Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الفيروسية النانوية ل Published: November 16, 2012 doi: 10.3791/4352
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

Summary

النانوية النبات الفيروسية (VNPs) واعدة منصات لتقديم الطلبات في الطب الحيوي. هنا، نحن تصف الإجراءات لإكثار النبات VNP، وتنقية وتوصيف، وbioconjugation. وأخيرا، وتبين لنا تطبيق VNPs لصاروخ موجه الورم والتصوير باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس والتصوير مضان.

Abstract

استخدام المواد النانوية لديه القدرة على إحداث ثورة في مواد العلوم والطب. ويجري حاليا التحقيق في عدد من الجسيمات النانوية لتطبيقات مختلفة في مجال التصوير والعلاج. ويمكن اعتبار النانوية الفيروسية (VNPs) المشتقة من النباتات عن النفس تجميعها bionanomaterials مع أحجام محددة والأشكال. الفيروسات النباتية قيد التحقيق في المختبر شتاينميتز تشمل الجسيمات متعدد السطوح التي شكلتها فيروس تبرقش اللوبيا (CPMV) وفيروس تبرقش بروم (BMV)، وكلاهما 30 نانومتر في القطر. نحن نعمل على تطوير الهياكل أيضا على شكل قضيب والخيطية المستمدة من الفيروسات النباتية التالية: فيروس موزاييك التبغ (TMV)، والتي تشكل قضبان جامدة مع أبعاد 300 نانومتر بنسبة 18 نانومتر، والبطاطا X فيروس (PVX)، والتي تشكل الجزيئات الخيطية 515 نانومتر في الطول و 13 نانومتر في العرض (ويشار إلى القارئ الحكام. 1 و 2 لمزيد من المعلومات عن VNPs).

> من وجهة عالم المواد وجهة نظر، VNPs هي اللبنات جذابة لأسباب عدة: الجزيئات monodisperse، يمكن أن تنتج بسهولة على نطاق واسع في بلانتا، مستقرة للغاية، وحيويا. أيضا، VNPs هي "برمجة" وحدات، والتي صممت خصيصا يمكن استخدام أساليب التعديل الوراثي أو bioconjugation الكيميائية 3. ومن المعروف أن هيكل VNPs بالقرار الذرية، ويمكن أن يتم من تعديلات بدقة المكانية على المستوى الذري 4، مستوى من التحكم الذي لا يمكن أن يتحقق باستخدام المواد النانوية الاصطناعية مع تقنيات للدولة من بين الفن الحالي.

في هذه الورقة، ونحن تصف نشر CPMV، PVX، TMV، وBMV في ungiuculata فيجنا النباتات ونيكوتيانا benthamiana. وترد استخراج وتنقية بروتوكولات لكل VNP. يتم وصف طرق لتوصيف وتنقية VNPs كيميائيا المسمى. في هذه الدراسة، ونحن نركز على الفصلemical وسم VNPs مع fluorophores (مثل اليكسا فلور 647) والبولي ايثيلين جلايكول (PEG). الأصباغ تسهيل تتبع والكشف عن VNPs 5-10، ويقلل PEG المناعية البروتينية من الجسيمات النانوية مع تعزيز الدوائية من 8،11. علينا أن نبرهن الورم صاروخ موجه مضاد للفيروسات من VNPs باستخدام طعم أجنبي ورم نموذج الفأر. يتم استخدام مزيج من التصوير مضان من الأنسجة خارج الجسم باستخدام نظام تصوير مايسترو، الكمي مضان في الأنسجة المتجانس، والفحص المجهري متحد البؤر لدراسة biodistribution. يتم مسح VNPs عبر نظام شبكي بطاني (RES)؛ يتحقق الورم صاروخ موجه بشكل سلبي من خلال تعزيز النفاذية والاستبقاء (EPR) أثر 12. تكنولوجيا النانو هي قوية VNP المكونات وتلعب التكنولوجيا لصورة وعلاج المرض المواقع في الجسم الحي. نحن نعمل على تطوير المزيد من الشحنات للقيام VNPs المخدرات والأنصاف التصوير سريريا ذات الصلة، وكذلك بروابط الأنسجة محددة لاستهداف المستقبلات الجزيئية overexpressed في السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية.

Protocol

1. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) الدعوة

  1. تعيين غرفة النباتات الداخلية إلى 15 ساعة تتحكم اليوم (100٪ ضوء، 25 ° C والرطوبة 65٪) و 9 ساعة من الليل (ضوء 0٪، 22 ° C والرطوبة 60٪).
  2. تطعيم النباتات وفقا لجدول زمني في الجدول 1.
CPMV PVX، TMV، وBMV
اليوم 0: بذور اللوبيا النبات 3 / وعاء. اليوم 0: زيوت نباتية ~ 30 N. بذور benthamiana / وعاء. تسميد مرة في الأسبوع مع ملعقة الأسمدة 1/5 L المياه.
يوم 14: إعادة عاء N. benthamiana في 1 مصنع / وعاء.
يوم 10: تصيب الأوراق يترك الأولية مع CPMV (5 μg/50 ميكرولتر / نبات) عن طريق التلقيح الميكانيكي باستخدام ضوء الغبار من ساموري. يوم 28: تصيب ثلاثة إلى Fإيف يترك مع PVX، TMV، أو BMV (5 μg/50 ميكرولتر / نبات) عن طريق التلقيح الميكانيكي باستخدام ضوء الغبار من ساموري.
أوراق الحصاد وتخزينها في -80 درجة مئوية.: 20 يوما أوراق الحصاد وتخزينها في -80 درجة مئوية.: 42 يوما

الجدول 1. الجدول الزمني لزراعة واصابة، وحصاد الأوراق.

ملاحظة: ويتجلى فقط CPMV نشر كمثال على ذلك.

2. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) تنقية

ملاحظة: تتم جميع خطوات على الجليد أو من عند 4 ° C.

  1. 100 غرام من التجانس أوراق المجمدة في الخلاط القياسية باستخدام 2 مجلدات من العازلة الباردة (انظر الجدول 2). تصفية من خلال طبقات من القماش القطني 2-3.
  2. لPVX، وضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 M. إضافة 0.2٪ (W / V) حمض الاسكوربيك و 0.2٪ (W / V) سلفي الصوديومالشركة المصرية للاتصالات.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخام جناسة المصنع في 5500 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف.
  4. لBMV، طبقة 25 مل من طاف أكثر من 5 مل من 10٪ (W / V) حل السكروز. أجهزة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة ساعة الكريات و resuspend 3 في حل CSCL 38.5٪ (W / V). مزيج من الهز لمدة 5 ساعة، ثم تابع مع الخطوة 2.12.
  5. استخراج المواد النباتية عن طريق إضافة كميات من 0،7 1:1 (V / V) كلوروفورم :1-بيوتانول. يحرك الخليط لمدة 30-60 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 5500 XG حل لمدة 20 دقيقة. جمع المرحلة العليا مائي.
  7. إضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.2 M و 8٪ (W / V) PEG (MW 8،000). لTMV، أيضا إضافة 1٪ (V / V) تريتون X-100. يحرك المزيج لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
  8. أجهزة الطرد المركزي الحل على 15،000 XG لمدة 15 دقيقة. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من العازلة. لPVX، إضافة β-0.1٪ واليوريا المركابتويثانول إلى 0.5 M.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 30 دقيقة وجمع طاف.
  10. نابذة فائقة السرعة طاف في 160،000 XG لمدة 3 ساعة. إعادة تعليق بيليه في 5 مل يا العازلةvernight.
  11. إعداد التدرج السكروز 10-40٪ باستخدام كميات متساوية من 10٪، 20٪، 30٪، 40٪ والسكروز في المخزن المؤقت (أثقل الأول). تسمح التدرج لتتوازن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  12. نابذة فائقة السرعة معلق بيليه خلال التدرج في السكروز 100،000 XG لمدة 2 ساعة (24 ساعة لBMV).
  13. جمع ضوء الفرقة والتشتت dialyze ضد العازلة.
  14. تميز VNPs (أدناه) وتخزينها في 4 درجات مئوية. على المدى الطويل تخزين، تخزين على -80 درجة مئوية.
CPMV وTMV 0،1 فوسفات البوتاسيوم M العازلة (درجة الحموضة 7.0)
38.5 مم KH 2 PO 4
61،5 ملي K 2 HPO 4
PVX 0.5 م العازلة بورات (الرقم الهيدروجيني 7.8)
0،5 حمض البوريك M
ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم
BMV مؤسسة النقد العربي السعودي العازلة (درجة الحموضة 4.5)
250 خلات الصوديوم ملي
10 ملم MgCl 2
β-2 مم المركابتويثانول (إضافة جديدة)

الجدول 2. المخازن المؤقتة وصفات لكل VNP.

ملاحظة: ويتجلى فقط CPMV نشر كمثال على ذلك.

3. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) توصيف

  1. أداء التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية / المرئية لتحديد تركيز VNPs.
    1. قياس الامتصاصية من 2 ميكرولتر من العينة باستخدام الطيف NanoDrop.
    2. تحديد تركيز الجسيمات والأصباغ باستخدام قانون بير لامبرت (A = εcl، حيث A هي الامتصاص، هو ε معامل الانقراض، ج هو التركيز، وL هو طول المسار). طول المسار هو 0.1 سم لNanoDrop.
      معاملات الانقراض VNP محددة هي:
      CPMV: 8.1 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      PVX: 2.97 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      TMV: 3.0 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      BMV: 5.15 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
  2. تحليل جزيئات من الحجم الاستبعاد اللوني السائل سريع البروتين (FPLC).
    1. باستخدام Superose-6 المساحة استبعاد العمود ومستكشف AKTA، تحميل 50-100 ميكروغرام من VNPs في 200 ميكرولتر من 0.1 M الفوسفات العازلة البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.0).
    2. تعيين إلى 260 نانومتر للكشف عن (الحمض النووي)، 280 نانومتر (البروتين)، والطول الموجي الإثارة في أي الأصباغ المرفقة.
    3. تشغيل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة لمدة 72 دقيقة.
    4. الملف الشخصى شطف وA260: A280 نانومتر إلى ما إذا كان إعداد VNP هو محض وما إذا الجسيمات وتجميعها سليمة.
      وA260 التالية: 280 النسب تشير إلى إعداد VNP النقي:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
  3. أداء يبدل طبيعة (ما قبل الصب NuPAGE) مكرر تريس بولكرلميد هلام الانحدار 4-12٪ الكهربائي لتحليل نقاء إعداد وتصريف البروتينات إلى معطف الفردية.
    1. أضف 3 مل من عينة العازلة 4X LDS إلى 10 ميكروغرام من الجزيئات في 9 ميكرولتر من العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة أكثر 1 ميكرولتر من العازلة عينة LDS 4X و 3 ميكرولتر من المركابتويثانول-β لBMV للحد من عدد كبير من السندات ثاني كبريتيد.
    2. احتضان في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق عند 100 ° C.
    3. تحميل عينات على هلام SDS ل.
    4. تشغيل العينات في 200 V ل1 ساعة في اجتماعات الأطراف 1X تشغيل المخزن المؤقت.
    5. توثيق هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور البروتينات الفلورية معطف.
    6. لغير الفلورسنت البروتين، وصمة عار مع الأزرق Coomassie (0.25٪ (W / V) Coomassie بريليانت الأزرق R-250، وحامض الخليك 30٪ (V / V) الميثانول، و 10٪ (V / V)) لمدة 1 ساعة.
    7. يزيل اللون مع الميثانول 30٪، حمض الخليك 10٪ بين عشية وضحاها. تشانجنرال الكتريك الحل إذا لزم الأمر.
    8. توثيق هلام تحت الضوء الأبيض.
  4. تحليل سلامة الجزيئات بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (TEM).
    1. تخفيف العينات إلى 0،1-1 ملغ / مل في 20 ميكرولتر من المياه DI.
    2. وضع 20 قطرات ميكرولتر من العينات على Parafilm.
    3. تغطية قطرات مع شبكة TEM والسماح الجلوس لمدة 2 دقيقة. الفتيل من الحل الزائدة على الشبكة مع ورقة الترشيح.
    4. غسل الشبكة عن طريق وضع على قطرة ماء ثم فتل DI الجافة.
    5. وصمة عار على الشبكة عن طريق وضع بنسبة 20 ميكرولتر من 2٪ (W / V) خلات اليورانيل لمدة 2 دقيقة. الفتيل قبالة الزائدة وصمة عار مع ورق الترشيح.
    6. غسل الشبكة مرة أخرى في الماء.
    7. مراقبة الشبكة تحت الميكروسكوب الالكترونى النافذ.

4. اقتران الكيميائي للVNPs مع PEG وFluorophores وتنقية، وتوصيف

  1. لإجراء العمليات الحسابية لردود الفعل أدناه، كتلة مولية من VNPs هي:
    CPMV: 5.6× 10 6 ز / مول
    PVX: 35 × 10 6 ز / مول
    TMV: 41 × 10 6 ز / مول
    BMV: 4.6 × 10 6 ز / مول
  2. المتقارن الأصباغ وPEG لlysines سطح CPMV وPVX باستخدام خطوة واحدة N-هيدروكسي succinimide رد فعل اقتران: 2500 إضافة حكمه المولي (جميع التجاوزات المولي المولي تشير إلى فائض في VNP) من فلور اليكسا استر succinimidyl 647 و 4،500 من شبه NHS- PEG (MW 5،000) الذائبة في DMSO لCPMV في 0.1 M البوتاسيوم العازلة الفوسفات. عند العمل مع PVX، إضافة الزائدة 10000 ضرس NHS صباغة وNHS PEG-. ضبط كميات العازلة وDMSO بحيث تركيز النهائي من CPMV وPVX هو 2 ملغ / مل DMSO والمحتوى هو 10٪ من إجمالي حجم رد الفعل. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء. CPMV وPVX تضم 300 و1270 lysines عنونة، على التوالي. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة علىالتعديل الكيميائي للCPMV وPVX: 13-15).
  3. والأصباغ المتقارن PEG لtyrosines من TMV من اقتران الديازونيوم تليها النحاس (I)-حفز أزيد-الكاين الاضافه الحلقيه.
    1. إعداد الملح الديازونيوم (الكاين) عن طريق خلط 400 ميكرولتر من 0.3 M حمض مونوهيدرات ف تولوين، 25 ميكرولتر من النتريت 3،0 الصوديوم M، و 75 ميكرولتر من المقطر 0.68 M 3 ethynylaniline الذائبة في الأسيتونيتريل في C ° 4 ل 1 ساعة.
    2. إضافة 3.3 مل من بورات العازلة، ودرجة الحموضة 8.8، يحتوي على 100 ملي كلوريد الصوديوم إلى 1.25 مل من TMV (20 ملغ / مل محلول المخزون).
    3. الرد على TMV مع 450 ميكرولتر من محلول الديازونيوم (الكاين) الملح في حمام الثلج لمدة 3 ساعة إضافة إلى ربط الكاين التعامل مع TMV من اقتران الديازونيوم. سوف تتحول إلى الحل اللون البني الفاتح. TMV و2140 tyrosines المتاحة للاقتران.
    4. تنقية المنتج النهائي باستخدام وسادة السكروز كما هو موضح في الخطوة 4.4.
    5. إرفاق أزيد الوظائف اليكسا فلور 647 وPEG-أزيد (MW 5،000) النقيبز النحاس (I)-حفز أزيد-الكاين الاضافه الحلقيه (CuAAC). إضافة 2 حكمه صبغة وPEG-أزيد في معطف البروتين واحتضان مع كبريتات النحاس 1 ملم 4، 2 AMG ملم، و 2 مم أسكوربات الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ضبط مستوى الصوت العازلة مثل أن تركيز النهائي من رد فعل TMV هو 2 ملغ / مل. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة على التعديل الكيميائي للTMV: 16،17).
  4. المتقارن الأصباغ لlysines وPEG لcysteines من BMV السيستين متحولة (cBMV):
    1. إضافة حكمه المولي من 2000 استر ولاية أوريغون 488 الأخضر succinimidyl الذائبة في DMSO لcBMV في 0.1 M TNKM العازلة (50 ملي تريس قاعدة، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 5 ملم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4). ضبط كميات العازلة وDMSO بحيث تركيز النهائي من BMV هو 1 ملغ / مل DMSO والمحتوى هو 10٪ من إجمالي حجم رد الفعل. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
    2. تنقية الجزيئات باستخدام centriمرشحات الفطريات والطفيليات كما هو موضح في الخطوة 4.4.
    3. إضافة 2000 الزائد من المولي PEG-maleimide (MW 2،000) باستخدام نفس ظروف التفاعل كما كان من قبل واحتضان الخليط لمدة 2 ساعة رد فعل عند 4 ° C. cBMV عنده 180 lysines رد الفعل وcysteines. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة على التعديل الكيميائي للBMV: 18).
  5. تنقية: تمرير الحل من خلال وسادة السكروز 40٪ (W / V) في مقابل 2.5 XG 160000 ساعة. إعادة حل بيليه في المخزن المؤقت. بدلا من ذلك، dialyze ضد العازلة المناسبة باستخدام 10 كيلو دالتون مرشحات تدور قطع.
  6. توصيف: يتم تحليل VNPs مضاد للفيروسات وfluorescently المسمى التي تستخدم الأساليب المذكورة أعلاه: UV / مرئية التحليل الطيفي، SDS الكهربائي للهلام، FPLC، وTEM (لا يظهر، ومع ذلك، تشير إلى أرقام 6 و 7).

5. الاستهداف الورم والتصوير باستخدام نموذج طعم أجنبي ماوس

  1. ثقافة HT-29 سرطان القولون خلايا الإنسان في المتوسط ​​RPMI تستكمل مع 5٪ FBS C 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 1٪ الجلوتامين L-عند 37 درجة، في 5٪ CO 2 باستخدام 175 الثقافة الخلية 2 القوارير.
  2. غسل الخلايا مرتين مع PBS معقمة والحصاد من قبل تفرخ مع 5 مل من التربسين EDTA-C ° 37 في لمدة 5 دقائق. إبطال نشاط التربسين مع 5 مل من المتوسط ​​RPMI. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. في 4 درجات مئوية و resuspend RPMI في جديدة على 5x10 المتوسطة cells/50 6 ميكرولتر (تحديد إجمالي عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات التريبان الأزرق وأ). الاختلاط مع حجم مساو من matrigel قبل الحقن (منع جميع الحلول والكواشف عقيمة).
  3. شراء ستة أسابيع من العمر NCR نو / نو الفئران والمحافظة عليها على نظام غذائي البرسيم مجانا لمدة 2 اسابيع. [ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوان يجب أن يكون وافق IACUC] تحفز الأعضاء المستمدة من الحيوانات الورم عن طريق الحقن تحت الجلد من 5x10 6 cells/100 ميكرولتر / ورم في جنباته (2 الأورام / الماوس) باستخدام مقياس 18 1/2 العقيمةإبرة. رصد الحيوانات بانتظام. قياس حجم الورم باستخدام الفرجار والسماح للأورام لتنمو إلى حجم متوسط ​​20 مم 3 (في غضون الأيام ال 12 المقبلة). تعيين الفئران إلى مجموعتين بشكل عشوائي مختلفة: PBS وVNP (ن = 3 حيوانات / مجموعة / الوقت نقطة). باستخدام مقياس 1 مل 28 حقنة الأنسولين، عن طريق الوريد إدارة ميكرولتر الوريد ذيل 100 حقن معقمة PBS أو 10 VNP صياغة ملغم / كغم.

ملاحظة: لن تجارب زراعة الأنسجة والدراسات مع الحيوانات الحية أن تظهر. التدريب العملي على مظاهرة سوف يكون مقصورا على معالجة الأنسجة والحصول على البيانات. للإشارة على الورم HT-29 نموذج طعم أجنبي، وعلى القارئ الرجوع إلى المرجع 19

وتستخدم ثلاث تقنيات لتقييم الورم صاروخ موجه من VNPs:

  1. مضان التصوير باستخدام نظام تصوير مايسترو: الفئران النحر في نقاط زمنية مختلفة (2، 24، و 72 ساعة) باستخدام CO 2الغاز. تشريح الحيوانات والمكوس جميع الأجهزة الرئيسية (الدماغ والقلب والرئتين والطحال والكلى والكبد) مع الأورام على الجناحين، ضع الأنسجة على parafilm، وتحليل الصك مع التصوير مضان باستخدام الإثارة الصفراء والمرشحات الانبعاثات (800 مللي التعرض) للكشف عن وجود إشارات الفلورسنت في الأنسجة (المستمدة من A647 إلى تسمية مترافق VNPs). حفظ الصور وتحليل شدة الفلورسنت باستخدام يماغيج 1.44o البرمجيات ( http://imagej.nih.gov/ij ). مقارنة نمط من امتصاص VNPs في الأورام مع الأنسجة الرئيسية الأخرى مع مرور الوقت.
  2. بعد التصوير، وقطع كل الأنسجة في نصف ونصف في تضمين مجمع أكتوبر للتحليل البرد باجتزاء ومتحد البؤر. جمع النصف الآخر في مرحلة ما قبل وزنه البرد قوارير وتجمد على الفور لهم باستخدام السائل N 2. المحل في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لمزيد من المعالجة.
  3. مضان الكمي: إعادةالحبل الأنسجة الأوزان. ذوبان الجليد الأنسجة المجمدة في درجة حرارة الغرفة ووضعها في أنابيب منفصلة 50 مل فالكون يحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني. باستخدام الخالط الأنسجة محمول وتجانس الأنسجة لمدة 2-3 دقيقة في PBS ثم نقل إلى أنابيب جناسة microfuge. أجهزة الطرد المركزي في الخليط لمدة 10 دقيقة في 13000 XG لإزالة غير المتجانس الأنسجة.
  4. الماصة 100 ميكرولتر من طاف من الأنسجة من كل مجموعة (PBS VNP وتركيبات / نقاط زمنية) في لوحة سوداء UV 384 أيضا. تقييم كثافة مضان (م ت / م الأطوال الموجية 600/665) باستخدام قارئ لوحة. تطبيع القيم التي تم الحصول عليها من قبل الفلورسنت الأوزان الأنسجة.
  5. المناعية: إعداد البرد مشراح أقسام (10 ميكرون) وتخزينها في -20 درجة C. وصمة عار أقسام الأنسجة لنوى الخلايا (دابي) وعلامة الخلية البطانية (FITC التي تحمل علامات الماوس المضادة للأجسام المضادة CD31). تنفيذ التحليل المجهري متحد البؤر لتعيين توطين الأوعية الدموية داخل الورم و-OF-VNP fluorescently المسمىق.

ملاحظة: لن يتم هذا الإجراء أثبت، وتظهر بيانات تمثيلية في الشكل 8. للإشارة على والطرق المناعية تلطيخ وصفها، وعلى القارئ الرجوع إلى المرجع 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهج للالتعديل الكيميائي للVNPs وتطبيقاتها في مجال التصوير للورم الجسم الحي. تقنيات التصوير مضان الحيوان، الكمي مضان، والمناعية المقدمة هنا هي مفيدة لدراسة وتقييم الورم biodistribution صاروخ موجه. هذه التقنيات توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بالوصول من الجسيمات النانوية إلى الورم عن طريق تأثير EPR. من خلال الجمع بين النتائج من الأساليب التحليلية المختلفة، وحصلنا على طريقة فعالة لتقييم الترجمة وbiodistribution من VNPs.

لا يمكن أن يؤديها قبل هذه الدراسات ومع ذلك، لا بد من الحصول على الفيروس إعداد النقي. وبصرف النظر عن التلقيح الميكانيكية، بديل ممكن لنشر VNP هو agroinfiltration، والتي يمكن أن يكون لها التحول عالية ومعدل التراكم. عندما نشر في VNPs، ينبغي الحرص على إبقاء النباتات المصابة بفيروسات مختلفة منفصلة كما رo تجنب انتقال التلوث. على وجه الخصوص، وينتشر بسهولة TMV وتنتقل ميكانيكيا. خطوة أخرى حاسمة لأن تضع في اعتبارها تنفذ تنقية الفيروس على الجليد أو على C. ° 4 وينبغي استخدام جميع مخازن الجليد الباردة. انخفاض درجة الحرارة اللازمة لمنع أي ضرر للVNPs نتيجة لالبروتياز والإنزيمات المؤكسدة الموجودة في المواد النباتية.

قد العائدات المنخفضة من VNPs تنقية تنشأ عن عوامل متعددة. ويمكن أن تكون الأسباب المحتملة عمر VNPs التى تستخدم فى الإكثار. فمن الأفضل لاستخدام مستحضرات الفيروس أكثر حداثة. على سبيل المثال، C-24 محطة الأحماض الأمينية من البروتين S من معطف CPMV ضرورية لقمع إسكات الجينات. حذف هذه المنطقة السطحية المعرضة للتحدث مع مرور الوقت بسبب التحلل البروتيني. على الرغم من أن لا تتأثر بنية واستقرار CPMV، تأخر النمو وتأخر نشر النتائج الفيروس. مصدر آخر من العائدات المنخفضة هو فقدان VNPs خلال تنقية. خاصة فيوينبغي إيلاء الاهتمام لإعادة تعليق الخطوة بعد هطول الأمطار PEG. وإعادة تعليق غير مكتملة من بيليه يؤدي إلى فقدان VNP بيليه في خطوة الطرد المركزي لاحقة.

وعموما، فإن كيمياء bioconjugation المعروضة هنا هي واضحة. 14،17،18،21 وأساليب توصيف ووصف ذات قيمة لضمان سلامة الجسيمات وتحديد مدى الاقتران. ويمكن تعديل وفقا لتجاوزات المولي اعتمادا على التطبيق ودرجة functionalization المطلوب.

عند العمل مع الماوس نموذج طعم أجنبي، وممارسة أهم يتابع تقنية العقيم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حقن الوريد الذيل هو خطوة حاسمة لضمان جرعة موحدة لكل عينة الماوس. فإنه قد يساعد على وضع الذيل في ماء دافئ قبل لتمدد الأوردة. وهناك اعتبار آخر هو تألق ذاتي للتصوير وقياسات مضان. عموما، هو تألق ذاتي الأنسجة minimizإد تتجاوز 600 نيوتن متر، مما يجعل الأصباغ الطول الموجي الطويل مع ماكسيما الانبعاثات إلى ما بعد 600 نيوتن متر والتحقيق الأمثل التصوير. ومع ذلك، والوجبات الغذائية تتكون من الماوس العادي، الكلوروفيل التي تحتوي على البرسيم، والتي أيضا fluoresces الحمراء. ونتيجة لذلك، فمن الضروري للحفاظ على نظام غذائي على الفئران البرسيم مجانا على الأقل 2 أسابيع للحد من الإشارات الخلفية. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن يقتصر الكشف مضان باستخدام التصوير مضان بسبب الاختلافات في بيئات تشتت وامتصاص الأنسجة المختلفة. ونتيجة لذلك، يتم استخدام التصوير لتصور وكطريقة أولية لرصد biodistribution، في حين يتم تنفيذ الكمي باستخدام الخليط الأنسجة.

بعض مزايا استخدام VNPs لأن التكنولوجيا هي منصة monodispersity بهم، توافق مع الحياة، القدرة على زيادة الإنتاج النطاق، وقابليته لاستراتيجيات functionalization متعددة. بالإضافة إلى الهندسة الكيميائية، الهندسة الوراثية ويتضح هنا مع introducنشوئها من cysteines لBMV كهدف لbioconjugation. ويمكن أيضا أن تستخدم الهندسة الوراثية لإدخال استهداف الببتيد أو العلامات تقارب. في حين أن البروتوكول وصف يستخدم ثنائي المسمى (صبغ وPEG) الجسيمات، دراسات جارية تبحث في دمج وظائف إضافية (أي التداوي والاستهداف) لتعزيز فعالية وخصوصية النسيج العلاجية. وبالتالي، فإن هذا النهج يضع الأساس لتطبيقات الطب الحيوي في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIBIB EB009105 R00 المنح (لNFS) وEB011317 P30 (لNFS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIBIB التدريب منحة T32 EB007509 (لAMW)، وجامعة كيس وسترن ريزيرف للاستثمار التحالف التخصصات المنحة (لNFS)، وحالة المركز الشامل للسرطان P30 CA043703 منحة (لNFS). نشكر مختبر الباحثين شتاينميتز الطالب الجامعي لأيديهم على الدعم: نادية آيت، كيفن تشن، سوراف (SID) داي، أليس يانغ، ألكسندر سام، كريغ كروز D'، ستيفن هيرن، راندولف لورين، بريان لذلك، وبول Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Tags

بيولوجيا السرطان، العدد 69، الهندسة الحيوية، والهندسة الطبية الحيوية، علم الأحياء الجزيئي، وعلم الفيروسات، علم الأورام، الجسيمات النانوية الفيروسية، bioconjugate الكيمياء، ورم الفأر نموذج طعم أجنبي، مضان التصوير
الفيروسية النانوية ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير ورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I.,… More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter