Summary
Abstract
Drosophila melanogaster의 화합물 눈은 약 750 ommatidia (단위 눈)으로 구성되어 있습니다. 각 ommatidium는 렌즈 분비 콘 세포, 안료 세포, 억센 털 셀 및 8 photoreceptors (푸에르토 리코 놈들) R1-R8이 포함 약 20 세포로 구성되어 있습니다. 푸에르토 리코 놈들은 빛에 민감한 안료, Rhodopsins을 (RHS)를 포함 전문 microvillar 구조, rhabdomeres을 수 있습니다. 여섯 푸에르토 리코 놈들의 rhabdomeres (R1-R6)는 사다리꼴을 형성하고 Rh1 3 4이 포함되어 있습니다. R7 및 R8의 rhabdomeres는 사다리꼴의 중심에 직렬로 위치와 빛의 동일한 경로를 공유 할 수 있습니다. R7 및 R8 푸에르토 리코 놈들은 stochastically 두 가지 하위 유형 5 RHS의 다른 조합을 표현 : 'P'하위 유형에서, P R7s의 Rh3는 P R8s에 Rh5와 결합되어, 'Y'하위 유형에 Y R7s의 Rh4이 연관된 반면, Y의 Rh6는 6 7 8 R8s.
푸에르토 리코 놈들과 ommatidia 개발의 초기 사양은 애벌레의 눈 antennal imaginal 디스크, 상피 세포의 monolayer에서 시작됩니다. 차별화의 파도가 디스크 9에서 쓸어과 ommatidia 10-11로 undifferentiated 세포의 조립을 시작합니다. '설립자 셀'R8 먼저 지정하고 R7 12-14 R1-6 그리고 모집합니다.합니다 그 후, pupal 개발하는 동안, 홍보 차별화 rhabdomere 형성, synaptogenesis 결국 RH 표현을 포함한 다양한 형태학의 변화 15로 연결됩니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 망막 형성과 발달 경로에 관한 질문의 다양한 해결하기 위해 적용 할 수있는 망막 개발의 세 정의 된 기간에서 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 여기, 우리는 전체 마운트 애벌레의, midpupal 및 성인 망막 (의 단일 셀 레벨에서 stepwise PR 차별화를 시각적으로 이러한 방법을 사용
Protocol
1. 소개
세 번째 instar 애벌레의, midpupal과 성인 무대 :이 동영상에서는, 우리는 세 가지 정의 개발 기간의 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 우리 프로토콜 다른 pupal 단계 (초기 단계에 대한 자세한 내용은, 16 참조)를 위해 일이지만 하나의 초점 평면과 핵의 모든 푸에르토 리코 놈들이의 시각화을 용이하게하는, 쉽게 식별 할 수있는 이미지에 적합하므로, 우리는 midpupal 단계를 선택 전사 인자의 발현 패턴. 후반 pupal 망막의 해부는 성인 망막의 해부와 매우 유사합니다.
첫째, 우리는 원하는 단계에서 유충과 pupae를 수집하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음, 우리는 애벌레의 17-18, midpupal 및 성인 망막의 최적 dissections를 얻는 방법에 대해 설명합니다. 둘째, 우리는 immunohistochemistry와 공 촛점 현미경을 사용하여 이러한 단계에서 PR 개발을 시각화하는 방법을 보여줍니다.
곤충의 발달 기간은 온도에 따라 달라지게된다. 애벌레와 pupae의 재현 준비를 촉진하기 위해, 우리는 12 hr/12 시간의 빛 / 어둠의주기에 따라 25의 모든 비행 주식 ° C를 양육하는 것이 좋습니다.
공급 instar의 애벌레 : 96에 대해 알 부설 후 시간 (25 ° C에서), 늦은 셋째 instar의 애벌레 정류장 먹이하고 결국 번데기가되다 식품 유리 병의 벽에 산책. 부드럽게 식품 유리 병의 벽에서 방황 제 instar 애벌레를 제거하는 부드러운 브러쉬 나 집게를 사용하십시오.
50 % pupae ( 'midpupae'는) pupation 후 48 시간을 관찰합니다. 정확한 타이밍를 들어, 음식 유리 병에 마커로 그냥 형성된 흰색 pupae를 동그라미 수 있습니다. 또한, 균일 한 준비의 병을 (형태학의 기준을 사용하여 pupae의 준비를 위해, 19 참조) 얻기 위해 새로운 유리 병에 모든 흰색 pupae 이동합니다. 후 48 시간 신중하게 수치집게를 사용하여 유리 병에서 midpupae을 ove.
성인 파리 : CO 2 패드에 마취 젊은 성인 파리 (2~5일 eclosion 이후). 집게를 사용하여 헤드를 제거하고 유리에 보관이 잘 차가운 1X PBS를 포함하는 요리.
3. 분해 절차 (실험 1-2에 대해 시간)
표본을 수집 한 후, Sylgard의 분해 요리에 차가운 PBS의 드롭에 배치합니다. 유전자형 당 10-15 망막에 대한 해부.
시약 및 장비의 적절한 처리에 대한 물질 안전 데이터 시트뿐만 아니라 교육 기관의 환경 보건 및 안전 사무소 (이 프로토콜의 끝에 테이블을 참조) 참조하십시오.
1. 애벌레의 눈 Imaginal 디스크
- 입 후크를 포함하는 유충의 앞쪽 끝을 찾습니다. Sylgard 요리의 기본에 대해 부드럽게 유충의 가운데 부분을 눌러 집게를 사용하십시오. anoth를 사용하여응급실은 입 후크를 움켜 잡고 몸에서 부드럽게하고 서서히 끌어 포셉. 신체의 주요 부분을 취소하고 뇌에 첨부 된 상태로 유지 imaginal 디스크에서 필요없는 조직을 제거하기 위해 앞 부분을 보유하는 mouthparts을 사용합니다.
- 3 잘 유리 접시에 1X PBS에 집게로 입 갈고리를 잡아서 imaginal 디스크로 뇌를 전송합니다. 고정 단계 (단계 4.1). 수행합니다.
- 고정 후, 지방 조직을 침샘을 제거하고 눈 antennal imaginal 디스크에서 떨어져 뇌를 당긴다. '어려운'항체의 접근성을 개선하기 위해 상피의 표면에있는 peripodial 막은, 디스크의 antennal 부분을 누른 상태 해부 핀을 멀리 멤브레인을 필링으로 제거 할 수 있습니다. 다음으로, immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다.
2. 50 % Pupation / Midpupal 망막
- 집게와 pupal 가지 경우 뒤쪽 끝을 잡아.부드럽게 다른 집게로 큐티클을 잡아서 pupal 사건의 앞쪽 표면을 제거하고 천천히 번데기에서 떨어져 당긴다. 물러 머리를 노출하는 잔류 큐티클.
- 피어스 등쪽의 앞 지역의 기본, 부드러운 자루에 포셉 '팁을 사용하십시오. 이 머리에 액세스 할 수 있습니다. 부드럽게 천천히 P20의 피펫으로 머리를 빨아하여 가슴에서 머리를 분리. 신선한 차가운 1X PBS에 피펫 팁의 머리를 추방하고 초과 조직을 제거하고, 머리 표피를 잡아 코를 제거합니다. 고정 단계 (단계 4.1.)로 진행합니다.
- 안정된 조직 한 해부 핀 피어스는 광 엽. 얇은 판과 얇은 판 / 광 엽에서 망막을 분리하기 위해 망막 사이에 다른 해부 핀을 삽입합니다. immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다.
3. 성인 눈
- 집게와 함께 뒤쪽 머리 캡슐의 중심을 잡고 입 부품 (코), 지방 tiss를 제거UE와 tracheae.
- 한 집게로 등쪽의 머리 표피를 잡고 부드럽게 옆으로 당겨 뇌 조직에서 눈을 분리하는 다른을 사용합니다. 대부분의 경우, 얇은 판, 뇌 neuropil의 얇고 투명한 피복은 망막에 부착 남아있을 것입니다. 그것은 고정 후 얇은 판을 제거하는 것이 더 쉽습니다.
- 눈 여백에 큐티클을 제거하지만, 다른 솔루션에 망막의 전송을 촉진하기 위하여 뒤에 작은 조각을 두십시오. (단계 4.1.) 고정을 수행합니다.
- 집게로 한쪽에서를 쥐어 조심스럽게 망막을 혼란하게 다른 집게로 옆으로 당겨 얇은 판을 제거합니다. 가 장착되는 동안 망막에 접어 될 수 있으므로 잔류 큐티클을 제거합니다. 이 두 단계는 달리 얇은 판으로 덮여 있으며 이미징 과정에서 표피의 유적 될 photoreceptors을 시각화 중요하다. immunohistochemistry (단계 5.1.)로 진행합니다.
4. 고정 및 와시NG (약 1 시간)
- 갓 (1X PBS, 얼음에 소용돌이 및 매장 360 μl 37 %의 포름 알데히드 용액의 40 microliters을 희석) 정착액을 준비하는 동안 얼음에 위치 3 잘 유리 접시에 1X PBS에서 해부하는 망막를 저장합니다. 우리는 고정 프로토콜을 진행하고 얼음 (> 15 분)에 긴 저장 시간을 방지하는 것이 좋습니다.
- 3.7 %의 포름 알데히드 용액 200 μl와 1X PBS를 교체하십시오. 조직 정착액에 잠겨되어 있는지 확인하십시오. 이 달리 제대로 고정되지 않을 수 있으므로 이것은 중요합니다. 필요한 경우, 포셉과 기포와 tracheae를 제거합니다.
- 실온에서 15 분에 쉐이커에 품다.
- 1X PBS로 정착액을 교체하고 1X PBS로 두 번 씻어. 30 분 (셰이커에, 상온에서)을 PBS에 세척 계속합니다.
- PBST로 PBS를 교체하십시오. PBST로 두 번 씻어.
- 애벌레의 눈 디스크 (3.1.3.)와 midpupal / 성인 망막에서 laminas에서 peripodial 멤브레인을 제거 진행 <STRONG> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunohistochemistry
- 차단 : 상온에서 흔드는 20 분에 PBST 및 배양 망막 5 % 정상 혈청 200 μl와 PBS를 교체하십시오.
- 기본 항체 솔루션을 차단 솔루션을 대체합니다. parafilm으로 세 잘 요리를 밀봉하고 실온에서 흔드는을 하루 아침에 품다.
- PBST로 솔루션을 교체하고 3 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 1 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다.
- 실온에서 하룻밤 흔드는에 parafilm - 밀폐 된 유리 잘 요리의 보조 항체 솔루션과 배양에 전송.
- PBST로 항체 솔루션을 교체하고 세 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 한 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다. 샘플은 여러 가지 일 PBST에 보관하지만, 밖으로 건조에서 그들을 방지하기 위해 적어도 하루에 한 번 신선한 PBST를 추가하는 것이 중요합니다 수 있습니다.
6. 엠ounting
- 애벌레의와 midpupal 망막를 장착 들어, 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 망막을 전송할 P20를 사용합니다. 초과 PBST를 제거합니다. 영상을 촉진하기 위해 망막을 정렬 집게를 사용하십시오.
- 망막의 상단에 미디어를 마운트의 10 μl를 추가합니다. 투명 매니큐어와 24x40-1 커버 슬립과 도장 부드럽게을 다룹니다.
- 마운트 성인 망막를 들어, '다리'(20) 준비 : 유리 측의 양쪽에 50 % 글리세롤의 두 5 μl 방울을 추가하고 22x22-1 커버 용지 (두께 0.13-0.17 mm)로을 다룹니다.
- P20의 피펫으로 PBST를 제거하고, 망막 아웃 건조하지 있는지 확인하십시오. 잘에 매체를 장착 20 μl를 추가합니다. '다리'유리 슬라이드에 P20와 망막을 전송하는 설치 매체를 사용하십시오.
- 방향에 집게를 사용합니다 (렌즈는 유리 슬라이드에 직면한다) 및 이미징을 촉진하기 위해 망막을 맞 춥니 다. 필요한 경우, P20과 기포를 제거합니다.
- 천천히투명 매니큐어 또는 스카치 테이프 상단과 인감 가장자리에 한쪽 곳에서 24x40-1 커버 슬립 (두께 0.13-0.17 mm). 스토어 샘플 4에 ° 현미경 슬라이드 보호기 상자에 C (어둠 속에서 유지).
7. 대표 결과
이 프로토콜의 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 우리는 동영상에 세 발달 단계에서 photoreceptor의 차별화를 시각화를위한 대표적인 결과를 보여줍니다. 애벌레의 눈 antennal 디스크 및 midpupal 망막들은 개발 (그림 1A, B) 동안 다른 photoreceptor 유형을 라벨 및 성인 망막는 두 photoreceptor의 하위 유형 (그림 1C)을 시각화 두 Rhodopsin 항체 물들 된 항체 물들했다.
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Discussion
1. 문제 해결
우리의 경험에서 dissections가 연습 (최대 몇 주까지)이 필요하고 테이블에 팔꿈치와 팔을 쉴 의해 손가락 분해 요리와 접촉을 갖춘 편안한 손의 위치 21 달성에 의해 촉진된다. 이렇게 만 엄지 손가락, 색인 및 중간 손가락이 미묘한 움직임을 수행합니다.
photoreceptors를 손상시키지 않고 얇은 판을 제거하면 아마도 가장 어려운 단계입니다. 얇은 판의 적목 현상 착색에 대해보고하기가 훨씬 쉽습니다으로 붉은 눈 wildtype과 연습은 흰 눈 돌연변이을 해부하기 전에 이동합니다. 또한, 최적의 대비를 달성 할 수 있도록 분해 요리 아래 뒤와 어두운 배경에서 조명을 사용합니다.
그러나, 적목 색소 형광이며, 이미징 과정에서 높은 배경을 일으킬 수 있습니다. 이 보조 항체의 신호를 약하게 할 수 있습니다. 좋은 전략은 KE하는 것입니다EP 4-5일의 성인 망막 세정 하루에 적어도 한 번 이상 신선한 PBST로 세척 솔루션을 대체 할 수 있습니다. 안료는 씻겨되며 같은 기간 동안 실험 및 제어 genotypes을 씻고해야합니다.
2. 응용
아이 별 손실과 이득의 기능은 22 23 Drosophila 눈 유전자 조작과 화면에 특히 강력한 시스템 확인 접근한다. 또한, 전체 망막의 3D reconstructions의 단일 셀 분석을 위해 최근에 개발 된 전산 방법은 고해상도 24의 돌연변이 phenotypes의 분석을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 따라서 눈 개발 및 기본 규제 메커니즘 16,25-28에 관한 질문 다양한에 적용 할 수 있습니다.
그림 1. 망막 전체 m세 가지 다른 발달 단계에서 ounts. (마젠타) 세븐 - 업 (녹색)와 런트에 대한 항체 물들 A) 애벌레의 눈 imaginal 디스크. B) Midpupal의 망막. 두 항체는 모든 photoreceptors R1-R8 (Elav, 청색)과 R7 photoreceptors (지주, 시안)을 시각화하는 데 사용되었습니다. C) 성인 망막. 감광성 안료 Rh5 (시안)과 R8의 photoreceptors의 두 하위 유형에 Rh6 (빨간색)의 확률과 상호 배타적 인 표현.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 HY에 Ehrman의 교제에 의해 지원되었다. H., DV, JR에 뉴욕 대학교 학장의 학위 논문 CD에 DJ로 휄로 십, NIH GrantR01 EY13010 및 DFG 교제에 RJJ, NIH 그랜트 F32EY016309에 의학 연구 박사 친목을위한 제인 코핀 일즈 기념 기금 (RI 2208/1- 1). 우리는 원고에 대한 의견 니나 Vogt와 파멜라 Boodram 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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