Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Bestemmelse av gass-fase Acidities av Oligopeptides

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/4348
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

Bestemmelsen av gassfase-acidities av cystein-inneholdende oligopeptider er beskrevet. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer. De relative acidities av peptidene blir målt ved hjelp av kollisjon-indusert dissosiasjon eksperimenter, og de kvantitative acidities fastlegges ved hjelp av utvidede Cooks kinetisk metode.

Abstract

Aminosyre rester ligger på forskjellige posisjoner i foldede proteiner ofte viser ulike grader av acidities. For eksempel er en cysteinrest lokalisert ved eller nær N-enden av en heliks ofte mer surt enn det på eller nær C-terminus 1-6. Selv om omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptidene er blitt gjennomført i den kondenserte fase, spesielt i vandige oppløsninger 6-8 er resultatene ofte komplisert av løsemiddel effekter 7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter har blitt minimalisert 9,10. For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø.

Vi presenterer en metode for å måle acidities av oligopeptider i gass-fase. Vi bruker en cystein-holdig oligopeptide, Ala 3 CysNH 3 CH), slik modellen forbindelsen. Målingene er basert på de veletablerte utvidet Cooks kinetisk metode (figur 1) 11-16. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel-kvadrupol massespektrometer tilkobles med en electrospray ionisering (ESI) ion kilde (figur 2). For hvert peptid prøve, blir flere referansepunkter syrer valgt. De referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. En oppløsning av blandingen av peptidet og et referanse-syre innføres i massespektrometeret, og en gass-fase proton-bundet anionisk klynge av peptid-referanse syre dannes. Proton-bundet klyngen er masse isolert og deretter fragmentert via kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter. De resulterende fragment ion abundances er analysert ved hjelp av et forhold mellom acidities og klyngen ion dissosiasjon kinetikk. Den gass-fase surhet av peptidet er da obtainert ved lineær regresjon av termo-kinetiske tomter 17,18.

Fremgangsmåten kan anvendes på en rekke ulike molekylære systemer, inklusive organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved å sammenligne de gass-fase acidities målt eksperimentelt med de verdiene som er beregnet for forskjellige conformers kan konformasjonsendringer virkninger på acidities evalueres.

Introduction

De acidities av aminosyrer er blant de viktigste termokjemiske egenskaper som påvirker strukturene, den reaktivitet, og folding-utfolder prosesser av proteiner 9,19. Individuelle aminosyrer ofte viser ulike effektive acidities avhengig av deres steder i proteiner. Spesielt rester ligger i de aktive setene viser ofte betydelig perturberte acidities. Ett slikt eksempel er cysteinrest bosatt i de aktive områder av thioredoxin super-familien av enzymer 20,21. Den aktive sete cystein er unormalt surt forhold til de i utfoldet proteiner 3-5. Det har vært antydet at det skruelinjeformede konformasjon kan ha et betydelig bidrag til den uvanlige surhet. Det er omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptider gjennomføres i oppløsninger, spesielt i vandige oppløsninger 2,6-8. Resultatene ble ofte komplisert av løsemiddel effekter7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter minimaliseres 9,10.

For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø. Her introduserer vi en massespektrometri-basert metode for bestemmelse av gass-fase surhet. Denne tilnærmingen er omtalt som den utvidede Cooks kinetisk metode. Denne metoden har blitt vellykket anvendt for et bredt utvalg av kjemiske systemer for bestemmelse av forskjellige termokjemiske egenskaper, så som gassfase-surhet, proton affinitet, metallionet affinitet, elektronet affinitet, og ioniseringsenergien 11-15, 22-26. Vi har brukt denne metoden for å bestemme gass-fase acidities av en serie med oligo cystein-polyalanine og cystein-polyglycine peptider 17,18,27. Disse studiene viser at N-terminal cystein peptides er betydelig surere enn de tilsvarende C-terminale seg. De høye acidities av det tidligere er trolig på grunn av de spiralformede konformasjonsforandringer effekter der tiolatanion er sterkt stabilisert av samspillet med helix makro-dipol. På grunn av den ikke-flyktige og termisk labile naturen av peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske tilnærmingen finnes idag for å produsere rimelig nøyaktig syre-base termokjemiske mengder av peptidene 28.

Den generelle ordningen og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist på figur 1. Fastsettelsen av gass-fase surhet av et peptid (AH) starter med dannelsen av en serie av proton-bundet cluster anioner, [A • H • En i] ¯ (eller [A ¯ • H + • Å i ¯] ¯), i ionekilden region av massespektrometer, hvor A og A i ¯ ¯ er deprotonert former av peptidet ogreferanse syrer, henholdsvis. De referanse syrer er organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. Referansepunktene syrer bør ha strukturer som ligner hverandre (men ikke nødvendigvis lik den for peptid). Likheten av strukturene mellom referanse syrer sikrer likheten av entropies av deprotonering blant dem. Proton-bundet klynge anioner er valgt masse og collisionally aktivert og deretter dissosiert med sammenstøt-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter for å gi det tilsvarende monomere anioner, A og A i ¯ ¯, med hastighetskonstanter av K og k i, henholdsvis, er vist i figur 1a. Dersom sekundære fragmentations er ubetydelige, overflod forholdet av CID-fragment-ioner, [A ¯] / [Å i ¯], representerer et tilnærmet mål for forholdet mellom hastighetskonstantene, k / k i. Under forutsetning av at det ikke er omvendt aktiion barrierer for både dissosiasjon kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, Ln [A •] / [Å i ¯], vil bli lineært korrelert til gassfase-surhet av peptidet (Δ syre H) og de ​​av referanse-syrer (Δ syre H-i), som vist i figur 1b. I denne ligningen er Δ syre H avg gjennomsnittlig gass-fase surhet av referanse syrer, er Δ (Δ S) entropi sikt (som kan antas konstant dersom referanse syrer er strukturelt lik hverandre), er R universelle gasskonstanten og T eff er den effektive temperaturen i systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter som avhenger av flere eksperimentelle variabler, inkludert kollisjonsenergien.

Verdien av gassfaseprosessen surhet bestemmes ved å konstruere to sett av termo-kinetiske plott. Det første settet er obskje ved å plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot Δ syre H i - Δ syre H gj.snitt, som vist i figur 4a. Lineær regresjon vil gi et sett med rette linjer med bakkene i X = 1 / RT eff og fanger av Y = - [Δ syre H - Δ syre H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Det andre settet av tomter blir oppnådd ved å plotte de resulterende avskjærer (y) fra det første sett mot de tilsvarende bakker (X), som vist i figur 4b. Lineær regresjon produserer en ny linje med en helling på Δ syre H - Δ syre H avg og en fange av Δ (Δ S) / R. Verdien av Δ syre H blir deretter oppnådd fra helling og entropi sikt, Δ (Δ S), innhentesskjæringspunktet.

Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer sammenknyttet med en elektrospray ionisering (ESI) ionekilde. Et skjematisk diagram av massespektrometer er vist i figur 2.. De CID eksperimenter utføres etter masse å velge de proton-bundet cluster anioner med den første kvadrupol enhet og gi dem muligheten til å gjennomgå kollisjoner med argon atomer lekket inn i kollisjonen kammer som er holdt ved et trykk på rundt 0,5 mTorr. De dissosiasjon produktet ioner er masse analysert med den tredje kvadrupol enhet. CID spektra er registrert på flere kollisjon energier med m / z serien bred nok til å dekke alle mulige sekundære fragmenter. De CID produkt ion intensiteter måles ved å sette instrumentet i den valgte reaksjon overvåking (SRM) modus der skanningen er fokusert på utvalgte produktområdene ioner. De CID eksperimenter utføres på fire forskjellige kollisjon energier, tilsvarendecenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, henholdsvis. Senter-til-masse energien beregnes ved hjelp av ligningen: E = E cm lab [M / (M + m)], hvor E er lab kollisjonsenergien i laboratoriet ramme, m er massen av argon, og M er massen av den proton-bundet klynge ion.

I denne artikkelen bruker vi oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell sammensatte. C-terminalen er amidert, og tiolgruppe (SH) av cystein-rester vil være det sure område. Valget av egnet referanse syrer er avgjørende for en vellykket måling av gassfase-surhet. Den ideelle referanse syrer er strukturelt lik (til hverandre) organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær at av peptider. For peptid A 3 CH, halogenerte seks carboxylic syrer er valgt som referanse-syrer. De seks referanse syrer er kloreddiksyre (MCAH), bromeddiksyre (mbah), Difluoreddiksyre (DFAH), dikloreddiksyreanhydrid syre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddiksyre (TFAH). To av dem, vil DFAH og mbah, benyttes til å illustrere den protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Tilberedning av prøven Solutions

  1. Tilberedes først stamløsninger av peptid og de seks referanse RNA ved bruk av en blandet oppløsningsmiddel av metanol og vann i et volumforhold 01:01. De stamløsninger bør ha en konsentrasjon på omtrent 10 -3 M.
  2. Vei opp 1 mg av den faste prøven peptid, A 3 CH, i et 1,5 ml Eppendorf-rør og tilsett 1,0 ml av blandet oppløsningsmiddel av metanol og vann, og blandes ved hjelp av en vortex.
  3. Vei opp 1 mg Difluoreddiksyre (DFAH) og tilsett 1,0 ml av det blandede oppløsningsmiddel av metanol og vann, og blandes ved hjelp av en vortex.
  4. Bruk samme fremgangsmåte for å gjøre de lager løsninger for de andre fem referansen syrer kloreddisksyre (MCAH), bromeddiksyre (mbah), dikloreddiksyreanhydrid acid (DCAH), dibromoacetic acid (DBAH), og trifluoreddiksyre (TFAH).
  5. Tegn omtrent 50 ul av peptid-lager-løsning i et 1,5 ml Eppendorf-rør, og trekker ca 50 ul av stamløsningen av DFAH inn i SAmeg Eppendorf tube. Fortynn den blandede oppløsningen med 900 pl av den blandet oppløsningsmiddel av metanol og vann for å oppnå en sluttkonsentrasjon på omtrent 10 -4 M. Denne fortynnede løsningen skal brukes som prøveløsningen for massespektrometri målinger. Det faktiske forhold av peptidet til referansen syre, så vel som den endelige konsentrasjon av prøveløsningen vil bli justert basert på de ion signal abundances observert i massespektrometer.
  6. Bruk samme fremgangsmåte for å fremstille eksempler på løsninger av peptid med de andre fem referanse syrer.

2. Massespektrometri Måling 1: Proton-bundet Cluster Ion Formation

  1. Det første trinn av massespektrometri målingen er å generere stabile proton-bundet cluster ioner av peptidet med en referanse-syre.
  2. Sett instrumentet i det negative ion MS ESI-modus med nål spenning på -4,5 kV, kapillær spenning på omtrent -35 V, og tørking gasstemperaturenholdt ved 150 ° C. Sett Q1 toppbredden og Q3 toppbredden både den kalibrerte skala (toppbredden er et instrument parameter som kan brukes til å justere oppløsningen av toppene. Den "kalibrerte skala"-innstilling gjør det mulig å vise smale topper for bedre separasjon peak ). Den kapillære spenningen og tørking gasstemperaturen kan justeres for å forbedre de observerte ion abundances.
  3. Sette mot omtrent 0,5 ml av prøveløsningen av peptid-DFAH i en 1 ml Hamilton sprøyte og koble sprøyten til ESI nål innløp ved hjelp av PEEK-slanger. Deretter plasserer sprøyten på sprøyten pumpen. Slå på sprøytepumpe for å sette mot prøveoppløsning inn i ESI nålen med den strømningshastighet på 10 mL / min.
  4. Slå på ESI nål spenning for å aktivere ESI prosessen. Slå på detektoren. En masse-spektrum displayet skal være observert i profilen. Hvis skjermen er i Tyngdepunktet modus, bytter du til profilen modus. Se proton-bundet klynge ion formasjon ved overvåkingsng toppen ved m / z 428. Signalet overflod av klyngen ion kan justeres ved å finjustere apparatet. En viktig parameter er den kapillære spenning. Man kan manuelt endre kapillær spenning (typisk i området fra -20 til -50 V) for å maksimere overflod av toppen ved m / z 428.

3. Massespektrometri Måling 2: CID Bracketing Experiments

  1. Det neste trinnet er å utføre CID bracketing eksperiment.
  2. Når overflod av klyngen ion når ønsket verdi (rundt 100 mV), slår instrumentet til MS / MS-modus. I denne modusen, Q1 fungerer som et filter for å isolere massen klyngen ion, Q2 virker som kollisjonen celle, og Q3 funksjoner som massen analysator.
  3. Sett kollisjon gass (argon, i dette tilfellet) trykket på 0,5 mTorr og kollisjonen energi på 17 eV. Tre topper bør observeres i massen spekteret vindauget. Toppen ved m / z 428 svarer til den klyngen ion, [DFA • H • En 3 CS] ¯. De to topper ved m / z 332 og m / z 95 tilsvare deprotonert peptid (A 3 CS ¯) og deprotonert Difluoreddiksyre (DFA ¯), henholdsvis. Den mindre topp ved m / z 298 er en sekundær fragment fra deprotonert peptid. Erverve en CID spektrum for to min, figur 3a.
  4. Utføre lignende CID eksperimenter og få en CID spektrum for prøven løsning av peptid med bromeddiksyre (mbah), Figur 3b.
  5. Utføre lignende CID eksperimenter og erverve CID spektra for eksempler på løsninger av peptid med alle andre referanse syrer. Den resulterende CID-spektra blir kvalitativt lik Figur 3a og 3b, men de m / z-verdier og den relative topphøyder vil være forskjellige.

4. Massespektrometri Måling 3: Kinetic Method

  1. Det siste trinnet er å erverve SRM spektra.
  2. Slå spekteret skjermen til Tyngdepunktet og sette instrumentet til den valgte reaksjon overvåking (SRM)-modus. Holde m / z 428 som den isolerte ion ved den første kvadrupol (Q1), og fyll i fire massene (masse-til-ladning forholdstall) som skal overvåkes av den tredje kvadrupol (Q3). De fire masser er m / z 428 (klyngen ion) m / z 332 (peptid ion) m / z 298 (fragment av peptidet ion), og m / z 95 (DFA ¯ ion). Hold kollisjon gasstrykket på 0,5 mTorr.
  3. Sett kollisjon energi til 11,7 eV og erverve spektra for 5 min.
  4. Endre kollisjon energi til 17,6 eV og erverve spektra for 5 min.
  5. Endre kollisjon energi til 23,4 eV og 29,3 eV, og tilegne seg spektra ved begge kollisjon energier i 5 min.
  6. Foreta liknende målinger for peptid med alle andre referanse syrer.

5. Data Analysis

  1. Kopiere verdiene av de ion intensiteter fra all SRM spektra på et Excel-regneark.
  2. Beregn CID produkt ion forgreningsforhold, ln ([A ¯] / [A i ¯]), målt for alle seks proton-bundet klynger på alle fire kollisjon energier. Sample-verdier er vist i tabell 1..
  3. Plotte verdier av ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot verdiene av Δ syre H i - Δ syre H avg. Dette vil gi fire tomter som tilsvarer data på fire kollisjon energier, figur 4a.
  4. Pakk verdiene av bakkene og avskjærer ved lineær regresjon av de fire tomter. I dette tilfellet, løypene er positive verdier og de fanger er negative verdier. Gi symbolet "X" til bakkene og symbolet "Y" til fanger. Resultatene er vist i tabell 2.. Multiplisere verdiene av Y ved -1 og bruke symbolet Y 'for å representere de positive verdier (slik at y-aksen til disspille positive verdier). Legg merke til at denne konverteringen valgfritt så lenge som de tilsvarende verdier brukes til å lage plottet for neste trinn.
  5. Plott verdiene av Y 'mot verdiene av X, figur 4b. Lineær regresjon av tomten gir en helling på 1,706 og en fange av -0,536. Skråningen tilsvarer Δ syre H - Δ syre H avg. Verdien av Δ syre H gj.snitt er kjent å være 330,5 kcal / mol, som er bestemt av et sett av utvalgte referanse syrer. Verdien av gassfase-surhet av peptidet blir deretter oppnådd fra skråningen: Δ syre H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. De CID bracketing eksperimenter gi informasjon om de relative acidities av peptid i forhold til de valgte referanse syrer. To representative CID-spektra av peptidet (A CH 3) med to referanse-syrer, DFAH og mbah, er vist i figur 3.. I figur 3a ione overflod (topphøyde) av peptidet ion er svakere enn den av DFA ¯, og i figur 3b er det ion overflod av peptidet ion sterkere enn MBA ¯. De to spektra antyder at gassfase-surheten av peptid er i størrelsesorden mellom acidities av disse to referanse-syrer.
  2. Den kvantitative verdi av gassfase-surhet av peptidet blir bestemt fra de kvantitative CID eksperimenter. De termo-kinetiske tomter for dissosiasjonen av de proton-bundet klynger av peptidet med de seks referanse syrer er vist i figur 4.. Lineær regresjon av flatene i henhold til termo-kinetisk relativtonship mellom gassfase-syre og KID produkt ion forgrening forhold (Figur 1b) angir verdien av gassfase-surhet av peptidet A 3 CH, som er 332,2 kcal / mol. Eksempel på verdier av bakkene og avskjærer er vist i tabellene 1 og 2..

Figur 1
Figur 1. Den generelle ordningen med utvidet Cooks kinetisk metode. A) Ordningen med proton-bundet klynge ion dissosiasjon. B) termo-kinetiske forholdet mellom gass-fase acidities og CID produktet ion forgrening ratio. I denne ligningen er Δ syre H i gass-fase surhet verdien av de enkelte referanse syrer, er Δ syre H avg på enverage gassfase-surhet av referanse syrer, er Δ syre H gassfase-surhet for peptidet, er Δ (Δ S) entropien sikt, R er den universelle gasskonstanten, T og eff er den effektive temperaturen i systemet .

Figur 2
Figur 2. En skjematisk tegning av en trippel-kvadrupol massespektrometer. ESI er elektrospray ionisering ionekilden. Q1 og Q3 representerer den første og tredje kvadrupol-enheter, henholdsvis. Ved å utføre den CID eksperiment, er proton-bundet cluster ioner masse valgt av Q1, og føres inn i kollisjon cellen til å kollidere med argon (Ar) atomer lekket inn i kollisjon celle, og de resulterende fragment-ioner blir analysert av Q3.

Figur 3 Figur 3. Den CID spektra for proton-bundet cluster ioner av peptid med to referanse syrer, en) [DFA • H • En 3 C] ¯ og b) [MBA • H • En 3 C] ¯. Spektrene plottes som den relative ion overflod mot m / z verdi.

Figur 4
Figur 4. De termo-kinetiske tomter for peptid med seks referanse syrer samlet på fire kollisjon energier a) Handlingen i Y = ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot X = Δ syre H i -. Δ syre H avg . b) Tomten på Y '= [Δ syre H - Δ syre H </ Em> avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R mot X = 1 / RT eff.

Tabell 1. Verdier av CID produkt ion forgreningsforhold, ln ([A ¯] / [A i ¯]), for klyngen ioner av peptid med DFAH og mbah.

HA i 11.7 eV 17.6 eV 23.4 eV 29.3 eV
MCAH 3,68 3,50 3,39 3,45
Mbah 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0,442 -0,268 -,0921 0.167
DCAH -2,60 -2,41 -2,22 -2,13
DBAH -2,43 -2,44 -2,49 -2,60
TFAH -5,41 -5,02 -4,71 -4,44
Tabell 2. Verdier av bakkene (x) og avskjærer (Y) som følge av lineær regresjon av det første sett av termo-kinetiske plott.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den vellykkede måling av gassfase-surhet av et peptid avhengig i stor grad av valget av egnede syrer referanse. Den ideelle referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha lignende strukturer til hverandre. Dette vil sikre en lignende entropi av deprotonering for hvert av referanse syrer i settet. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær dem av peptidene. For kortere cystein-inneholdende oligopeptider med amidert C-termini, den halogenerte karboksylsyrer er egnet referanse syrer. Et viktig skritt mot vellykkede CID eksperimenter er dannelsen av de stabile proton-bundet cluster ioner med høy overflod. Stabiliteten og den overflod kan i stor grad forbedres ved å justere forholdet av peptidet til referansen syre, konsentrasjonen av prøveløsningen, og de instrumentelle tilstander (slik som nålen spenning, tørkinggass-temperatur, og den kapillære spenning). En viktig medvirkende tilstanden er kapillær spenning (eller kjegle spenning for noen andre typer instrumenter). En forsiktig er å unngå å bruke eksempler på løsninger som er for konsentrert.

Metoden som er beskrevet er ikke begrenset til oligopeptider. Fremgangsmåten kan anvendes på en rekke ulike molekylære systemer, blant annet polare organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, organometalliske forbindelser, oligonukleotider, og peptid-etterligne polymerer. I tillegg til ved hjelp av trippel-kvadrupol massespektrometer, kan eksperimentet også utføres ved hjelp av ione feller og Q-TOF massespektrometre.

Peptidet anvendt i dette forsøk, ble syntetisert i vårt laboratorium ved hjelp av den vanlige metoden for fastfase-peptidsyntese 29-31. Den Rink amid harpiks ble anvendt som den faste bærer, hvorved man fikk amidet C-terminalen. Fordelen med Cooks kinetiske metoden er at små urenheter i than peptid prøven influerer ikke på surhet målinger, så lenge de urenheter ikke har de samme massene peptidene eller referanse-syrer.

De eksperimentelle målinger kan være kombinert med beregningsformelen studier for å undersøke konformasjonsendringer virkninger på de acidities. Beregningsorientert studier gir spådommer av conformations av peptidene som samsvarer med deres beregnede acidities. Ved å sammenligne de målte acidities eksperimentelt med de verdiene som er beregnet, kan konformasjonen av peptidene bli evaluert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Materials

E Colli, eV

X

1 / RT eff

Y

- [(Δ syre H - Δ syre H gj.snitt) / RT eff - Δ (Δ S) / R]

11.7 0,744 -0,728
17.6 0.700 -0,665
23.4 0,665 -0,611
29.3 0.645 -0,553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. , W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. , (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. , (2000).

Tags

Kjemi biokjemi molekylærbiologi surhet kinetisk metode kollisjon-indusert dissosiasjon trippel-kvadrupol massespektrometri oligopeptides peptider massespektrometri MS
Bestemmelse av gass-fase Acidities av Oligopeptides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y.,… More

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter