Summary
Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l'applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.
Abstract
L'uso di nanomateriali ha il potenziale per rivoluzionare scienza dei materiali e della medicina. Attualmente, un certo numero di differenti nanoparticelle sono stati studiati per applicazioni di imaging e terapia. Nanoparticelle virali (VNPs) derivati da piante può essere considerata autoassemblati bionanomaterials con dimensioni e forme definite. Virus di piante in esame in laboratorio Steinmetz sono particelle formate icosaedrici dal virus del mosaico Cowpea (CPMV) e virus del mosaico Brome (BMV), entrambi i quali sono 30 nm di diametro. Stiamo anche sviluppando strutture a forma di bastoncello e filamentose derivati dai virus delle piante seguenti: virus del mosaico del tabacco (TMV), che costituisce aste rigide con dimensioni di 300 nm da 18 nm, e Virus X della patata (PVX), che formano le particelle filamentose 515 nm di lunghezza e 13 nm in larghezza (si rimanda il lettore al refs. 1 e 2 per ulteriori informazioni sulla VNPs).
in planta, sono eccezionalmente stabili e biocompatibili. Inoltre, VNPs sono "programmabili" unità, che possono essere specificamente progettati utilizzando modificazione genetica o metodi chimici bioconjugation 3. La struttura di VNPs è noto risoluzione atomica, e modifiche possono essere effettuate con precisione spaziale a livello atomico 4, un livello di controllo che non può essere raggiunto utilizzando nanomateriali di sintesi con le attuali state-of-the-art.
In questo articolo, si descrive la propagazione di CPMV, PVX, TMV, e BMV a Vigna ungiuculata e piante di Nicotiana benthamiana. Protocolli di estrazione e purificazione di ogni VNP sono dati. Metodi per la caratterizzazione dei purificato e VNPs chimicamente etichettati sono descritti. In questo studio, ci concentriamo su chetichettatura emical di VNPs con fluorofori (es. Alexa Fluor 647) e polietilenglicole (PEG). I coloranti facilitare il monitoraggio e la rilevazione dei VNPs 5-10, e PEG riduce immunogenicità delle nanoparticelle proteici migliorando loro farmacocinetica 8,11. Dimostriamo tumore homing di VNPs pegilati utilizzando un modello di topo xenotrapianto del tumore. Una combinazione di imaging di fluorescenza di tessuti ex vivo utilizzando Maestro Imaging System, quantificazione fluorescenza nei tessuti omogeneizzati, e microscopia confocale viene utilizzato per studiare biodistribuzione. VNPs vengono cancellati tramite il sistema reticolo-endoteliale (RES); tumore homing avviene passivamente attraverso la permeabilità maggiore e ritenzione (EPR) effetto 12. La nanotecnologia VNP è un potente plug-and-play della tecnologia per l'immagine e il trattamento di siti di malattia in vivo. Stiamo sviluppando ulteriormente VNPs portare carichi di droga e frazioni di imaging clinicamente rilevanti, così come tessuto-specifici ligandi dibersaglio i recettori molecolari sovraespresse nel cancro e malattie cardiovascolari.
Protocol
1. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Propagazione
- Impostare la camera di impianto al coperto di controllo per 15 ore del giorno (100% di luce, 25 ° C, 65% di umidità) e 9 ore di notte (0% luce, 22 ° C, 60% di umidità).
- Inoculare le piante in base alla timeline nella Tabella 1.
| CPMV | PVX, TMV, e BMV |
| Giorno 0: Stabilimento 3 fagiolo dall'occhio semi / pot. | Giorno 0: Pianta ~ 30 N. benthamiana semi / pot. Concimare una volta alla settimana con 1 cucchiaio di concime / 5 L di acqua. |
| Giorno 14: Re-pot N. benthamiana a 1 pianta / vaso. | |
| Giorno 10: Infect Foglie primarie con CPMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum. | Giorno 28: Infect tre a five lascia con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum. |
| Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: Giorno 20 | Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: giorno 42 |
Tabella 1. Timeline per la coltivazione, infettando, e la raccolta foglie.
Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio.
2. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Purificazione
Nota: Tutte le operazioni sono eseguite su ghiaccio oppure a 4 ° C.
- Omogeneizzare 100 g di foglie congelati in un frullatore standard utilizzando due volumi di tampone freddo (vedi Tabella 2). Filtrare 2-3 strati di garza.
- Per PVX, regolare il pH a 6,5 con 1 M HCl. Aggiungere 0,2% (w / v) di acido ascorbico e 0,2% (w / v) di sodio sulfite.
- Centrifugare pianta omogenato grezzo a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante.
- Per BMV, strato 25 ml di surnatante oltre 5 ml di 10% (w / v) di saccarosio. Centrifugare a 9000 xg per 3 ore e risospendere pellet in soluzione CsCl 38,5% (w / v). Mescolare agitando per 5 ore, poi continuare con il passo 2.12.
- Estrarre materiale vegetale con l'aggiunta di 0,7 volumi di 1:1 (v / v) cloroformio :1-butanolo. Mescolare impasto per 30-60 min.
- Centrifugare soluzione a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere la fase acquosa superiore.
- Aggiungere a 0,2 M NaCl e l'8% (w / v) PEG (MW 8000). Per TMV, anche aggiungere 1% (v / v) Triton X-100. Mescolare per almeno 1 ora, quindi lasciate riposare per almeno 1 ora.
- Centrifugare soluzione a 15.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet in 10 ml di tampone. Per PVX, aggiungere 0,1% β-mercaptoetanolo e urea a 0,5 M.
- Centrifugare a 8000 xg per 30 minuti e raccogliere il supernatante.
- Ultracentrifuga surnatante a 160.000 xg per 3 ore. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone overnight.
- Preparazione di un gradiente di saccarosio 10-40% con volumi pari al 10%, 20%, 30%, e 40% di saccarosio in tampone (più pesante prima). Lasciare che il gradiente di equilibrare notte a temperatura ambiente.
- Ultracentrifuga sedimento risospeso su gradiente di saccarosio a 100.000 xg per 2 ore (24 ore per BMV).
- Raccogliere banda light scattering e dializza contro tampone.
- Caratterizzare le VNPs (sotto) e conservare a 4 ° C. Per la conservazione a lungo termine, conservare a -80 ° C.
| CPMV e TMV | 0,1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 |
| PVX | 0,5 M tampone borato (pH 7,8) 0,5 M di acido borico Aggiustare il pH con NaOH |
| BMV | SAMA tampone (pH 4,5) 250 mM acetato di sodio 10 mM MgCl 2 2 mM β-mercaptoetanolo (aggiungere fresco) |
Tabella 2. Buffer e le loro ricette per ogni VNP.
Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio.
3. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Caratterizzazione
- Effettuare spettroscopia UV / visibile per determinare la concentrazione di VNPs.
- Misurare l'assorbanza di 2 ml di campione utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.
- Determinare la concentrazione di particelle e coloranti utilizzando la legge di Lambert-Beer (A = εcl, dove A è l'assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, c è la concentrazione, ed L è la lunghezza del percorso). La lunghezza del percorso è di 0,1 cm per la NanoDrop.
Le VNP-specifici coefficienti di estinzione sono:
CPMV: 8.1 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm)
PVX: 2.97 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm)
TMV: 3.0 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm)
BMV: 5.15 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm)
- Analizzare le particelle di dimensioni esclusione cromatografia liquida veloce proteine (FPLC).
- Utilizzando un Superose 6 esclusione dimensionale e la colonna Explorer ÄKTA, carico 50-100 pg di VNPs in 200 pl di tampone fosfato di potassio 0,1 M (pH 7,0).
- Impostare rivelatori a 260 nm (acido nucleico), 280 nm (proteine), e la lunghezza d'onda di eccitazione di eventuali coloranti allegate.
- A una velocità di flusso di 0,5 ml / min per 72 min.
- Il profilo di eluizione e A260: A280 nm indica se la preparazione VNP è puro e se le particelle sono intatti e assemblati.
Il seguente A260: 280 rapporti indicano una preparazione pura VNP:
CPMV: 1.8 ± 0.1
PVX: 1,2 ± 0,1
TMV:1,1 ± 0,1
BMV: 1.7 ± 0.1
- Eseguire la denaturazione (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilammide 4-12% elettroforesi su gel di pendenza di analizzare la purezza della preparazione e la coniugazione di proteine di rivestimento individuali.
- Aggiungere 3 ml di tampone campione 4x LDS a 10 mg di particelle in 9 ml di tampone fosfato di potassio. Aggiungere un ulteriore 1 ml di tampone campione LDS 4x e 3 ml di β-mercaptoetanolo per BMV di ridurre l'elevato numero di legami disolfuro.
- Incubare in blocco termico per 5 minuti a 100 ° C.
- Caricare i campioni su un gel SDS.
- Eseguire i campioni a 200 V per 1 ora in esecuzione 1x MOPS buffer.
- Documentare il gel sotto la luce UV per visualizzare proteine di rivestimento fluorescenti.
- Per non-proteina fluorescente, macchia con blu Coomassie (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, acido 30% (v / v) di metanolo, 10% (v / v) acetico) per 1 ora.
- Decolorare con 30% metanolo, 10% acido acetico durante la notte. Change la soluzione, se necessario.
- Documentare il gel sotto luce bianca.
- Analizzare l'integrità delle particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
- Diluire i campioni di 0,1-1 mg / ml in 20 ml di acqua deionizzata.
- Mettere 20 gocce ul dei campioni su parafilm.
- Coprire gocce con una griglia TEM e lasciate riposare per 2 min. Stoppino dalla soluzione in eccesso sulla griglia con carta da filtro.
- Lavare griglia immissione in una goccia di acqua deionizzata quindi assorbente asciutto.
- Stain griglia mettendo su una goccia 20 ml di 2% (w / v) di acetato di uranile per 2 min. Wick l'eccesso macchia con carta da filtro.
- Lavare rete ancora una volta in acqua.
- Osservare griglia sotto un microscopio elettronico a trasmissione.
4. Coniugazione chimica del VNPs con PEG e fluorofori, purificazione e caratterizzazione
- Per i calcoli per le reazioni di sotto, la massa molare dei VNPs sono:
CPMV: 5.6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4,6 x 10 6 g / mol - Coniugare coloranti e PEG per lisine superficiali di CPMV e PVX usando un one-step N-idrossi succinimmide reazione di accoppiamento: Aggiungi 2500 equivalenti molari (tutti gli eccessi molari consultare eccesso molare per VNP) di Alexa Fluor 647 estere succinimidil e 4.500 equivalenti di NHS- PEG (MW 5000) disciolto in DMSO ad CPMV in 0,1 M tampone fosfato di potassio. Quando si lavora con PVX, aggiungere un eccesso molare di 10000 NHS-colorante e NHS-PEG. Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di CPMV e PVX è di 2 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a temperatura ambiente al riparo dalla luce. CPMV e PVX avere 300 e 1270 lisine indirizzabili, rispettivamente. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letturemodificazione chimica di CPMV e PVX: 13-15).
- Coloranti Coniugato e PEG per tirosine di TMV con il raccordo di diazonio seguito da rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione.
- Preparare sale di diazonio (alchini) mescolando 400 pl di 0,3 M p-toluensolfonico monoidrato, 25 pl di nitrito di sodio 3,0 M e 75 ml di 0,68 M distillata 3-ethynylaniline disciolto in acetonitrile a 4 ° C per 1 ora.
- Aggiungere 3,3 ml di tampone borato, pH 8,8, contenente 100 mM NaCl a 1,25 ml di TMV (20 mg / ml di soluzione concentrata).
- Reagiscono con il TMV 450 microlitri della sale di diazonio (alchini) soluzione in un bagno di ghiaccio per 3 ore per aggiungere una legatura alchino maniglia a TMV mediante accoppiamento di diazonio. La soluzione si trasformerà in un colore marrone chiaro. TMV ha 2140 tirosine disponibili per coniugazione.
- Purificare il prodotto finale utilizzando un cuscino di saccarosio come descritto nel passaggio 4,4.
- Collegare azide-funzionale Alexa Fluor 647 e PEG-azide (MW 5.000) using di rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). Aggiungere 2 equivalenti di coloranti e PEG-azide per proteina di rivestimento e incubare con 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, e 2 mM ascorbato di sodio a temperatura ambiente per 15 min. Regolare il volume di accumulo tale che la concentrazione di reazione finale di TMV è di 2 mg / ml. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori approfondimenti sulla modificazione chimica di TMV: 16,17).
- Coniugare tinture per lisine e PEG per cisteine di cisteina mutante BMV (cBMV):
- Aggiungere 2.000 equivalenti molari di Oregon verde 488 succinimmidil estere disciolti in DMSO al cBMV in 0,1 M TNKM tampone (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di BMV è 1 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce.
- Particelle Purificare con centrifugafiltri fugati, come descritto al punto 4.4.
- Aggiungere 2.000 eccesso molare di PEG-maleimmide (MW 2000) utilizzando le stesse condizioni di reazione come prima e incubare la miscela di reazione per 2 ore a 4 ° C. cBMV dispone di 180 lisine reattivi e cisteine. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letture sulla modificazione chimica di BMV: 18).
- Purificazione: Passare la soluzione attraverso un cuscino di saccarosio al 40% (w / v) a 160.000 xg per 2,5 ore. Nuovamente sciogliere il precipitato in un tampone. In alternativa, dializza contro tampone appropriato con 10 kDa di cut-off filtri rotativi.
- Caratterizzazione: VNPs pegilato e marcato in fluorescenza vengono analizzate utilizzando i metodi sopra descritti: UV / visibile spettroscopia, elettroforesi su gel SDS, FPLC e TEM (non mostrato, tuttavia, fare riferimento alle figure 6 e 7).
5. Targeting tumorale e imaging utilizzando un modello Xenograft mouse
- Cultura HT-29 cellule umane di cancro al colon in mezzo RPMI supplementato con 5% FBS, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% di L-glutammina a 37 ° C in 5% CO 2 con 175 centimetri due fiasche di coltura cellulare.
- Lavare le cellule due volte con PBS sterile e raccolto mediante incubazione con 5 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Inattivare la tripsina con 5 ml di terreno RPMI. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 500 xg per 5 min. a 4 ° C e risospendere in fresco RPMI a 5x10 6 cells/50 medie microlitri (determinare il numero totale delle cellule con Trypan Blue e un emocitometro). Mescolare con un volume uguale di matrigel prima dell'iniezione (mantenere tutte le soluzioni e reagenti sterile).
- Procurarsi sei settimana fa NCR nu / nu topi e mantenerli su una dieta di erba medica gratuita per 2 settimane. [Nota:. Tutte le procedure di polizia deve essere approvato IACUC] indurre xenotrapianti tumorali mediante iniezione sottocutanea di 5x10 6 cells/100 pl / tumore nei fianchi (2 tumori / mouse) utilizzando un 18 1/2 calibro sterileago. Monitorare gli animali regolarmente. Misurare la dimensione del tumore, utilizzando pinze e lasciare i tumori di crescere fino a un volume medio di 20 mm 3 (entro i prossimi 12 giorni). Assegnare i topi a due gruppi diversi in modo casuale: PBS e VNP (n = 3 animali / gruppo / ora punto). Utilizzando una siringa da 28 ml uno scartamento insulina, somministrare per iniezione endovenosa vena della coda 100 pl di PBS sterile o 10 mg / kg formulazione VNP.
Nota: esperimenti di coltura dei tessuti e gli studi con animali vivi non sarà dimostrato. Hands-on dimostrazione sarà limitata alla lavorazione dei tessuti e acquisizione dati. Per un riferimento sul modello HT-29 xenograft tumorale, si rimanda il lettore al rif. 19
Tre tecniche sono utilizzate per valutare tumore homing di VNPs:
- Imaging di fluorescenza utilizzando Maestro Imaging System: topi Sacrifice a tempi diversi (2, 24, e 72 ore) con emissioni di CO 2gas. Staccare gli animali e tutti gli organi principali accise (cervello, cuore, polmoni, milza, reni e fegato), insieme con i tumori sui fianchi, posizionare i tessuti su parafilm, e analizzare con strumenti di imaging di fluorescenza con eccitazione giallo e filtri di emissione (800 ms esposizione) per rilevare la presenza di segnali fluorescenti nei tessuti (derivato da A647 etichetta coniugato ai VNPs). Salvare le immagini e analizzare le intensità di fluorescenza utilizzando ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Confrontare il modello della captazione delle VNPs nei tumori con altri tessuti importanti con il tempo.
- Dopo l'imaging, tagliare ogni tessuto a metà e incorporare una metà in OCT per l'analisi crio-sezionamento e confocale. Raccogliere l'altra metà in pre-pesati crio-fiale e immediatamente congelare utilizzando liquido N 2. Conservare a -80 ° C fino al momento per l'ulteriore elaborazione.
- Fluorescenza quantificazione: Recordone tessuti pesi. Scongelare tessuti congelati a temperatura ambiente e metterli in separati provette Falcon da 50 ml contenenti 1 ml di PBS. Utilizzo di un omogeneizzatore palmare tessuto, omogeneizzare i tessuti per 2-3 min in PBS poi trasferire l'omogeneizzato ai tubi microcentrifuga. Centrifugare omogenati per 10 minuti a 13.000 xg per rimuovere tessuto non omogeneizzato.
- Pipettare 100 pl del supernatante dai tessuti di ogni gruppo (formulazioni PBS e VNP / punti temporali) in una piastra a 384 UV ben nero. Valutare l'intensità di fluorescenza (Ex / Em lunghezze d'onda 600/665) utilizzando un lettore di piastre. Normalizzare i valori ottenuti fluorescenti dai pesi dei tessuti.
- Immunoistochimica: Preparare crio-microtomo sezioni (10 micron) e conservare a -20 ° C. Stain sezioni di tessuto per nuclei cellulari (DAPI) e marcatore delle cellule endoteliali (coniugati con fluoresceina anti-topo CD31 anticorpo). Effettuare analisi di microscopia confocale per mappare la localizzazione vascolare e intra-tumorale di fluorescenza marcata VNPs.
Nota: Questa procedura non sarà dimostrato, dati rappresentativi sono mostrati in Figura 8. Per un riferimento immunoistochimica ed i metodi di colorazione descritti, si rimanda il lettore al rif. 19
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Discussion
Questo protocollo fornisce un approccio per la modifica chimica di VNPs e delle loro applicazioni per imaging in vivo del tumore. Le tecniche di imaging di fluorescenza animale, quantificazione fluorescenza, l'immunoistochimica e presentati in questa sede sono utili per lo studio di biodistribuzione e la valutazione del tumore homing. Queste tecniche forniscono informazioni importanti per quanto riguarda l'accesso delle nanoparticelle al tumore attraverso l'effetto EPR. Combinando i risultati dei vari metodi analitici, otteniamo un approccio efficace per valutare la localizzazione e biodistribuzione delle VNPs.
Prima di questi studi possono essere eseguite tuttavia, è essenziale per ottenere una preparazione pura virus. Oltre inoculazione meccanica, una possibile alternativa per la propagazione VNP è agroinfiltration, che può avere una trasformazione elevata e velocità di accumulo. Quando propagare le VNPs, occorre prestare attenzione a mantenere le piante infettate con virus diversi separato come to evitare la contaminazione incrociata. In particolare, TMV è prontamente diffusa e trasmessa meccanicamente. Un altro passo fondamentale per essere consapevoli di sta svolgendo purificazione virus su ghiaccio o a 4 ° C. Tutti i buffer deve essere utilizzato freddo ghiaccio. La temperatura più bassa è necessario per evitare danni ai VNPs come risultato di proteasi ed enzimi ossidanti presenti nel materiale vegetale.
Basse rese di VNPs purificati possono derivare da molteplici fattori. Una possibile causa potrebbe essere l'età dei VNPs usati per la moltiplicazione. È preferibile utilizzare preparazioni di virus più recenti. Per esempio, il terminale C 24 aminoacidi della proteina di rivestimento del CPMV S sono necessarie per la soppressione del silenziamento genico. Delezione di questa regione superficie esposta si verifica nel tempo a causa proteolisi. Anche se la struttura e la stabilità dei CPMV non sono interessati, ritardo di crescita e ritardo diffusione dei risultati dei virus. Un'altra fonte di prodotti bassi la perdita dei VNPs durante la purificazione. Particolare atenzione dovrebbe essere data al gradino dopo risospensione PEG precipitazione. Risospensione del pellet incompleta comporterebbe VNP perso nel pellet della fase successiva centrifugazione.
Nel complesso, le chimiche bioconjugation qui presentati sono semplici. 14,17,18,21 I metodi di caratterizzazione descritti sono utili per garantire l'integrità e la determinazione di particelle portata di coniugazione. Eccessi molari può essere regolata di conseguenza a seconda dell'applicazione e del grado di funzionalizzazione desiderata.
Quando si lavora con il modello di xenotrapianto del mouse, la pratica più essenziale sta seguendo una tecnica asettica. Inoltre, l'iniezione nella vena della coda è un passaggio fondamentale per garantire un dosaggio uniforme del campione per ciascun topo. Essa può contribuire a mettere la coda in acqua tiepida prima di dilatare la vena. Un'altra considerazione è autofluorescenza per l'imaging di fluorescenza e misure. In generale, autofluorescenza dei tessuti è minimizzandoed oltre 600 nm di lunghezza d'onda, rendendo coloranti lunghe con emissione massimi oltre 600 nm ottimali come la sonda imaging. Tuttavia, le diete del mouse normali sono costituiti da clorofilla contenenti erba medica, che reagisce in rosso anche. Come risultato, è necessario mantenere i topi a una dieta alfalfa libero per almeno 2 settimane per ridurre segnali di sfondo. Infine, va rilevato che la rivelazione della fluorescenza utilizzando imaging di fluorescenza è limitata a causa delle differenze negli ambienti di scattering e di assorbimento dei vari tessuti. Di conseguenza, l'imaging è utilizzato per la visualizzazione e come metodo iniziale per biodistribuzione monitoraggio, mentre quantificazione viene eseguita utilizzando omogenati di tessuto.
Alcuni vantaggi di utilizzare VNPs come piattaforma tecnologica sono il loro monodispersity, biocompatibilità, capacità di scale-up di produzione, e riconducibilità alle strategie di funzionalizzazione più. Oltre a ingegneria chimica, l'ingegneria genetica è illustrato qui con l'introduzionezione di cisteine per BMV come obiettivo per bioconjugation. Ingegneria genetica potrebbe anche essere utilizzato per introdurre il targeting peptidi o tag di affinità. Mentre il protocollo descritto utilizza dual-marcato (colorante e PEG) particelle, studi in corso stanno guardando incorporare funzionalità aggiuntive (ad esempio, terapie e targeting) per migliorare la specificità del tessuto e l'efficacia terapeutica. Pertanto, questo approccio pone le basi per le future applicazioni biomediche.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIBIB sovvenzioni R00 EB009105 (per NFS) e P30 EB011317 (per NFS), il NIH / NIBIB formazione concessione T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinare Alliance Investment Grant (per NFS), e una causa Comprehensive Cancer Center di sovvenzione P30 CA043703 (per NFS). Ringraziamo i ricercatori laboratorio per studenti universitari Steinmetz per le loro mani-sul sostegno: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Quindi, e Paul Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
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