Summary
Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.
Abstract
El uso de nanomateriales tiene el potencial de revolucionar la medicina y ciencia de los materiales. Actualmente, un número de diferentes nanopartículas están siendo investigados para aplicaciones en la formación de imágenes y terapia. Nanopartículas virales (VNPs) derivados de plantas pueden ser considerados como auto-ensambladas bionanomaterials con tamaños definidos y formas. Los virus de plantas bajo investigación en el laboratorio de Steinmetz incluyen partículas icosaédricas formadas por virus del mosaico del caupí (CPMV) y el virus del mosaico de Brome (BMV), ambos de los cuales son 30 nm de diámetro. También estamos desarrollando estructuras en forma de varilla y filamentosas derivados de los virus de las plantas siguientes: virus del mosaico del tabaco (TMV), que forma varillas rígidas con unas dimensiones de 300 nm por 18 nm, y Potato virus X (PVX), que forman partículas filamentosas 515 nm de longitud y 13 nm de ancho (se remite al lector a las refs. 1 y 2 para obtener más información sobre VNPs).
en planta, son excepcionalmente estables, y biocompatible. También, VNPs son "programables" unidades, que pueden ser específicamente diseñados mediante modificación genética o métodos químicos bioconjugación 3. La estructura de VNPs se conoce a resolución atómica, y modificaciones pueden llevarse a cabo con precisión espacial a nivel atómico 4, un nivel de control que no se puede lograr utilizando nanomateriales sintéticos con estado actual de la técnica de las tecnologías.
En este trabajo se describe la propagación de CPMV, PVX, TMV, y la BMV en Vigna ungiuculata y plantas de Nicotiana benthamiana. Protocolos de extracción y purificación para cada VNP se dan. Métodos para la caracterización de purificado y VNPs químicamente marcados se describen. En este estudio, nos centramos en chetiquetado emical de VNPs con fluoróforos (por ejemplo, Alexa Fluor 647) y polietilenglicol (PEG). Los colorantes de facilitar el seguimiento y la detección de los VNPs 5-10, y PEG reduce la inmunogenicidad de las nanopartículas proteináceos al tiempo que mejora su farmacocinética 8,11. Demostramos tumor homing de VNPs PEGilados utilizando un modelo de ratón xenograft tumor. Una combinación de imágenes de fluorescencia de tejidos ex vivo mediante Maestro del sistema de imágenes, la cuantificación de fluorescencia en tejidos homogeneizados, y la microscopía confocal se utiliza para estudiar la biodistribución. VNPs se eliminan a través del sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing se logra pasivamente a través del aumento de la permeabilidad y retención (EPR) efecto 12. La nanotecnología VNP es un potente plug-and-play de tecnología para el tratamiento de la imagen y sitios de la enfermedad in vivo. Seguimos desarrollando VNPs para llevar cargas de drogas y restos de formación de imágenes clínicamente relevantes, así como ligandos específicos de tejido aorientar receptores moleculares sobreexpresa en el cáncer y la enfermedad cardiovascular.
Protocol
1. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Propagación
- Poner la cámara de planta de interior controla a 15 horas del día (100% de luz, 25 º C, 65% de humedad) y 9 h de la noche (0% de luz, 22 ° C, 60% de humedad).
- Se inoculan las plantas de acuerdo a la escala de tiempo en la Tabla 1.
| CPMV | PVX, TMV, y BMV |
| Día 0: Planta 3 caupí semillas / maceta. | Día 0: Plant ~ 30 N. benthamiana semillas / maceta. Fertilizar una vez por semana con un fertilizante cucharada 1/5 l de agua. |
| Día 14: Re-pot N. benthamiana en 1 planta / maceta. | |
| Día 10: Infect deja las hojas primarias con CPMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio. | Día 28: Infect tres a five deja con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio. |
| Día 20: Hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C. | Día 42: las hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C. |
Tabla 1. Cronograma para el cultivo, infectando, y cosechar las hojas.
Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo.
2. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Purificación
Nota: Todos los pasos se llevan a cabo en hielo o a 4 º C.
- Homogeneizar 100 g de hojas congeladas en un mezclador estándar utilizando 2 volúmenes de tampón frío (véase la Tabla 2). Filtrar a través de 2-3 capas de estopilla.
- Para PVX, ajustar el pH a 6,5 utilizando 1 M de HCl. Añadir 0,2% (w / v) de ácido ascórbico y 0,2% (w / v) de sodio sulfiTE.
- Centrifugar homogeneizado crudo planta a 5.500 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante.
- Para BMV, capa de 25 ml de sobrenadante sobre 5 ml de 10% (w / v) de solución de sacarosa. Se centrifuga a 9.000 xg durante 3 horas y se resuspende el pellet en solución de CsCl 38,5% (w / v). Mezclar por agitación durante 5 horas, y luego continúe con el paso 2.12.
- Extraer material de la planta mediante la adición de 0,7 volúmenes de 1:1 (v / v) de cloroformo :1-butanol. Revuelva la mezcla durante 30-60 min.
- Centrifugar la solución a 5.500 xg durante 20 min. Recoger la fase acuosa superior.
- Añadir NaCl a 0,2 M y 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Para TMV, también añadir 1% (v / v) de Triton X-100. Se agita durante al menos 1 h, después se deja reposar durante al menos 1 h.
- Se centrifuga la solución a 15.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento en 10 ml de tampón. Para PVX, añadir 0,1% β-mercaptoetanol y urea a 0,5 M.
- Centrifugar a 8.000 xg durante 30 min y recoger el líquido sobrenadante.
- Ultracentrífuga sobrenadante a 160.000 xg durante 3 hr. Resuspender el sedimento en 5 ml de tampón overnight.
- Preparar un gradiente de sacarosa al 10-40% usando volúmenes iguales de 10%, 20%, 30% y 40% de sacarosa en tampón (el más pesado primero). Permitir que el gradiente de equilibrar durante la noche a temperatura ambiente.
- Ultracentrífuga precipitado resuspendido sobre gradiente de sacarosa a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV).
- Recoger banda de dispersión de luz y diálisis frente a tampón.
- Caracterizar los VNPs (abajo) y se almacena a 4 º C. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar a -80 ° C.
| CPMV y TMV | 0,1 M de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 |
| PVX | 0,5 M de tampón borato (pH 7,8) 0,5 M de ácido bórico Ajustar el pH con NaOH |
| BMV | SAMA tampón (pH 4,5) 250 mM de acetato de sodio 10 mM MgCl 2 2 mM β-mercaptoetanol (añadir nuevo) |
Tabla 2. Buffers y sus recetas para cada VNP.
Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo.
3. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Caracterización
- Espectroscopía UV / visible para determinar la concentración de VNPs.
- Medir la absorbancia de 2 l de muestra utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.
- Determinar la concentración de partículas y colorantes utilizando la ley de Beer-Lambert (A εcl =, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, c es la concentración, y l es la longitud del camino). La longitud del camino es de 0,1 cm para el NanoDrop.
Los coeficientes de extinción VNP-específicos son:
CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
- Analizar las partículas por exclusión de tamaño rápido cromatografía líquida de proteínas (FPLC).
- El uso de un Superose 6 columna de exclusión por tamaño y el Explorador de ÄKTA, carga de 50-100 g de VNPs en 200 l de 0,1 M tampón fosfato de potasio (pH 7,0).
- Establecer detectores a 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína), y la longitud de onda de excitación de los colorantes unidos.
- Ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min durante 72 min.
- El perfil de elución y A260: A280 nm indica si la preparación VNP es puro y si las partículas están intactos y montados.
El siguiente A260: 280 proporciones indican una preparación pura VNP:
CPMV: 1,8 ± 0,1
PVX: 1,2 ± 0,1
TMV:1,1 ± 0,1
BMV: 1,7 ± 0,1
- Realizar desnaturalización (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilamida 4-12% electroforesis en gel de gradiente para analizar la pureza de la preparación y la conjugación a proteínas de recubrimiento individuales.
- Añadir 3 ml de tampón de muestra LDS 4x a 10 g de las partículas en 9 l de tampón de fosfato de potasio. Añadir un adicional de 1 l de tampón de muestra LDS 4x y 3 l de β-mercaptoetanol a BMV para reducir el elevado número de enlaces disulfuro.
- Incubar en bloque de calor durante 5 minutos a 100 ° C.
- Cargar muestras en un gel de SDS.
- Ejecutar las muestras a 200 V durante 1 h en 1x MOPS funcionamiento de amortiguación.
- Documentar el gel bajo luz UV para visualizar las proteínas fluorescentes abrigo.
- Para no fluorescente de proteínas, tinción con azul de Coomassie (0,25% (w / v) azul brillante de Coomassie R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 hr.
- Destain con 30% de metanol, 10% de ácido acético durante la noche. Change la solución si se requiere.
- Documentar el gel con luz blanca.
- Analizar la integridad de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Diluir las muestras a 0.1-1 mg / ml en 20 l de agua DI.
- Coloque 20 gotas l de las muestras en Parafilm.
- Cubra gotas con una rejilla TEM y deje reposar durante 2 min. Wick fuera de la solución en exceso en la rejilla con papel de filtro.
- Lave la red mediante la colocación de una gota de agua DI luego mecha seca.
- Mancha de red mediante la colocación de una gota en 20 l de 2% (w / v) de acetato de uranilo durante 2 min. Wick fuera el exceso de tinción con papel de filtro.
- Lavar rejilla una vez más en agua.
- Observe red con un microscopio electrónico de transmisión.
4. Conjugación química de VNPs con PEG y fluoróforos, purificación y caracterización
- Para los cálculos para las reacciones siguientes, la masa molar de los VNPs son:
CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4,6 x 10 6 g / mol - Conjugar tintes y PEG a las lisinas superficiales de CPMV y PVX utilizando un solo paso N-hidroxi succinimida reacción de acoplamiento: Añadir 2.500 equivalentes molares (todos los excesos molares se refieren a un exceso molar de por VNP) de Alexa Fluor 647 éster de succinimidilo y 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5.000) disuelto en DMSO a CPMV en 0,1 M tampón fosfato de potasio. Cuando se trabaja con PVX, añadir un exceso molar de 10.000 NHS-dye y PEG-NHS. Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de CPMV y PVX es 2 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente protegido de la luz. CPMV y PVX tiene 300 y 1.270 lisinas direccionables, respectivamente. (El lector puede consultar las siguientes referencias para lecturas adicionales sobremodificación química de CPMV y PVX: 13-15).
- Colorantes conjugado y PEG a tirosinas del TMV mediante un acoplamiento de diazonio seguido por el cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición.
- Preparar sal de diazonio (alquino) mediante la mezcla de 400 l de 0,3 M de monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, 25 l de nitrito de sodio 3,0 M, y 75 l de 0,68 M destilada 3-etinilanilina disolvió en acetonitrilo a 4 º C durante 1 hr.
- Añadir 3,3 ml de tampón borato, pH 8,8, que contiene 100 mM NaCl a 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solución madre).
- Reaccionar el TMV con 450 l de la sal de diazonio (alquino) de solución en un baño de hielo durante 3 horas para añadir una ligadura alquino manejar a TMV por acoplamiento de diazonio. La solución se convertirá en un color marrón claro. TMV tiene 2.140 tirosinas disponibles para la conjugación.
- Se purifica el producto final utilizando un colchón de sacarosa como se describe en el paso 4,4.
- Adjuntar azida-funcional Alexa Fluor 647 y PEG-azida (PM 5.000) using de cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición (CuAAC). Añadir 2 equivalentes de tinte y PEG-azida por proteína de la cubierta y se incuban con 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, y ascorbato de sodio 2 mM a temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar el volumen del tampón de forma que la concentración final de reacción de TMV es 2 mg / ml. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de TMV: 16,17).
- Conjugar colorantes a lisinas y PEG a cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV):
- Añadir 2.000 equivalentes molares de Oregon Green 488 succinimidil éster disueltos en DMSO a cBMV en 0,1 M de tampón TNKM (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de BMV es 1 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 4 º C protegida de la luz.
- Purificar las partículas mediante centrifiltros fugados como se describe en el paso 4.4.
- Añadir 2.000 exceso molar de PEG-maleimida (PM 2.000) usando las mismas condiciones de reacción como antes y se incuba la mezcla de reacción durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tiene 180 lisinas reactivas y cisteína. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de la BMV, 18).
- Purificación: Pasar la solución a través de un colchón de sacarosa al 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 hr. Volver a disolver el precipitado en tampón. Alternativamente, se dializa frente a tampón apropiada, usando 10 kDa de corte filtros spin.
- Caracterización: VNPs PEGilados y marcado fluorescentemente-se analizaron usando los métodos descritos anteriormente: UV / visible de espectroscopia, la electroforesis en gel de SDS, FPLC, y TEM (no se muestra, sin embargo, se refieren a las figuras 6 y 7).
5. Tumor de Metas e imágenes utilizando un modelo de xenoinjertos de ratón
- Cultura HT-29 células humanas de cáncer de colon en medio RPMI suplementado con FBS al 5%, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2 utilizando 175 cm 2 frascos de cultivo celular.
- Lavar las células dos veces con PBS estéril y la cosecha mediante la incubación con 5 ml de tripsina-EDTA a 37 º C durante 5 min. Inactivar la tripsina con 5 ml de medio RPMI. Recoger las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min. a 4 º C y se resuspende en medio fresco RPMI a 5x10 6 células/50 medio l (determinar recuento total de células usando azul de tripano y un hemocitómetro a). Mezclar con un volumen igual de matrigel antes de la inyección (mantener todas las soluciones y reactivos estériles).
- Adquirir seis semanas de edad NCR nu / nu ratones y los mantienen en una dieta libre de alfalfa durante 2 semanas. [Nota:. Todos los procedimientos con animales debe ser aprobado por el IACUC] Inducir xenoinjertos de tumores mediante inyección subcutánea de 5x10 6 células/100 l / tumor en los flancos (2 tumores / ratón) usando un manómetro 18 1/2 estérilaguja. Monitorear los animales regularmente. Medir el tamaño del tumor usando calibres y permitir que los tumores crezcan a un volumen promedio de 20 mm 3 (dentro de los próximos 12 días). Asignar los ratones en dos grupos al azar: PBS y VNP (n = 3 animales / grupo / hora punta). Uso de un 1 ml jeringa de insulina de calibre 28, administrar por la vena de la cola de inyección intravenosa 100 l de PBS estéril o 10 mg / kg formulación VNP.
Nota: los experimentos de cultivo de tejidos y estudios con animales vivos que no se ha demostrado. Demostración práctica se limitará a procesamiento de tejidos y de adquisición de datos. Para una referencia sobre la HT-29 modelo de xenoinjerto de tumor, se remite al lector a la ref. 19
Tres técnicas se utilizan para evaluar el tumor homing de VNPs:
- Imágenes de fluorescencia mediante Maestro Imaging System: ratones sacrificio en diferentes puntos de tiempo (2, 24, y 72 h) usando CO 2gas. Disecar los animales y especiales todos los órganos principales (cerebro, corazón, pulmones, el bazo, los riñones y el hígado), junto con los tumores en los flancos, colocar los tejidos en parafilm, y analizar con el instrumento de formación de imágenes de fluorescencia utilizando excitación amarillo y filtros de emisión (800 ms exposición) para detectar la presencia de señales fluorescentes en los tejidos (derivadas de A647 etiqueta conjugarse a los VNPs). Guarde las imágenes y analizar la intensidad de fluorescencia utilizando ImageJ software 1.44o ( http://imagej.nih.gov/ij ). Comparar el patrón de absorción de los VNPs en los tumores con otros tejidos importantes con el tiempo.
- Después de la imagen, recortar cada tejido por la mitad e insertar un medio en compuesto OCT para el análisis de la crio-seccionamiento y confocal. Recoge la otra mitad en predosificados crio-viales y congelar inmediatamente utilizando N2 líquido. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
- Fluorescencia de cuantificación: Retejidos de la médula pesos. Descongelar los tejidos congelados a temperatura ambiente y colocarlos en tubos separados Falcon de 50 ml que contienen 1 ml de PBS. El uso de un homogeneizador de tejidos de mano, homogeneizar los tejidos para 2-3 min en PBS a continuación, transferir el homogenado a tubos de microcentrífuga. Se centrifuga el homogeneizado durante 10 min a 13.000 xg para eliminar la no-tejido homogeneizado.
- Pipetear 100 l del sobrenadante de los tejidos de cada grupo (formulaciones PBS y VNP / puntos de tiempo) en una placa de UV 384 y negro. Evaluar la intensidad de fluorescencia (Ex / Em longitudes de onda de 600/665), utilizando un lector de placas. Normalizar los valores obtenidos fluorescentes por los pesos de los tejidos.
- Inmunohistoquímica: Preparar la crio-micrótomo secciones (10 micras) y se almacena a -20 ° C. Mancha de las secciones de tejido para núcleos de las células (DAPI) y marcador de células endoteliales (marcado con FITC anti-ratón CD31 de anticuerpos). Llevar a cabo el análisis por microscopía confocal para mapear la localización intra vascular y tumoral de marcado fluorescentemente VNPs.
Nota: Este procedimiento no se ha demostrado, los datos representativos se muestran en la Figura 8. Para una referencia sobre la inmunohistoquímica y los métodos de tinción descritos, se remite al lector a la ref. 19
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Discussion
Este protocolo proporciona un método para la modificación química de VNPs y sus aplicaciones para la formación de imágenes de tumores in vivo. Las técnicas de formación de imágenes de fluorescencia de animales, la cuantificación de fluorescencia, y la inmunohistoquímica presentados aquí son útiles para el estudio de biodistribución y la evaluación de tumor homing. Estas técnicas proporcionan información valiosa con respecto al acceso de las nanopartículas en el tumor por el efecto EPR. Mediante la combinación de los resultados de los métodos de análisis diferentes, se obtiene un enfoque poderoso para evaluar la localización y la biodistribución de los VNPs.
Antes de estos estudios se pueden realizar sin embargo, es esencial para obtener una preparación de virus puro. Aparte de inoculación mecánica, una posible alternativa para la propagación VNP es agroinfiltration, que puede tener una alta transformación y tasa de acumulación. Al propagar las VNPs, se debe tener cuidado para mantener las plantas infectadas con virus diferentes separado como to evitar la contaminación cruzada. En particular, TMV se extendió fácilmente y se transmite mecánicamente. Otro paso fundamental para tener en cuenta está llevando a cabo la purificación de virus en hielo oa 4 º C. Todos los tampones se debe utilizar helada. La temperatura más baja es necesaria para evitar cualquier daño a los VNPs como resultado de proteasas y enzimas oxidantes presentes en el material vegetal.
Los bajos rendimientos de VNPs purificadas puede surgir de múltiples factores. Una posible causa podría ser la edad de los VNPs usados para la propagación. Es preferible utilizar preparaciones de virus más recientes. Por ejemplo, el C-terminal de 24 aminoácidos de la proteína de la cubierta de CPMV S son necesarios para la supresión de silenciamiento génico. La eliminación de esta región de la superficie expuesta se produce con el tiempo debido a la proteólisis. Aunque la estructura y la estabilidad de CPMV no se ven afectados, retraso del crecimiento y retraso en la propagación de los resultados de virus. Otra fuente de bajo rendimiento es la pérdida de los VNPs durante la purificación. En particular enTention se debe dar a la etapa de resuspensión después de la precipitación con PEG. Resuspensión incompleta de la pella daría lugar a VNP perdido en el sedimento de la etapa de centrifugación posterior.
En general, la química de bioconjugación presentados aquí son sencillos. 14,17,18,21 Los métodos de caracterización descritos son valiosos para asegurar la integridad de las partículas y la determinación de grado de conjugación. Excesos molares se puede ajustar en consecuencia dependiendo de la aplicación y del grado de funcionalización deseado.
Cuando se trabaja con el modelo de xenoinjertos de ratón, la práctica más importante es seguir una técnica aséptica. Además, la inyección en la vena de cola es un paso crítico para asegurar una dosis uniforme de la muestra para cada ratón. Se puede ayudar a colocar la cola en agua caliente de antemano para dilatar la vena. Otra consideración es la autofluorescencia para imágenes de fluorescencia y las mediciones. Generalmente, la autofluorescencia del tejido es la minimizacióned más allá de 600 nm, longitud de onda larga haciendo colorantes con máximos de emisión más allá de 600 nm óptimas como la sonda de imagen. Sin embargo, las dietas normales de ratón consisten de clorofila que contiene la alfalfa, que también emite fluorescencia roja. Como resultado de ello, es necesario mantener los ratones en una dieta de alfalfa libre durante al menos 2 semanas para reducir las señales de fondo. Por último, hay que señalar que la detección de fluorescencia utilizando imágenes de fluorescencia es limitada debido a las diferencias en los entornos de dispersión y absorción de los diversos tejidos. Por consiguiente, la imagen se utiliza para la visualización y como un método inicial de biodistribución de seguimiento, mientras que la cuantificación se realiza utilizando homogenados de tejidos.
Algunas de las ventajas de la utilización de VNPs como la plataforma tecnológica son su monodispersidad, biocompatibilidad, capacidad de ampliación de producción y docilidad a las estrategias de funcionalización múltiples. Además de la ingeniería química, ingeniería genética se ilustra aquí con la introducciónción de cisteínas a BMV como un objetivo para la bioconjugación. La ingeniería genética también puede ser utilizado para introducir péptidos dirigidos o etiquetas de afinidad. Si bien el protocolo descrito utiliza de doble etiquetado (tinte y PEG) partículas, los estudios en curso están buscando incorporar funcionalidades adicionales (es decir, terapéutica y focalización) para mejorar la especificidad tisular y la eficacia terapéutica. Por lo tanto, este enfoque establece las bases para futuras aplicaciones biomédicas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIBIB subvenciones R00 EB009105 (para NFS) y EB011317 P30 (para NFS), un NIH / NIBIB formación de subvención T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinario Alliance Investment Grant (para NFS), y Un Caso Comprehensive Cancer Center subvención P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos a los investigadores de laboratorio Steinmetz pregrado de estudiantes para sus prácticas en el apoyo: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Hern Stephen Randolph Lauren, Brian lo tanto, Pablo y Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
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