Summary
Abstract
Drosophila melanogaster bileşik göz yaklaşık 750 küçük gözcüklerinin (birim göz) oluşur. Her bir ommatidium lens koni salgılayan hücreler, pigment hücreler, bir kıl hücresi ve sekiz fotoreseptör (PR) R1'in-R8 2 de dahil olmak üzere yaklaşık 20 hücreleri oluşur. PRs ışığa duyarlı pigmentleri, Rhodopsins (RHS) içeren özel microvillar yapıları, rhabdomeres var. Altı PRS rhabdomeres (R1-R6) bir yamuk oluşturur ve RH1 3 4 içerir. R7 ve R8 rhabdomeres yamuk merkezi arka arkaya yerleştirilmiş ve ışık aynı yol paylaşırlar. R7 ve R8, PR stokastik olarak iki ana tipi 5 ST farklı kombinasyonlarını ifade eder: 'p' tipinde, s R7s içinde RH3 p R8s içinde RH5 ile bağlanmaktadır, "y" alt tipinde, y R7s içinde RH4 ile ilişkili iken y RH6 6 7 8 R8s.
PRs ve küçük gözcüklerinin gelişimi erken belirtimi larva göz antennal hayalsel disk, epitel hücre tek tabaka başlar. Farklılaşma dalgası diski 9 genelinde süpürür ve küçük gözcüklerinin 10-11 içine farklılaşmamış hücre montajı başlatır. 'Kurucusu hücre' R8 ilk olarak belirtilen ve R7 12-14 R1-6 ve sonra acemi. Edilir Daha sonra, pupa gelişme sırasında, PR farklılaşma rhabdomere oluşumu, sinaptogenez ve sonunda rh ekspresyonunu içeren kapsamlı morfolojik değişiklikler 15, yol açar.
Bu protokol, biz retina oluşumu ve gelişme yollarını ilgili çeşitli sorular ele uygulanabilir Retina gelişimi üç tanımlandığı dönemlerde, retinal diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Burada, bütün montaj larva, midpupal ve yetişkin retina (içinde tek hücre düzeyinde aşamalı PR farklılaşma görselleştirmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz
Protocol
1. Giriş
Üçüncü dönem larva, midpupal ve yetişkinlik evresi: Bu video, biz üç tanımlanan gelişimsel dönemlerinde retina diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim protokol aynı zamanda diğer pupa aşamalarında (önceki aşamalarında ilgili ayrıntılar için, 16) için çalışıyor olsa da tek bir odak düzlemli ve onların çekirdekleri tüm PR ve görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi kolayca tanımlanabilir görüntüleme için optimum olduğu gibi, biz, midpupal sahne seçti transkripsiyon faktörü ekspresyonu. Geç pupa retinanın diseksiyonu yetişkin retinanın diseksiyonu çok benzer.
İlk olarak, istenilen safhalarında larva ve pupa toplamak için nasıl gösterilmektedir. Sonra, larva 17-18 midpupal ve yetişkin retina optimal diseksiyonları edinme açıklar. İkincisi, immünohistokimyasal ve konfokal mikroskopi kullanılarak bu aşamada PR gelişimi görselleştirmek nasıl gösterilmektedir.
Böceklerin gelişim dönemi sıcaklığa bağımlıdır. Larva ve pupa arasında tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak için, biz 12 saat/12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında 25 tüm sinek stokları ° C yükseltilmesi önerilir.
Üçüncü evre larvalar: 96 Hakkında yumurtlama sonra saat (25 ° C'de), geç Üçüncü dönem larva durağı beslenme ve sonunda pupa gıda flakon, duvarlarında dolaşmaya. Yavaşça gıda flakonun duvarına bir dolaşıp üçüncü evre larva kaldırmak için yumuşak bir fırça veya bir forseps kullanın.
En az% 50 pupa ('midpupae') pupa devresi sonra yaklaşık 48 saat gözlenmiştir. Kesin zamanlama için, gıda flakon bir işaretleyici ile sadece biçimli beyaz pupa daire. Alternatif olarak, düzgün bir sahneleme flakon (morfolojik kriterler kullanarak pupası evrelemesi için, 19) elde etmek için yeni bir flakon tüm beyaz pupa taşıyın. Sonra 48 saat, dikkatle rembir forseps kullanarak flakondan midpupae ove.
Yetişkin sinekler: Bir CO 2 pad üzerinde uyutmak genç yetişkin sinekler (2-5 gün eclosion sonra). Bir forseps kullanarak kafaları çıkarın ve bir bardak saklayabilirsiniz de soğuk 1x PBS içeren çanak.
3. Diseksiyon Prosedürü (Deney başına 1-2 Hakkında hr)
Örnek topladıktan sonra, bir Sylgard diseksiyon çanak soğuk PBS bir damla koyun. Genotip başına 10-15 retinaları hakkında teşrih.
Reaktifler ve ekipman doğru kullanımı için Malzeme Güvenlik Bilgi Formları yanı sıra kurum Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi (bu protokolün sonunda tabloya bakın) danışın.
1. Larva Göz hayalsel Diskler
- Ağız kanca içeren larva, ön sonuna bulun. Sylgard çanak tabanı nazikçe larva orta kısmına basın bir forseps kullanın. Anoth kullanıner ağız kanca kapmak ve vücuttan hafifçe ve yavaşça çekin forseps. Gövde, ana kısım atılır ve beyin bağlı kalmasını hayali diskler, harici dokulardan çıkarmak için ön kısmı tutmak için ağız parçaları kullanır.
- Üç sıra cam tabak 1x PBS bir forseps ile ağız kanca kapma hayali diskler ile beyin aktarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Gerçekleştirin.
- Tespit edildikten sonra, yağ dokusu tükrük bezleri kaldırmak ve göz antennal hayalsel disk uzak beyin çekin. 'Zor' antikorların erişilebilirliğini artırmak için, epitel yüzeyinde bulunan peripodial membran, diskin anten kısmını basılı tutarak ve bir diseksiyon iğne ile uzak membran soyulması ile kaldırılabilir. Sonraki, immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin.
2. 50% pupa devresi / Midpupal retinaları
- Bir forseps ile pupa davanın posterior ucundan tutun.Yavaşça başka bir forseps ile manikür kapma pupa halinde ön yüzeyi kaldırmak ve yavaş yavaş puparium uzağa çekin. Peel uzakta kafa maruz kalan kütikül.
- Delmek dorsal anterior bölgede yatan, yumuşak çuval forsepsi 'ipuçlarını kullanın. Bu kafa erişim sağlar. Yavaşça yavaşça P20 pipet ile kafasını emerek torakstan başını ayırın. Taze soğuk 1x PBS içine pipet, baş kovduktan aşırı doku kaldırmak; baş manikür kapmak ve hortum çıkarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Geçin.
- Sürekli doku bir diseksiyon iğne ile Pierce optik lob. Lamina ve lamina / optik lob retinanın ayrılması retina arasındaki diğer kesme pimini takın. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin.
3. Yetişkin Gözler
- Bir forseps ile posterior kafa kapsül merkezinde tut ve ağız parçaları (hortum), yağ tiss kaldırue ve trakea.
- Tek bir forseps ile dorsal baş manikür tut ve hafifçe yanlara doğru çekerek beyin dokusundan gözleri ayırmak için diğer kullanın. Çoğu durumda, tabaka, beyin nöropil bir ince, şeffaf kılıf, retina bağlı kalacaktır. Bu tespit sonrası lamina kaldırmak daha kolaydır.
- Göz marjdaki kütikül çıkarın, ancak farklı çözümler retinanın transferini kolaylaştırmak için arkasında küçük bir parça bırakın. (Adım 4.1.) Fiksasyon gerçekleştirin.
- Bir forseps ile bir tarafında o kapma ve yavaşça retinanın bozmadan diğer forseps ile yanlara çekerek lamina çıkarın. Bu montaj sırasında retina üzerine katlayın olabilir gibi, rezidüel manikür çıkarın. Bu iki adım aksi lamina tarafından engellenir ve görüntüleme işlemi sırasında kütikül kalır olacaktır fotoreseptör, görselleştirme için kritik öneme sahiptir. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Geçin.
4. Fiksasyon ve Washing (Hakkında 1 saat)
- Taze (1x PBS, buz üzerinde girdap ve mağaza 360 ul% 37 formaldehit solüsyonu 40 mikrolitre sulandırmak) fiksatif hazırlanırken buz üzerine yerleştirilir üç sıra cam tabak 1x PBS disseke retinaları saklayın. Biz fiksasyon protokolü ile devam etmek ve buz (> 15 dk) uzun saklama süreleri önlemek için tavsiye.
- % 3,7 formaldehit solüsyonu 200 ul 1x PBS değiştirin. Doku fiksatif batmış olduğundan emin olun. Aksi takdirde düzgün sabit olabilir gibi bu önemlidir. Gerekirse, forseps ile hava kabarcıklarını çıkarmak ve trakea.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma cihazı üzerinde inkübe edin.
- 1x PBS ile fiksatif değiştirin ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. 30 dk (çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında) PBS içinde yıkama devam edin.
- PBST ile PBS değiştirin. PBST ile iki kere yıkayın.
- Larva göz diskleri (3.1.3.) Ve midpupal / yetişkin retina gelen laminalar gelen peripodial zarı çıkarmadan devam edin <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. İmmünohistokimya
- Engelleme: Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 20 dakika için PBST ile inkübe retina% 5, normal serum ve 200 ul PBS ile değiştirin.
- Primer antikor çözümü engelleme çözümü değiştirin. Parafilm ile üç kuyu çanak mühürleyin ve oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, gece boyunca inkübe edilir.
- PBST ile çözüm değiştirin ve 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 1 saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin.
- Gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde parafilm-mühürlü cam sıra çanak sekonder antikor çözüm ve inkübe Transfer.
- PBST ile antikor çözüm değiştirin ve üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, bir saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin. Numuneler, birkaç gün için PBST içinde tutulur ama kurumasını önlemek için en az bir gün başına bir defa PBST taze eklemek için kritik olabilir.
6. Mounting
- Larva ve midpupal retina montaj için, temiz bir cam slayt merkezine retina aktarmak için P20 kullanılır. Aşırı PBST çıkarın. Görüntüleme kolaylaştırmak amacıyla retinaları hizalamak için bir forseps kullanın.
- Retina üstüne orta montaj 10 ul ekleyin. Net oje ile 24x40-1 kapak kayma ve mühür ile onları hafifçe örtün.
- Montaj yetişkin retina için, 'köprüler' 20 hazırlamak: Bir tarafı cam her iki ucuna% 50 gliserol iki 5 ul damlacıkları ekleyin ve 22x22-1 kapak camları (kalın 0,13-0,17 mm) ile bunları kapatın.
- Bir P20 pipet ile PBST çıkarın; retina kurumasına yok emin olun. Iyi orta montaj 20 ul ekleyin. 'Köprü' cam slayt P20 ile retina aktarmak için montaj ortamı kullanın.
- Yönlendirmek için bir forseps kullanın (lensler cam slayt bakmalıdır) ve görüntüleme kolaylaştırmak için retina hizalayın. Gerekirse, P20 ile hava kabarcıklarını çıkarmak.
- Yavaş yavaşnet oje veya seloteyp ile üst ve conta kenarları bir tarafında yer 24x40-1 kapak kayma (kalın 0,13-0,17 mm). Mağaza numuneler 4 ° bir mikroskop lamı koruyucu kutusuna C (karanlıkta tutmak).
7. Temsilcisi Sonuçlar
Bu protokolün uygulanması için bir örnek olarak, video üç gelişim aşamalarında fotoreseptör farklılaşma görselleştirmek için temsili sonuçlar göstermektedir. Bir larva göz antennal disk ve midpupal retina gelişimini (Şekil 1A, B) sırasında farklı fotoreseptör tipleri etiket ve bir yetişkin retinanın iki fotoreseptör alt (Şekil 1C) görselleştirmek için iki rodopsin antikor ile boyandı antikorları ile boyandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Sorun Giderme
Bizim tecrübelerimize göre, diseksiyonlar uygulamada (birkaç haftaya kadar) gerektirir ve masada dirsek ve ön kol bekleterek ve parmak diseksiyon çanak ile temas rahat bir el pozisyonu 21 elde kolaylaştırılmaktadır. Bu şekilde, sadece başparmak, işaret ve orta parmakları ince hareketleri gerçekleştirin.
Fotoreseptörler zarar vermeden lamina Çıkarma muhtemelen en zor adımdır. Lamina kırmızı göz pigmentasyon karşı görmek çok daha kolay olduğu gibi kırmızı gözlü yabani-tip ile Pratik, beyaz gözlü mutantlar diseksiyon ilk önce uçar. Ayrıca, optimum kontrast elde etmek için diseksiyon çanak altına arkasında ve karanlık bir arka plan aydınlatma kullanın.
Bununla birlikte, göz kırmızı pigment floresan ve görüntüleme işlemi sırasında yüksek bir arka plan neden olabilir. Bu, ikincil antikorlar gelen sinyaller zayıflatabilir. İyi bir strateji ke içinep dört ila beş gün için yetişkin retina yıkama ve günde en az bir kez taze PBST ile yıkama solüsyonu yerine. Pigment yıkanmış olacak; aynı süre için deney ve kontrol genotipler yıkamak için emin olun.
2. Uygulamalar
Göz özgü kaybı ve kazanç fonksiyon-22 23 Drosophila gözün genetik manipülasyonlar ve ekranlar için özellikle güçlü bir sistem yapmak yaklaşır. Bunun yanı sıra tüm retinanın 3D rekonstrüksiyon tek-hücre analizi için son yıllarda geliştirilen hesaplama yöntemleri, yüksek çözünürlüklü 24 de mutant fenotip analizi sağlar. Bu protokol, bu nedenle göz gelişimi ve temel düzenleyici mekanizmaların 16,25-28 ilişkin sorular çeşitli için uygulanabilir.
Şekil 1. Retina bütün müç farklı gelişim aşamalarında ounts. (Macenta) Seven-up (yeşil) ve Runt karşı antikorlar ile boyanarak A) Larva göz hayali disk. B) Midpupal retina. İki antikorlar tüm fotoreseptör R1-R8 (Elav, mavi) ve R7 fotoreseptör (Prospero, camgöbeği) görselleştirmek için kullanılmıştır. C) Yetişkin retina. Işığa pigmentler RH5 (mavi) ve R8 fotoreseptörlerin iki alt tiplerinde RH6 (kırmızı) Stokastik ve birbirini dışlayan bir ifade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser HY bir Ehrman burs tarafından desteklenmiştir. H., DV, JR bir New York Üniversitesi Dekan Tez CD DJ Bursu, NIH GrantR01 EY13010 ve DFG bursu için RJJ, NIH hibe F32EY016309 Medical Research doktora sonrası dostluk için bir Jane Tabut Childs Memorial Fonu (RI 2208/1- 1). Biz el yazması üzerinde yorum yapmak için Nina Vogt ve Pamela Boodram ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
