Summary
Nanoparticules virales végétales (VNPs) sont prometteurs plates-formes pour des applications dans le domaine biomédical. Ici, nous décrivons les procédures pour les installations VNP propagation, la purification, la caractérisation et la bioconjugaison. Enfin, nous montrons l'application de VNPs prise d'origine tumorale et d'imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris et l'imagerie de fluorescence.
Abstract
L'utilisation des nanomatériaux a le potentiel de révolutionner la science des matériaux et de la médecine. À l'heure actuelle, un certain nombre de différentes nanoparticules sont étudiés pour des applications en imagerie et la thérapie. Nanoparticules virales (VNPs) dérivés de plantes peut être considérée comme auto-assemblées bionanomatériaux avec les tailles et formes définies. Les virus des plantes à l'étude dans le laboratoire Steinmetz comprendre des particules icosaédriques formés par virus de la mosaïque du niébé (CPMV) et virus de la mosaïque de Brome (BMV), qui sont tous deux à 30 nm de diamètre. Nous développons également des structures en forme de tige et filamenteux provenant des virus végétaux suivants: virus de la mosaïque du tabac (TMV), qui forme des tiges rigides avec des dimensions de 300 nm 18 nm par le virus de la pomme de terre, et X (PVX), qui forment des particules filamenteuses 515 nm de longueur et de 13 nm de largeur (le lecteur est renvoyé aux refs. 1 et 2 pour de plus amples informations sur VNPs).
dans la plante, sont exceptionnellement stable et biocompatible. En outre, VNPs sont «programmables» des unités, qui peuvent être spécialement conçus en utilisant des méthodes de modification génétique ou bioconjugaison chimiques 3. La structure de VNPs est connu pour une résolution atomique, et des modifications peuvent être effectuées avec une précision spatiale à l'échelle atomique 4, un niveau de contrôle qui ne peut pas être réalisé en utilisant des nanomatériaux synthétiques actuels avec state-of-the-art technologies.
Dans cet article, nous décrivons la propagation de CPMV, PVX, TMV, et BMV en Vigna ungiuculata et Nicotiana benthamiana. Protocoles d'extraction et de purification pour chaque VNP sont donnés. Méthodes de caractérisation des purifiées et chimiquement VNPs marqués sont décrits. Dans cette étude, nous nous concentrons sur chétiquetage des emical VNPs avec fluorophores (par exemple Alexa Fluor 647) et de polyéthylène glycol (PEG). Les colorants de faciliter le suivi et la détection des VNPs 5-10, et PEG réduit immunogénicité des nanoparticules protéiques tout en améliorant leurs propriétés pharmacocinétiques 8,11. Nous démontrons tumeur ralliement de VNPs PEGylées aide d'un modèle de xénogreffe de tumeur de souris. Une combinaison de l'imagerie de fluorescence des tissus ex vivo avec une carte Maestro du système d'imagerie, la quantification de fluorescence dans les tissus homogénéisés et la microscopie confocale est utilisée pour étudier la biodistribution. VNPs sont effacées par le système réticulo-endothélial (RES); tumeur homing est atteint passive par une perméabilité accrue et de rétention (EPR) Effet 12. La nanotechnologie VNP est un puissant plug-and-play à l'image de la technologie et de traiter les sites de la maladie in vivo. Nous développons davantage VNPs d'effectuer des cargaisons de drogue et des fragments d'imagerie clinique pertinents, ainsi que des ligands spécifiques d'un tissu àcibler des récepteurs moléculaires surexprimés dans le cancer et les maladies cardiovasculaires.
Protocol
1. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Propagation
- Réglez la chambre de contrôle plante d'intérieur à 15 h du jour (100% de la lumière, 25 ° C, 65% d'humidité) et 9 h de nuit (lumière 0%, 22 ° C, 60% d'humidité).
- Inoculer plantes en fonction de l'échéancier dans le tableau 1.
| CPMV | PVX, TMV, et BMV |
| Jour 0: Usine 3 niébé graines / pot. | Jour 0: Usine ~ 30 N. benthamiana graines / pot. Fertiliser une fois par semaine avec 1 cuillère à soupe d'engrais / 5 L d'eau. |
| Jour 14: Re-pot N. benthamiana à 1 plant / pot. | |
| Jour 10: infecter les feuilles feuilles primaires avec CPMV (5 μg/50 pl / feuille) par inoculation mécanique à l'aide d'une fine couche de carborundum. | Jour 28: Infect trois à five laisse avec PVX, TMV, ou BMV (5 μg/50 pl / feuille) par inoculation mécanique à l'aide d'une fine couche de carborundum. |
| Feuilles de récolte et de stocker à -80 ° C: Jour 20 | Feuilles de récolte et de stocker à -80 ° C: Jour 42 |
Tableau 1. Calendrier de plus en plus, l'infection et la récolte des feuilles.
Remarque: seule la propagation CPMV est démontrée à titre d'exemple.
2. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Purification
Remarque: Toutes les étapes sont effectuées sur de la glace ou à 4 ° C.
- Homogénéiser 100 g de feuilles congelées dans un mélangeur standard à l'aide de 2 volumes de tampon froid (voir le tableau 2). Filtrer à travers 2-3 couches de gaze.
- Pour PVX, ajuster le pH à 6,5 avec 1 M HCl. Ajouter 0,2% (p / v) d'acide ascorbique et 0,2% de sodium (p / v) sulfite.
- Centrifuger homogénat de plante brute à 5500 xg pendant 20 min. Recueillir le surnageant.
- Pour BMV, couche 25 ml de surnageant au-dessus de 5 ml de 10% (p / v) une solution de saccharose. Centrifugeuse à 9.000 g pendant pastilles h et remettre en suspension dans une solution de CsCl 3 38,5% (p / v). Mélanger en agitant pendant 5 heures, puis passez à l'étape 2.12.
- Extraire la matière végétale par ajout de 0,7 volumes de 1:1 (v / v) chloroforme :1-butanol. Incorporer le mélange pendant 30-60 min.
- Centrifuger à 5500 xg solution pendant 20 min. Recueillir la phase aqueuse supérieure.
- Ajouter du NaCl à 0,2 M et 8% (p / v) de PEG (PM 8.000). Pour TMV, ajouter 1% (v / v) de Triton X-100. Agiter pendant au moins 1 heure, puis laisser reposer au moins 1 heure.
- Centrifuger la solution à 15.000 xg pendant 15 min. Resuspendre le culot dans 10 ml de tampon. Pour PVX, ajouter 0,1% β-mercaptoéthanol et de l'urée à 0,5 M.
- Centrifuger à 8000 xg pendant 30 minutes et recueillir le surnageant.
- Ultracentrifugeuse surnageant à 160.000 xg pendant 3 heures. Resuspendre le culot dans 5 ml de tampon overnight.
- Préparer un gradient de saccharose 10-40% en utilisant des volumes égaux de 10%, 20%, 30% et 40% de saccharose dans le tampon (plus lourd en premier). Laissez le gradient de s'équilibrer pendant la nuit à température ambiante.
- Ultracentrifugeuse culot remis en suspension sur gradient de saccharose à 100.000 xg pendant 2 h (24 h pour le BMV).
- Recueillir bande diffusion de la lumière et de dialyser contre du tampon.
- Caractériser les VNPs (ci-dessous) et conserver à 4 ° C. Pour stockage à long terme, stocker à -80 ° C.
| CPMV et TMV | 0,1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM de K 2 HPO 4 |
| PVX | 0,5 M tampon borate (pH 7,8) 0,5 M d'acide borique Ajuster le pH avec NaOH |
| BMV | SAMA tampon (pH 4,5) 250 mM d'acétate de sodium MgCl2 10 mM 2 mM de β-mercaptoéthanol (ajouter frais) |
Tableau 2. Tampons et leurs recettes pour chaque VNP.
Remarque: seule la propagation CPMV est démontrée à titre d'exemple.
3. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Caractérisation
- Effectuer la spectroscopie UV / visible de déterminer la concentration de VNPs.
- Mesurer l'absorbance de 2 ul d'échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.
- Déterminer la concentration de particules et de colorants à l'aide de la loi de Beer-Lambert (A = εcl, où A est l'absorbance, ε est le coefficient d'extinction, c est la concentration, et l est la longueur du trajet). La longueur du trajet est de 0,1 cm pour le NanoDrop.
Les coefficients d'extinction VNP-spécifiques sont les suivants:
CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm)
PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm)
TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm)
BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm)
- Analyser des particules par chromatographie d'exclusion stérique des protéines liquide rapide (FPLC).
- L'utilisation d'un Superose 6 exclusion de taille de colonne et l'explorateur ÄKTA, charge de 50 à 100 mg de VNPs dans 200 ul de 0,1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,0).
- Définir détecteurs à 260 nm (acide nucléique), 280 nm (protéines) et la longueur d'onde d'excitation de tous les colorants fixés.
- Fonctionner à un débit de 0,5 ml / min pendant 72 min.
- Le profil d'élution et A260: A280 nm indique si la préparation VNP est pur et si les particules sont intacts et assemblé.
L'A260 suivante: 280 ratios indiquent une préparation VNP pur:
CPMV: 1,8 ± 0,1
PVX: 1,2 ± 0,1
TMV:1,1 ± 0,1
BMV: 1,7 ± 0,1
- Effectuer dénaturant (préfabriqué NuPAGE) Bis-Tris Polyacrylamide électrophorèse sur gel en gradient 4-12% d'analyser la pureté de la préparation et de la conjugaison de protéines d'enveloppe individuels.
- Ajouter 3 ml de tampon d'échantillon LDS 4x à 10 ug de particules dans 9 pi de tampon phosphate de potassium. Ajouter un supplément de 1 ul de tampon d'échantillon LDS 4x et 3 pl de β-mercaptoéthanol à BMV pour réduire le nombre élevé de liaisons disulfures.
- Incuber dans un bloc chauffant pendant 5 min à 100 ° C.
- Charger les échantillons sur un gel SDS.
- Exécuter des échantillons à 200 V pendant 1 heure dans du tampon MOPS 1x.
- Documenter le gel sous lumière UV pour visualiser les protéines fluorescentes manteau.
- En cas de non-protéine fluorescente, coloration au bleu de Coomassie (0,25% (p / v) de bleu de Coomassie R-250, l'acide 30% (v / v) de méthanol, 10% (v / v) acétique) pendant 1 heure.
- Décolorer avec du méthanol 30%, 10% d'acide acétique pendant une nuit. Change de la solution si nécessaire.
- Documenter le gel sous lumière blanche.
- Analyser l'intégrité des particules par microscopie électronique à transmission (MET).
- Diluer les échantillons à 0,1-1 mg / ml dans 20 pl d'eau DI.
- Placez gouttes de 20 ul des échantillons sur Parafilm.
- Couvrir gouttes avec une grille de MET et laisser reposer pendant 2 min. Évacuent l'excès de solution sur la grille d'un papier filtre.
- Laver la grille en plaçant sur une goutte d'eau DI, puis mèche sèche.
- Tache grille en plaçant une goutte de 20 pl de 2% (p / v) de l'acétate d'uranyle pendant 2 min. Évacuent l'excès tache avec un papier filtre.
- Laver la grille une fois de plus dans l'eau.
- Observez la grille sous un microscope électronique à transmission.
4. Conjugaison chimique de VNPs avec le PEG et fluorophores, de purification et de caractérisation
- Pour les calculs pour les réactions ci-dessous, la masse molaire des VNPs sont:
CPMV: 5.6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4,6 x 10 6 g / mol - Conjuguer les colorants et les lysines PEG à la surface de CPMV et PVX en utilisant une seule étape de N-hydroxy succinimide réaction de couplage: Ajouter 2.500 équivalents molaires (tous les excès molaires se référer à un excès molaire par VNP) de Alexa Fluor 647 ester de succinimidyle et 4.500 équivalents de NHS- PEG (MW 5.000) dissous dans du DMSO à CPMV dans 0,1 M de tampon phosphate de potassium. Lorsque vous travaillez avec le PVX, ajouter un excès molaire de 10.000 NHS-colorant et NHS-PEG. Régler les volumes de tampon et le DMSO tels que la concentration finale de CPMV et PVX est de 2 mg / ml et la teneur en DMSO est 10% du volume réactionnel total. Incuber le mélange réactionnel pendant une nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. CPMV et PVX ont 300 et 1270 lysines adressables, respectivement. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus surmodification chimique de CPMV et PVX: 13-15).
- Des colorants et des conjugués de PEG à tyrosines du TMV par couplage de diazonium suivi par le cuivre (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition.
- Préparer sel de diazonium (alcyne) en mélangeant 400 ul de 0,3 M monohydrate d'acide p-toluène, 25 ul de nitrite de sodium 3,0 M et 75 ul de 0,68 M distillée 3-éthynylaniline dissous dans l'acétonitrile à 4 ° C pendant 1 heure.
- Ajouter 3,3 ml de tampon borate, pH 8,8, contenant 100 mM de NaCl à 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solution mère).
- Réagir à l'TMV 450 ul du sel (alcyne) solution de diazonium dans un bain de glace pendant 3 heures pour ajouter une ligature alcyne poignée de TMV par couplage de diazonium. La solution va se transformer en une couleur brun clair. TMV a 2140 tyrosines disponibles pour la conjugaison.
- Purifier le produit final en utilisant un coussin de sucrose comme décrit à l'étape 4.4.
- Fixez azide fonctionnelle Alexa Fluor 647 et PEG-azide (MW 5000) using de cuivre (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC). Ajouter 2 équivalents d'un colorant et de PEG-protéine d'enveloppe par l'azide et l'incuber avec 1 mM de CuSO 4, 2 mM AMG, et 2 mM de l'ascorbate de sodium à température ambiante pendant 15 min. Régler le volume tampon de telle sorte que la concentration finale de réaction est de TMV 2 mg / ml. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus sur la modification chimique des TMV: 16,17).
- Conjuguer colorants à lysines et de PEG à cystéines de la cystéine BMV mutant (cBMV):
- Ajouter 2.000 équivalents molaires de l'Oregon Green 488 succinimidylester dissous dans du DMSO à cBMV dans 0,1 M de tampon TNKM (50 mM Tris base, 50 mM de NaCl, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4). Régler les volumes de tampon et le DMSO tels que la concentration finale de BMV est de 1 mg / ml et la teneur en DMSO est 10% du volume réactionnel total. Incuber le mélange réactionnel pendant une nuit à 4 ° C à l'abri de la lumière.
- Purifier les particules à l'aide centrifiltres fugue comme décrit à l'étape 4.4.
- Ajouter un excès molaire de 2.000 PEG-maléimide (MW 2.000) en utilisant les mêmes conditions de réaction que précédemment et incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures à 4 ° C. cBMV dispose de 180 lysines réactifs et cystéines. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus sur la modification chimique de BMV: 18).
- Purification: Faire passer la solution à travers un coussin de saccharose à 40% (p / v) à 160.000 xg pendant 2,5 heures. Re-dissoudre le culot dans un tampon. Alternativement, on dialyse contre un tampon approprié en utilisant 10 filtres kDa de spin cut-off.
- Caractérisation: VNPs PEGylées et marquée par fluorescence sont analysées en utilisant les méthodes décrites ci-dessus: UV / visible spectroscopie, électrophorèse sur gel SDS, FPLC, et TEM (non montré, cependant, se référer aux figures 6 et 7).
5. Le ciblage de la tumeur et d'imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris
- Culture HT-29 des cellules humaines de cancer du côlon dans le milieu RPMI supplémenté avec 5% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine à 37 ° C dans 5% de CO 2 en utilisant 175 cm 2 flacons de culture cellulaire.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et la récolte par incubation avec 5 ml de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Inactiver la trypsine avec 5 ml de milieu RPMI. Recueillir les cellules par centrifugation à 500 xg pendant 5 min. à 4 ° C et remettre en suspension dans RPMI frais à 5x10 6 cellules/50 ul de milieu (déterminer le nombre total de cellules en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre). Mélanger avec un volume égal de matrigel avant l'injection (garder toutes les solutions et les réactifs stériles).
- Achat des vieilles de six semaines NCR souris nu / nu et les maintenir à un régime de luzerne gratuit pendant 2 semaines. [Note:. Toutes les procédures sur les animaux doit être approuvé IACUC] Provoquer des xénogreffes de tumeurs par injection sous-cutanée de 5x10 6 cellules/100 ul / tumeur dans les flancs (2 tumeurs / souris) à l'aide d'une jauge de 18 1/2 stérileaiguille. Surveiller régulièrement les animaux. Mesurer la taille de la tumeur à l'aide des étriers et de permettre aux tumeurs de se développer à un volume moyen de 20 mm 3 (dans les 12 prochains jours). Attribuer des souris à deux groupes différents au hasard: PBS et VNP (n = 3 animaux / groupe / l'heure du point). En utilisant un 1 ml 28 seringue à insuline de calibre, administrer par injection intraveineuse dans la veine caudale 100 pi de PBS stérile ou 10 mg / kg de formulation VNP.
Remarque: les expériences de culture de tissus et d'études avec des animaux vivants ne sera pas démontrée. Démonstration pratique sera limitée au traitement des tissus et d'acquisition de données. Pour une référence sur le HT-29 modèle de xénogreffe de tumeur, le lecteur est renvoyé à la réf 19.
Trois techniques sont utilisées pour évaluer la tumeur ralliement de VNPs:
- L'imagerie par fluorescence à l'aide du système d'imagerie Maestro: Sacrifice souris à différents moments (2, 24, et 72 h) en utilisant le CO 2gaz. Disséquer les animaux et accises tous les principaux organes (cerveau, cœur, poumons, la rate, les reins et le foie) ainsi que les tumeurs sur les flancs, placer les tissus sur du parafilm, et analyser avec l'instrument d'imagerie de fluorescence par excitation jaune et filtres d'émission (800 ms exposition) pour détecter la présence de signaux de fluorescence dans des tissus provenant de A647 (marqueur conjugué à la VNPs). Enregistrez les images et d'analyser les intensités de fluorescence à l'aide du logiciel ImageJ 1.44o ( http://imagej.nih.gov/ij ). Comparez le motif de l'absorption des VNPs dans les tumeurs avec d'autres tissus importants avec le temps.
- Après l'imagerie, couper chaque tissu en deux et incorporez la moitié dans du composé OCT pour l'analyse cryo-coupes et confocale. Recueillir l'autre moitié en pré-pesés cryo-flacons et geler immédiatement les utiliser N 2 liquide. Conserver à -80 ° C jusqu'au moment de transformation.
- Quantification de fluorescence: Recordon tissus poids. Décongeler les tissus congelés à la température ambiante et les placer dans différents tubes Falcon de 50 ml contenant 1 ml de PBS. En utilisant un homogénéisateur de tissus de poche, d'homogénéiser les tissus pour 2-3 min dans du PBS puis transférer le broyat de microtubes. Centrifuger les homogénats pendant 10 min à 13000 xg pour éliminer les tissus non homogénéisé.
- Pipeter 100 ul du surnageant à partir des tissus de chaque groupe (formulations PBS et VNP / points dans le temps) dans une plaque de 384 puits noir UV. Évaluer l'intensité de fluorescence (Ex / Em longueurs d'onde 600/665) en utilisant un lecteur de plaque. Normaliser les valeurs obtenues par les poids fluorescentes tissus.
- Immunohistochimie: cryo-microtome Préparer sections (10 mm) et conserver à -20 ° C. Colorer les coupes de tissus pour les noyaux cellulaires (DAPI) et le marqueur des cellules endothéliales (marqué au FITC anti-souris CD31 anticorps). Effectuer des analyses de microscopie confocale pour cartographier la localisation vasculaire et intra-tumorale marquée par fluorescence de VNPs.
Remarque: Cette procédure ne sera pas démontrée, les données représentatives sont présentés dans la figure 8. Pour une référence sur l'immunohistochimie et les méthodes de coloration décrites, le lecteur est renvoyé à la réf 19.
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Discussion
Ce protocole fournit une approche pour la modification chimique de VNPs et leurs applications pour l'imagerie in vivo de tumeurs. Les techniques d'imagerie de fluorescence des animaux, la quantification de fluorescence, et l'immunohistochimie présentés ici sont utiles pour étudier la biodistribution et l'évaluation de la tumeur de ralliement. Ces techniques fournissent des informations précieuses concernant l'accès des nanoparticules dans la tumeur via l'effet EPR. En combinant les résultats des différentes méthodes d'analyse, nous obtenons une approche puissante pour évaluer la localisation et la biodistribution des VNPs.
Avant ces études peuvent être effectuées Cependant, il est essentiel d'obtenir une préparation de virus pur. En dehors de l'inoculation mécanique, une alternative possible pour la propagation de VNP est agroinfiltration, ce qui peut avoir une transformation élevée et un taux d'accumulation. Lorsque la propagation des VNPs, des précautions doivent être prises pour maintenir les plantes infectées par différents virus séparée que to éviter la contamination croisée. En particulier, le TMV est facilement se propager et transmis mécaniquement. Une autre étape importante pour être conscient de se réaliser purification de virus sur la glace ou à 4 ° C. Tous les tampons doivent être utilisés glacée. La plus basse température est nécessaire pour éviter tout dommage aux VNPs à la suite des protéases et des enzymes d'oxydation présentes dans la matière végétale.
Les faibles rendements de VNPs purifiés peuvent résulter de multiples facteurs. Une cause possible pourrait être l'âge des VNPs utilisés pour la multiplication. Il est préférable d'utiliser des préparations de virus les plus récents. Par exemple, les 24 C-terminales des acides aminés de la protéine d'enveloppe S de CPMV sont nécessaires à la suppression du silençage génique. La suppression de cette zone de surface exposée au produit au fil du temps en raison de la protéolyse. Bien que la structure et la stabilité de CPMV ne sont pas affectés, retard de croissance et retard de propagation de virus les résultats. Une autre source de la faiblesse des rendements est la perte des VNPs cours de la purification. Notamment àattention doit être accordée à la remise en suspension après l'étape de précipitation PEG. Resuspension incomplète de la pastille se traduirait par VNP perdu dans le culot de l'étape de centrifugation ultérieure.
Dans l'ensemble, les chimies bioconjugaison présentées ici sont simples. 14,17,18,21 Les méthodes de caractérisation décrites sont utiles pour assurer l'intégrité des particules et de déterminer l'étendue de la conjugaison. Excès molaire peut être ajustée en conséquence en fonction de l'application et du degré de fonctionnalisation souhaitée.
Lorsque vous travaillez avec le modèle de xénogreffe de souris, la pratique la plus essentielle est la suite une technique aseptique. En outre, l'injection veine de la queue est une étape cruciale pour assurer une dose uniforme de l'échantillon pour chaque souris. Il peut être utile de placer la queue dans l'eau tiède avant de se dilater la veine. Une autre considération est autofluorescence pour l'imagerie de fluorescence et les mesures. En règle générale, une autofluorescence tissulaire est minimisanted-delà de 600 nm, ce qui rend les colorants grande longueur d'onde avec des maxima d'émission au-delà de 600 nm optimales que la sonde d'imagerie. Toutefois, les régimes normaux de souris se composent de luzerne contenant de la chlorophylle, qui émet une fluorescence rouge aussi. En conséquence, il est nécessaire de maintenir les souris sur un régime alimentaire de la luzerne libre pendant au moins 2 semaines pour réduire un bruit de fond. Enfin, il convient de noter que la détection par fluorescence en utilisant l'imagerie de fluorescence est limitée en raison de différences dans les environnements de diffusion et d'absorption des différents tissus. Par conséquent, l'imagerie est utilisée pour la visualisation et comme méthode initiale de biodistribution de surveillance, tandis que la quantification est réalisée en utilisant des homogénats de tissu.
Certains avantages de l'utilisation VNPs que la plate-forme technologique sont leur monodispersité, la biocompatibilité, la capacité d'augmenter la production, et sur la susceptibilité à des stratégies de fonctionnalisation multiples. En plus de génie chimique, le génie génétique est illustré ici avec l'introductiontion de cystéines à BMV comme cible pour bioconjugaison. Le génie génétique pourrait également être utilisé pour introduire le ciblage des peptides ou des balises d'affinité. Alors que le protocole décrit utilise deux marqué (colorant et PEG) des particules, les études en cours cherchent à intégrer des fonctionnalités supplémentaires (c.-à-thérapeutique et le ciblage) pour améliorer la spécificité tissulaire et l'efficacité thérapeutique. Ainsi, cette approche jette les bases pour de futures applications biomédicales.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NIBIB subventions R00 EB009105 (pour NFS) et P30 EB011317 (pour NFS), un NIH / NIBIB bourse de formation T32 EB007509 (à AMW), un Case Western Reserve University interdisciplinaire Alliance Investment Grant (pour NFS), et un cas Comprehensive Cancer Center de subvention P30 CA043703 (pour NFS). Nous remercions les chercheurs de laboratoire Steinmetz étudiants de premier cycle pour leur soutien pratique: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Alors, et Paul Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
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