Summary
ザ
Abstract
キイロショウジョウバエの複眼は約750 ommatidiumの複数形（ユニット目）から構成されています。それぞれの個眼は、レンズを分泌する錐体細胞、色素細胞、毛細胞と8つの光受容体（PRS）R1〜R8 2を含む約20の細胞で構成されています。 PRSは、特殊な微絨毛構造、光に敏感な顔料を含有rhabdomeres、ロドプシンを（RHS）があります。 6 PRのrhabdomeres（R1〜R6）は、台形を形成し、体Rh1 3 4が含まれています。 R7とR8のrhabdomeresは台形の中心にタンデムに配置され、光の同じパスを共有しています。 R7とR8 PRSは確率的に2メインサブタイプ5のRHSのさまざまな組み合わせを表現： 'p'のサブタイプでは、p R7sでRH3 は p R8sでRH5と結合されて、 'y'のサブタイプには、y R7sでRH4が関連付けられているのに対し、 yの R8sでRH6 6 7 8。
PRSとommatidiumの複数形の開発の初期仕様では幼虫の目触角成虫原基は、上皮細胞の単層で始まる。差別化の波は、ディスク9に掃引とommatidiumの複数形10月11日に未分化細胞のアセンブリを開始します。 '創始細胞' R8はR7を12月14日 、第1及び新入社員、R1-6と指定されています。その後、蛹の開発中に、PRの分化は感桿分体形成、シナプス形成し、最終的にrhの発現を含む広範な形態学的変化15につながる。
このプロトコルでは、網膜の形成や発達経路に関するさまざまな問題に取り組むために適用することができる網膜の開発の3つの定義された期間、網膜における解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。ここで、我々は全体のマウント幼虫、midpupalと成人網膜の単一細胞レベルで段階的なPRの分化を視覚化するために、これらのメソッドを使用します（
Protocol
1。はじめに
三齢幼虫、midpupalと成虫：このビデオでは、3つの定義済みの発達期間における網膜の解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。我々のプロトコルは、他の蛹の段階のために動作しますが（それ以前の段階の詳細については、16を参照）は、1つの焦点面とその核にイメージングのためのすべてのPRに最適であるように、我々は、midpupal舞台を選んだの可視化を容易にする、簡単に識別できます転写因子の発現パターン。後半蛹網膜の郭清は成人網膜の解剖と非常によく似ています。
まず、希望の段階での幼虫や蛹を収集する方法を示しています。そこで、幼虫17-18、midpupalと成人網膜の最適解剖を入手する方法について説明します。第二に、我々は、免疫組織化学および共焦点顕微鏡を使用して、これらの段階でPRの開発を可視化する方法を示します。
昆虫の発育期間は、温度に依存しています。幼虫と蛹の再現ステージングを容易にするために、私たちは12 hr/12時間の明/暗サイクル下で25℃ですべてのフライ株式℃に上げることをお勧めします。
3齢幼虫：産卵後約96時間（25℃）、後期3齢幼虫停止送り、彼らは最終的には蛹になる食品バイアルの壁にさまよう。優しく食品用容器の壁から徘徊3齢幼虫を除去するために柔らかいブラシや鉗子を使用しています。
50％の蛹（ 'midpupae'）は蛹化後48時間程度観測されている。正確なタイミングでは、食品バイアル上のマーカーにだけ形成された白い蛹を一周することができます。あるいは、均一なステージングのバイアル（形態学的基準を使用して蛹のステージング用に、19を参照）を得るために新しいバイアルにすべての白い蛹を移動します。 48時間後、慎重にレムピンセットを用いてバイアルからmidpupaeのオベ。
アダルトハエ：CO 2のパッドの上に麻酔の若い大人のハエ（2-5日羽化後）。鉗子を使用してヘッドを取り外し、寒い1X PBSを含むガラスウェルディッシュに保管してください。
3。解剖手順（実験1〜2時間程度）
標本を収集した後、シルガード郭清を皿に冷PBSの一滴の中に置いてください。遺伝子型10-15網膜について解剖する。
試薬や機器の適切な取り扱いのために化学物質等安全データシートだけでなく、金融機関の環境衛生および安全管理室（このプロトコールの最後にある表を参照してください）ご相談ください。
1。幼虫アイ成虫
- 口のフックが含まれている幼虫の前端の位置を確認します。シルガード皿の底そっと幼虫の中央部を押すように鉗子を使用しています。 anothを使用erが口のフックをつかむと、体内から優しくゆっくりと引き離し鉗子。本体の主要部分を破棄し、脳に接続されたまま成虫から余分な組織を除去するために前部を保持するために口器を使用しています。
- 3ウェルガラス皿の1X PBSに鉗子で口フックをつかんで成虫と脳を転送します。固定ステップを（ ステップ4.1）を実行します。
- 固定後、唾液腺、脂肪組織を除去し、離れて目を触角の成虫原基から脳を引き出します。 "難しい"抗体のアクセシビリティを向上させるために、上皮の表面に配置されているperipodial膜は、ディスクの触角の部分を押しながら解剖ピンと離れて膜を剥離することにより除去することができる。次に、（ステップ5.1）免疫組織化学を行ってください。
2。 50％の蛹化/ Midpupal網膜
- ピンセットで蛹例後端を保持します。そっと別の鉗子でキューティクルをつかんで蛹例前面を取り外し、ゆっくりと蛹殻から引き離します。頭を露出させるために離れて残留キューティクルをはがします。
- 背前歯部では、基礎となる、柔らかい袋を貫通する鉗子 "のヒントを参考にしてください。これは、頭部へのアクセスを提供します。優しくゆっくりP20ピペットで頭を吸引することによって胸部から頭部を分離します。新鮮な冷1X PBSにピペットの先端から頭を追放し、余分な組織を除去し、頭のキューティクルをつかむと口吻を削除します。固定ステップ（ステップ4.1）に進みます。
- ピアース着実な組織への1解剖ピンと視葉。ラミナとラミナ/視葉から網膜を分離するために網膜の間に他の解剖ピンを挿入します。免疫組織化学を行う（ステップ5.1）を実行します。
3。大人の目
- 鉗子で後部頭部カプセルの中央をつかむと、口の部分（吻）、脂肪TISSを削除UEと気管。
- 1鉗子で背頭のキューティクルをつかむと、そっと横に引いて、脳組織から目を分離するために、他を使用しています。ほとんどの場合、ラミナ、脳の神経網の薄くて透明なシースは、網膜に取り付けられたままになります。これは、固定後粘膜を除去する方が簡単です。
- アイマージンでキューティクルを除去しますが、さまざまなソリューションに網膜の転送を容易にするために後ろに小片にしておきます。 （ステップ4.1）。固定を行う。
- ピンセットで片側でそれをつかんで、ゆっくりと網膜を損なうことなく、他の鉗子で横に引いて、ラミナを削除します。それは実装時の網膜上に折ることができるように、残留キューティクルを取り除きます。これらの2つの手順がそうでなければ、イメージングプロセス中に、キューティクルのラミナや遺跡で隠されてしまう光受容体を、可視化するために重要である。免疫組織化学（ステップ5.1）に進みます。
4。固定と和紙NG（約1時間）
- 新たに固定液を（1×PBS、氷の上で渦や店舗を360μlの37％ホルムアルデヒド溶液の希釈40マイクロリットル）の準備中、氷上に置い3ウェルガラス皿に1X PBSで切開した網膜を格納します。我々は、固定プロトコールを続行すると氷（> 15分）で長期保存時間を避けることをお勧めします。
- 3.7％ホルムアルデヒド溶液200μlの1×PBSを交換してください。組織を固定液に浸漬されていることを確認します。それはそうでなければ適切に修正されない場合がありますので、これは重要です。必要に応じて、ピンセットで気泡や気管を削除します。
- 室温で15分間シェーカーでインキュベートする。
- 1×PBSで固定液を交換し、1×PBSで二回すすいでください。 30分（シェーカー上、室温）をPBS中で洗浄を続けます。
- PBSTでPBSを交換してください。 PBSTで二回すすぎ。
- 幼虫の眼ディスク（3.1.3。）とmidpupal /成人の網膜からラミナからperipodial膜の削除を続行<強い>（3.2.3、3.3.4）。
5。免疫組織化学
- ブロッキング：室温でシェーカーで20分間インキュベートし、PBST網膜で5％正常血清200μlのPBSを交換してください。
- 一次抗体溶液を用いてブロッキング液を交換してください。パラフィルムを持つ3つのウェルディッシュを密封し、室温でシェーカー上で一晩インキュベートする。
- PBSTでソリューションを交換して、3回すすいでください。室温でシェーカーで1時間の最小値をPBSTで洗浄を続けます。
- 室温で一晩振とう機にパラフィルム密封されたガラスだけでなく皿の中で二次抗体溶液とインキュベートで転送。
- PBSTで抗体溶液を交換して、3回すすいでください。室温でシェーカーで1時間の最小値をPBSTで洗浄を続けます。サンプルは数日間PBSTで続けたが、それは乾燥からそれらを防ぐためには、少なくとも1日に1回、新鮮なPBSTを追加することが重要であることができます。
6。 Mounting
- 幼虫とmidpupal網膜を取り付けるために 、きれいなスライドガラスの中央に網膜を転送するためにP20を使用しています。過剰PBSTを削除します。イメージングを容易にするために、網膜を揃えるためにピンセットを使用しています。
- 網膜の上にメディアをマウントする10μlを添加する。明確なマニキュア付き24x40-1カバースリップとシールで軽くカバーしています。
- 成体網膜を装着するための準備、 'ブリッジ' 20：ガラス面の両端に50％グリセロールの25μlの液滴を追加して、22x22のA-1カバースリップ（厚0.13〜0.17ミリメートル）でそれらをカバーしています。
- P20ピペットでPBSTを取り外し、網膜が乾燥しないように注意してください。ウェルに培地を取り付けるの20μlを添加する。 "ブリッジ"ガラススライドにP20と網膜を転送するために封入剤を使用しています。
- 東洋に鉗子を使用します（レンズはガラススライドを向ける必要があります）とイメージングを容易にするために、網膜の位置を合わせます。必要な場合は、P20と気泡を除去。
- ゆっくり明確なマニキュアやスコッチテープでトップとシールエッジの片側から場所24x40-1カバースリップ（厚さ0.13〜0.17ミリメートル）。ストアサンプルは4℃顕微鏡スライドセーバーボックスのC（暗所におく）。
7。代表的な結果
このプロトコルのアプリケーションの例として、我々は、ビデオ内の3発生段階において、感光体分化を可視化するための代表的な結果を示しています。幼虫の目触角ディスクとmidpupal網膜は、それらの開発（ 図1A、B）の中に異なる光受容体の種類にラベルを付けたり、成体網膜は、2つの光受容体のサブタイプ（ 図1C）を可視化するために2ロドプシン抗体で染色した抗体で染色した。
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Discussion
1。トラブルシューティング
我々の経験では、解剖の練習（最大〜数週間）が必要で、テーブルの上に、解剖皿に接触して指で肘や前腕を置くことによって快適な手の位置21を達成することによって促進される。そのように、唯一の親指、人差し指と中指が微妙な動きを実行します。
感光体を傷つけることなく薄層を除去することは、おそらく最も困難なステップです。ラミナ赤目色素沈着に対して参照する方がはるかに簡単であるように赤い目をした野生型との練習は、白い目をした変異体を解剖する前に、まず飛ぶ。また、最適なコントラストを実現するために解剖皿の下に背後と暗い背景から照明を使用しています。
しかし、赤目顔料は蛍光性であり、イメージングプロセスの間に高いバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これは、二次抗体からの信号を弱めることができる。良い戦略はKEにあるepは四から五日間成人網膜を洗浄し、少なくとも1日1回、新鮮なPBSTで洗浄溶液を交換する。顔料が洗い流されるため、同じ期間中に、実験群と対照遺伝子型を洗うようにしてください。
2。アプリケーション
アイ特有の損失と機能獲得型のアプローチ22 23は、 ショウジョウバエの眼の遺伝子操作や画面に特に強力なシステムを作る。また、全体の網膜の3D再構成でシングルセル解析のために最近開発された計算方法では、高解像度24で変異体の表現型の解析を可能にします。このプロトコルは、したがって眼の開発基盤となる規制メカニズム16,25-28に関するさまざまな質問にも適用することができる。
図1網膜全体メートル三つの異なる発達段階でounts。 （マゼンタ）セブンアップ（緑）とラントに対する抗体で染色した）幼虫眼成虫原基。 B）はMidpupal網膜。二つの抗体はすべての光受容体R1〜R8（Elav、青）とR7光受容体（プロスペロー、シアン）を可視化するために使用された。 C）のアダルト網膜。感光顔料RH5（シアン）とR8光受容体のサブタイプでRH6（赤）の確率と相互に排他的な表現。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はHYにEhrmanの交わりによってサポートされていました。 H.、DV、JRにニューヨーク大学ディーンの論文をCDにDJのフェローシップは、NIH GrantR01 EY13010とDFG交わりRJJ、NIHグラントF32EY016309に医学研究ポスドクのためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金（RI 2208/1- 1）。我々は、原稿上のコメントのためのニーナ·フォークトとパメラBoodramに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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