre ben piatto di vetro. Eseguire le operazioni di fissaggio (passo 4.1.).
- Dopo la fissazione, rimuovere ghiandole salivari, tessuto adiposo e tirare il cervello lontano dagli occhi-antennale disco immaginale. Per migliorare l'accessibilità delle "difficili" anticorpi, la membrana peripodial, che si trova sulla superficie dell'epitelio, può essere rimosso premendo la parte antennale del disco e la membrana peeling via con un perno dissezione. Successivamente, eseguire immunoistochimica (punto 5.1.).
2. 50% ninfosi / Midpupal retine
- Tenere estremità posteriore del case pupa con una pinza.Rimuovere delicatamente la superficie anteriore del case pupa afferrando la cuticola con altre pinze e tirare lentamente dal pupario. Staccare cuticola residua per esporre la testa.
- Utilizzare i suggerimenti pinze "per perforare il fondo, sacco morbido nella regione dorsale anteriore. Questo fornisce l'accesso alla testa. Delicatamente separare la testa dal torace lentamente succhiando la testa con una pipetta P20. Espellere testa dalla punta della pipetta nel fresco freddo 1x PBS e rimuovere il tessuto in eccesso; afferrare la cuticola testa e rimuovere proboscide. Procedere alla fase di fissaggio (passo 4.1.).
- Pierce il lobo ottico con un perno di dissezione per stabilizzare il tessuto. Inserire l'altro perno dissezione tra la lamina e retina per separare la retina dalla lamina / lobo ottico. Eseguire immunoistochimica (punto 5.1.).
3. Occhi adulti
- Afferra il centro della capsula posteriore testa con una pinza e rimuovere le parti della bocca (proboscide), Tiss grassiue e trachee.
- Afferra la cuticola dorsale testa con una pinza e usare l'altra per separare gli occhi di tessuto cerebrale, tirando delicatamente lateralmente. Nella maggior parte dei casi, la lamina, una guaina sottile e trasparente di neuropilo cervello, rimarrà attaccato alla retina. È più facile rimuovere la lamina dopo fissazione.
- Rimuovere le cuticole al margine occhio, ma lascia un piccolo pezzo dietro per facilitare il trasferimento di retine a soluzioni diverse. Effettuare fissaggio (passo 4.1.).
- Rimuovere la lamina afferrandolo da un lato con una pinza e delicatamente tirando lateralmente con le pinze altri senza compromettere la retina. Rimuovere cuticola residuo, in quanto potrebbe ripiegare sulla retina durante il montaggio. Questi due passaggi sono fondamentali per la visualizzazione fotorecettori, che altrimenti oscurato dalla lamina e rimane della cuticola durante il processo di imaging. Procedere alla immunoistochimica (punto 5.1.).
4. Fissazione e Washing (circa 1 ora)
- Conservare le retine sezionati in 1x PBS in tre ben piatto di vetro immessi sul ghiaccio mentre appena la preparazione del fissativo (diluire 40 microlitri di soluzione di formaldeide al 37% con 360 microlitri di PBS 1x, vortice e memorizzare sul ghiaccio). Si consiglia di procedere con il protocollo di fissazione e di evitare lunghi tempi di conservazione in ghiaccio (> 15 min).
- Sostituire 1x PBS con 200 ml di soluzione di formaldeide 3,7%. Assicurarsi che il tessuto viene immerso in fissativo. Questo è critico, in quanto può non essere altrimenti fissato correttamente. Se necessario, rimuovere le bolle d'aria e trachee con le pinze.
- Incubare su agitatore per 15 min a temperatura ambiente.
- Sostituire il fissativo con 1x PBS e lavare due volte con PBS 1x. Continuare il lavaggio in PBS per 30 minuti (su agitatore, a temperatura ambiente).
- Sostituire PBS con PBST. Risciacquare due volte con PBST.
- Procedere con la rimozione della membrana peripodial dai dischi degli occhi larvali (3.1.3.) E le lamine di midpupal / adulto retine <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunoistochimica
- Bloccante: Sostituire PBS con 200 pl del 5% siero normale in PBST e incubare per 20 min retine su agitatore a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione di saturazione con la soluzione di anticorpo primario. Sigillare il tre ben piatto con parafilm e incubare per una notte su agitatore a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione con PBST e lavare 3 volte. Continuare lavaggio con PBST per almeno 1 ora su agitatore a temperatura ambiente.
- Trasferimento in soluzione di anticorpo secondario ed incubare in un parafilm-piatto di vetro sigillato bene su agitatore notte a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione di anticorpi con PBST e lavare tre volte. Continuare lavaggio con PBST per un minimo di un hr su agitatore a temperatura ambiente. I campioni possono essere conservati in PBST per diversi giorni, ma è importante aggiungere PBST fresco almeno una volta al giorno per evitare che si secchi.
6. Montaggio
- Per il montaggio retine larvali e midpupal, utilizzare il P20 per trasferire retine al centro di un vetrino pulito. Rimuovere PBST eccesso. Utilizzare una pinza per allineare retine per facilitare l'imaging.
- Aggiungere 10 ml di mezzo di montaggio sopra le retine. Coprire delicatamente con un foglio 24x40-1 coperchio e sigillare con smalto trasparente.
- Per montaggio retine adulti, preparare 'ponti' 20: Aggiungere due gocce 5 ml di glicerolo al 50% su entrambe le estremità di un lato di vetro e coprire con 22x22-1 vetrini (0,13 a 0,17 mm di spessore).
- Rimuovere il PBST con una pipetta P20, fare in modo che la retina non si seccano. Aggiungere 20 ml di mezzo di montaggio al pozzo. Utilizzare mezzo di montaggio per trasferire retine con il P20 al vetrino 'ponte'.
- Utilizzare una pinza per orientare (lenti devono affrontare il vetrino) e allineare retine per facilitare l'imaging. Se necessario, rimuovere le bolle d'aria con il P20.
- Lentamenteposto antiscivolo 24x40-1 Coperchio (0,13 a 0,17 mm di spessore) da un lato in alto e sigillare i bordi con smalto trasparente o nastro adesivo. Conservare i campioni a 4 ° C in una casella di vetrino da microscopio saver (tenere al buio).
7. Risultati rappresentativi
Ad esempio per l'applicazione del presente protocollo, si mostrano i risultati rappresentativi per la visualizzazione di differenziazione dei fotorecettori i tre stadi di sviluppo nel video. A larvale eye-antennale disco e una retina midpupal state colorate con anticorpi che etichettano tipi fotorecettrici diversi durante il loro sviluppo (Figura 1A, B) e una retina adulta è stato colorato con due anticorpi Rhodopsin di visualizzare due sottotipi fotorecettrici (Figura 1C).
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Discussion
1. Risoluzione dei problemi
Nella nostra esperienza, dissezioni richiedono una pratica (fino a diverse settimane) e sono facilitate da raggiungere una posizione comoda a mano 21 con appoggio i gomiti e gli avambracci sul tavolo e con le dita in contatto con il piatto dissezione. Dita In questo modo, solo il pollice, indice e medio compiere movimenti sottili.
Rimozione della lamina senza danneggiare i fotorecettori è probabilmente il passo più difficile. Pratica con gli occhi rossi di tipo selvatico vola prima dissezione dagli occhi bianchi mutanti, come la lamina è molto più facile da vedere contro la pigmentazione degli occhi rossi. Inoltre, utilizzare l'illuminazione da dietro e uno sfondo scuro sotto il piatto dissezione per ottenere un contrasto ottimale.
Tuttavia, il pigmento occhio rosso è fluorescente e può causare fondo elevato durante il processo di imaging. Questo può indebolire i segnali dai anticorpi secondari. Una buona strategia è quella di keep lavare le retine adulti per 4-5 giorni e sostituire la soluzione di lavaggio con PBST fresco almeno una volta al giorno. Il pigmento sarà lavato, essere sicuri di lavare genotipi sperimentali e di controllo per la stessa durata.
2. Applicazioni
Eye-specifica perdita e guadagno-di-funzione si avvicina 22 23 rendono l'occhio Drosophila un sistema particolarmente potente per manipolazioni genetiche e schermi. Inoltre, recentemente sviluppati metodi di calcolo per singola cella di analisi in ricostruzioni 3D di retine intere permettono l'analisi dei fenotipi mutanti ad alta risoluzione 24. Questo protocollo può essere applicato a una serie di domande riguardanti lo sviluppo degli occhi e dei meccanismi alla base di regolamentazione 16,25-28.
Figura 1. Retinica m interoounts in tre diverse fasi di sviluppo. A) disco occhio larvale immaginale colorate con anticorpi contro la Seven-up (verde) e Runt (magenta). B) Midpupal retina. Due anticorpi sono stati utilizzati per visualizzare tutti i fotorecettori R1-R8 (Elav, blu) e R7 fotorecettori (Prospero, ciano). C) per adulti retina. Espressione stocastico e reciprocamente esclusivo di pigmenti fotosensibili RH5 (ciano) e Rh6 (rosso) in due sottotipi di fotorecettori R8.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio a Ehrman HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund per la borsa di studio post-dottorato di ricerca medica RJJ, NIH Grant F32EY016309 a DV, Fellowship Tesi di New York University di Dean a DJ, NIH GrantR01 EY13010 su CD e una borsa di studio per DFG JR (RI 2208/1- 1). Ringraziamo Nina Vogt e Pamela Boodram per i commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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