Summary
면역 반응과 행동 사이의 링크를 이해하기 위해, 우리는에서 전위의 행동을 측정하는 방법을 설명
Abstract
면역 반응 및 호스트의 행동 사이의 복잡한 상호 작용이 종의 다양한에서 설명되었습니다. 초과 수면은 특히 포유류 1 감염에 대한 응답으로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 최근 Drosophila melanogaster 2에 설명되어 있습니다. 그것은 일반적으로 수면 감염 동안 호스트에 유용합니다하고 강력한 면역 체계 3,4의 유지를위한 중요하다는 것을 것을 가능합니다. 그러나,이 가설을 지원하는 실험적 증거는 4 한정되어 있으며, 면역 반응시 초과 수면의 기능은 불분명 남아 있습니다. 우리는이 복잡한 문제를 해결하기 위해 종합 접근 방식을 사용했으며, 간단한 유전자 모델 시스템 fruitfly Drosophila melanogaster에서 연구를 실시하고 있습니다. 우리는 파리에서 전위의 행동과 수면을 측정하기위한 표준 분석을 사용하여,이 분석은 파리 infecte의 행동을 측정하기 위해 사용되는 방법을 보여줍니다박테리아의 병원성 변형과 D. 이 분석은 또한 감염 기간 동안 개인 파리의 생존 기간을 모니터링하는 데 유용합니다. 면역 기능의 추가 조치는 감염과 NFκB, Drosophila의 본래 면역 반응의 중심 핵심 전사 인자의 활성화를 삭제하는 파리의 능력이 포함되어 있습니다. 감염 동안 생존 결과 및 세균 통관 모두가 함께 저항 및 감염에 대한 내성의 지표입니다. 관용이 시스템 5 내 병원균 높은 수준의에도 불구하고 감염 피해를 제한함으로써 생존 할 수있는 호스트의 능력으로 정의되는 동안 저항은 감염을 취소 할 수 파리의 능력을 말합니다. 감염시 NFκB 활동의 실시간 모니터링은 감염 동안 생존의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단 assays에 Drosophila의 사용은 수면의 유전 및 분자 분석을 용이하게및 면역 반응과 두 복잡한 시스템은 서로 영향을받습니다.
Protocol
이 프로토콜은 세균 감염의 대상이 파리에서 수집 한 네 가지 판독을 취득하는 두 설정 (그림 1)를 사용합니다. 2) 생존 결과; 3) 플라이에 세균로드, 그리고 4) 생체 내 NFκB의 기자 활동의 실시간 측정이 출력) 슬립 / 웨이크 동작을 하나 포함되어 있습니다. Drosophila에서 사용할 수있는 유전 도구와 함께, 이러한 측정은 면역 기능과 행동 사이의 분자 링크로 기계론의 통찰력을 제공합니다.
1. 파리의 측정 전위의 활동과 수면
- 전위의 활동을 측정하고 Drosophila 활동 모니터링 시스템 (DAM2, Trikinetics), 인큐베이터, 어두운 방, 그리고 실험 동물과 활동 튜브의 준비를 포함, 파리에서 잘하는 데 사용되는 설정은 이전에 6 설명되어 있습니다. 동일한 접근 방식은 약간의 수정, 여기에 사용됩니다.
- 활동 튜브는 드 - 이온화 물에 뜨거운 접시에 끓고에 의해 다시 사용하기 위해 청소됩니다. 세제의 작은 금액은 최초의 종기에 추가되어 튜브는 잘 헹구어 그리고 두 번 더 끓여 있습니다. 실이 튜브를 연결하는 데 사용하는 경우, 사용 활동 튜브는 (음식, 왁스, 비행과 실을 포함) 원사의 사전 제거하지 않고 청소 할 수 있습니다.
- 전에 실험을 시작하기 늦은 pupal를 포함하는 장소 문화는 실험 조명 및 기타 환경 조건에 적응 3-4일을위한 인큐베이터에 파리가 무대. 라이트 : 어둡거나 일정한 조건이 일반적으로 수면 행동을 측정하기 위해 사용되었습니다. 이 예에서는 파리는 면역 반응과 행동 2,7,8에 circadian 시계의 영향을 제거하기 위해 일정한 빛에 적응하고 있습니다. 그림 1A에 설명 된 바와 같이 6, 기록을 설명 모니터링합니다.
2. 박테리아의 병원성 변형으로 파리를 감염
- 여기에 설명 된 프로토콜은 S.에 대한 특정이 성장 및 유지 관리가 용이 marcescens. 다른 박테리아 종 장기 저장 및 문화 조건 프로토콜. S.를 달라집니다 marcescens는 -80 ° C.에 15~50%의 글리세롤에 저장됩니다 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 autoclaved 50 % 글리세롤 1 볼륨에 - 장기 저장을 위해 준비하려면 하루 아침에 박테리아 문화 2 권 (1.0 OD 600 = 0.5)을 섞는다. 이 17 %의 최종 글리세롤 농도가 높아집니다. -80에서 튜브를 저장 ° C. 박테리아의 소스 사용에 단기을 준비하려면, 멸균 200 μl 피펫 팁과 냉동 주식을 긁어 LB 한천 플레이트에 세 방향 행진을 수행합니다. 37 & D에서 하룻밤 판을 품다예를 들어, C 절연 식민지를 할 수 있습니다. 4 ° C.에서 판을 저장
예약 감염 하루 전날, 5 ML의 LB 매체를 포함하는 문화 관에 멸균 200 μl 피펫 팁과 잠수함 팁과 LB 한천 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하십시오. 박테리아가 밤새 성장, 또는 최대 37 번 보육 흔드는 내부의 16 시간에 ° C 및 250 RPM이 기하 급수적으로 성장 단계에 도달 할 때까지. OD 600에서 분광 광도계로 농도를 측정합니다. 이 단계의 농도는 0.5에서 1 범위. 농도가 너무 높은 경우 박테리아를 하위 문화와 최적의 농도를 다른 몇 시간 동안 성장합니다. 화염 소스 근처에있는 절차를 수행합니다. 일부 박테리아 균이 항생제 내성에 대한 설계하고 성장하고 적절한 항생제를 위해 선택하는 중간에 추가됩니다. S.은 marcescens (ATCC # 8100)는 항생제 내성을하지 않으며 따라서 항생제없이 멸균 매체에서 재배되어 있습니다. 무균 기술을 확인하려면 모의 cultu을컨트롤로 세균없이 재.
파리를 감염시킬 솔루션은 박테리아 (= 0.1 OD 600 희석)과 PBS에 1 %의 식용 색소 (브릴리언트 블루 FCF)가 포함되어 있습니다. PBS에 감염 솔루션과 1% 파란 식용 색소에 사용되는 LB 매체의 상응하는 금액을 추가하여 주입 제어를위한 솔루션을 준비합니다. 얼음에 솔루션을 저장합니다. - 파리를 주입하기 위해 유리 바늘을 준비합니다. micropipette 풀러 (Narishige)를 사용하여 고급 팁에 유리 모세관 (OD = 1mm, ID = 0.58 mm, WPI) 당겨. 해부 현미경 아래에서 개방은 주사기로 흡입을 적용하여 분사 액체로 채울만큼 크고하지만 주입 과정 중에 손상을 최소화 할 수있을만큼 작은 수 있도록 바늘의 끝을 깨고 고급 집게를 사용합니다. 팁을 깨는 후, 팁 크기는 40-50 μm 주변에 있어야합니다. 유리 바늘은 튜브의 길이와 3 참조 플라스틱 주사기에 부착되어 있습니다. 주입 매체의 흐름을 수동으로 긍정적 인 압력 또는 S를 적용 제어됩니다주사기로 uction. 주사기 장치가 감염 및 제어 주사 모두에 사용됩니다으로 주입 유체와 함께 고무 튜브를 오염하지 마십시오.
- CO 2 패드에 올려 퍼팅으로 파리를 마취. CO 2는 패드를 ...을 축이다하고 패드에 파리의 조작을 복잡하게 할 수 있습니다 정전기를 줄이기 위해 물을 밀봉 된 용기를 통해 전달됩니다. 등쪽 가슴의 scutellum 위의 지역에 유리 바늘을 농담으로 파리를 삽입. 파리에 주입 매체의 전달은 식용 색소에 의해 확인된다 - 파리 시스템을 통해 식용 색소 확산 등 푸른십시오. 제 3 절에 설명 된대로 파리에 발생 박테리아의 복용은 아래, 정량화 할 수 있습니다. 일부 실험 디자인은 PBS와 음식 색으로하지만, 세균이없는 파리를 주입하여 무균 부상을 수신하는 제어 그룹을 포함합니다.
3. 박테리아로드를 결정
evaluatin 한 가지 방법g 세균 감염에 대한 면역 반응은 세균로드 후 감염을 결정하는 것입니다. D. melanogaster는 전체 플라이는 개인에서 총 세균 수를 추정하기 위해 균질 할 수 있기 때문에이 매개 변수를 결정 할 수있는 좋은 모델입니다. 이 프로토콜 뒤에 근거는 Luria 국물 (LB) 페트리 접시에 한천 (LB 플레이트)와 같은 고체 매체에 성장하면, 하나의 세균이 보이는 구별 식민지를 형성 해당합니다. 따라서, homogenate의 일련 dilutions을 생성하고, LB 플레이트에 희석 homogenate를 확산, LB 액체 매체에 감염된 파리가 homogenizing하여 파리 감염 세균 세포의 수를 결정 할 수 있습니다. PBS와 음식 색으로하지만, 세균없이 주입 파리의 제어 그룹은 감염이 다른 세균 종으로 오염되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다. 이 조건에 LB 한천 플레이트에 아무런 식민지이 없어야합니다.
- 이 사용됩니다 모든 자료를 압력솥실제 균질화 단계를 수행하기 전에 절차. 이 균질화에 사용되는 가위, LB 미디어 및 pestles로 잘라 200 μl 피펫 팁이 포함되어 있습니다. 파리 homogenizing하기 전에 최소 1 일 10cm 무균 배양 접시에 autoclaved LB / 한천 매체를 주입하여 접시를 준비합니다.
- 마취과 얼음에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 매장 튜브에 파리를 수집합니다.
- 오염을 방지하기 위해 불 근처의 균질화를 수행합니다. 이러한 S. 같은 박테리아 변종을 사용하여 특히 감염없이 파리를 포함하는 제어 균질화하는 것이 좋습니다 항생제 저항하지 marcescens. 10 파리 각 당 실험 조건 2 그룹의 최소 균질화. homogenate 당 사용되는 파리의 수는 실험에 의해 결정됩니다. 다른 사람들이 homogenate 당 3-10 파리에서 사용했던 일부 그룹은 개별 파리 8 사이의 세균로드에 변화를 평가하는 데 유용합니다있는 homogenate에 하나씩 파리를 사용한9-12 유전자형이나 실험 조건에서 비교할 수 있습니다.
- 파리를 포함하는 각 microcentrifuge 관에 400 μl LB 매체를 추가하고 작은 모터와 유봉 (Kontes)를 사용하여 균질화.
- 소독 컷 피펫 팁을 사용하여 시리얼은 180 μl LB 매체를 포함하는 1.5 μl microcentrifuge 관 20 μl 균질 LB / 박테리아 매체를 추가하여 homogenate 1시 10분을 희석. 피펫 팁을 절단하는 것은 플라이의 잔해로부터 막힘을 방지하고 적절한 볼륨이 전송되는 것을 보장합니다.
- 희석 계수는 경험적으로 결정하고 즉시의 유전자형, 사용 된 박테리아 변종, 그리고 실험 조건에 따라 달라집니다 있습니다. 야생의 유형은 S.에 감염 파리에 대한 marcescens은 이후 감염 즉시 무균 파리에 1시 10분 2 1시 10분 3 dilutions을 사용하고, 파리에 대한 1시 10분 4 1시 10분 5 dilutions은 24 시간 후 감염을 균질.
- 마이크에서 100 μl LB / 박테리아 매체를 추가하십시오및 최종 희석을 포함 rocentrifuge 관은 더 유통을 보장하기 위해 유리 공 (VWR)를 사용하여 LB 플레이트에 매체를 확산.
- 백퍼센트 EtOH 솔루션에 유리 공을 폐기하십시오. 밤에는 37 ° C 배양기에서 LB 플레이트를 배치합니다.
- 선택 단계로 LB 플레이트 (; 알파 Innotech FluorChem 8900)의 이미지를 얻기 위해 시각적 인 빛으로 이미징 시스템을 사용합니다. 판 자체에 또는 포토샵 소프트웨어 (어도비 포토샵 CS3)에서 계산 도구를 사용하여 판의 이미지에서 어느 식민지의 숫자를 계산합니다.
- 수 집락 형성 수식을 사용하여 플라이 당 단위를 계산 : [N / (N * D * V)] * V, n은 LB 플레이트에 성장 식민지의 = 수, N은 = 파리의 수는 하나의 풀링 microcentrifuge 관, D = 희석 요인, 그리고 V 각 플레이트에 확산 솔루션의 = 볼륨, V homogenate의 = 초기 볼륨입니다.
4. 감염 후 수면과 생존 기간을 평가
- 에세균 하중을 측정하기위한 수확하지 않는 파리, 다른 7-10일에 대한 동작을 모니터링 계속합니다. 생존 기간은 즉시, 환경 조건의 유전자형의 영향을, 그리고 박테리아 종은 감염에 사용됩니다.
- ~ 10 일 후, 실험을 종료 다운로드 이전에 6에 설명 된대로 행동 데이터를 처리합니다. MATLAB에 기반을두고 있습니다 Insomniac2 사용자 정의 소프트웨어는, 잠 매개 변수를 분석하는 데 사용됩니다. 그것은 행동 분석에서 죽은 파리를 제거하는 것이 중요합니다. 일반적으로,이 감염과 플라이 유전자형의 종류에 따라 감염 후 첫 일 이내에으로 분석을 제한합니다. 분석의 죽음은 모든 활동 카운트가 0에 도달 할 때까지 표시됩니다. 생존 분석을 용이하게하기 위해, Drosonex, 마이크로 소프트 비주얼로 작성된 맞춤 소프트웨어 C + + 6.0, Trikinetics 댐 시스템에서 원시 데이터 파일을 처리하는 데 사용됩니다. Excel 파일은 각 비행의 생존 기간 (시간)과 같은 소프트웨어 보고서는 활동 DAT을 컴파일하나의 스프레드 시트로 모든 모니터에서, 그리고 %가 날아보고는 사용자에 의해 설정된 시간이 지남에 살아. 엑셀 파일은 추가적인 분석을 위해 다른 통계 소프트웨어 패키지에 통합하도록 설계되어 있습니다.
5. 루시 페라 제 리포터 분석을 사용하여 감염 동안 NFκB 활동을 측정
유전자 변형 κB 룩이 분석에 사용되는 파리는 이전에 다음과 같은 쿠오 외에 설명되어 생성되었다., 2010 2. 간단히, κB 룩의 기자는 루시 페라 열린 독서 프레임의 상류 발기인에 삽입 된 NFκB 바인딩 순서의 8 반복이 포함되어 있습니다.
- 로 1.2 항에 설명 된 실험 조명 조건에 파리를 조정합니다. 이 예에서는 1~4일 이전 κB 룩의 파리는 5 %의 자당, 2 % 한천 식품 매체와 감염 동안 다른 파리와 같은 연령에 도달하기 2 일 일정 빛 (LL)에 배치를 포함하는 병에 자리 잡고 있습니다.
- 파리에 96 잘 microplate를 준비합니다. 각각의 잘 음식 매체 2 층 (그림 2)를 포함하고, 상위 계층은 luciferin, 루시 페라 제의 기판이 포함되어 있습니다. 5 %의 자당, 각도에 2 % 한천 솔루션 300 μl를 추가하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 다음으로, 각도 포함 5 %의 자당, 1 %의 한천, 2 MM luciferin (골드 바이오 주식회사)에 50 μl 상단 레이어를 추가합니다. Drosophila의 측정 기자 활동에 사용 Luciferin 농도는 문헌에서 다양 한 100 μM 13과 같은 낮은되었습니다. 필요한 농도는 경험적으로 결정될 수있다. 식품 레이어를 분배 사이에 불임을 유지하면서 건조 촉진하는 좋은 메쉬 천으로 커버 플레이트. 플레이트는 응축 방울 속에 갇히지에서 파리를 방지하기 위해 최대 1 시간까지, 철저하게 건조 할 수 있어야합니다. luciferin는 빛에 민감한이기 때문에, 필요 이상의 불을 접시를 노출하지 마십시오.
- 명확한 접착제 필름을 (톱 적용- 인감-A, Perkin 엘머)도 당 2 구멍의 수량에 좋은 바늘을 사용하여 96 - 웰 microwell 판과 구멍이 있습니다. 이 구멍은 각 잘에 공기 교환을 허용하지 않습니다뿐만 아니라, 개별적으로 파리를 마취하는 방법을 제공합니다. 날카로운 칼날과 직선 가장자리를 사용하여, 각 열 사이에 컷을 소개합니다. 이 한 번에로드 / 8의 그룹으로 파리를 언로드 할 수있는 쉬운 방법을 제공합니다.
microwell 판에 파리를로드하려면, CO 2 패드에 보육과 마취의 파리에서 튜브를 제거합니다. 로드는 열 별 열 각 잘에 하나씩 이동합니다. 그들은 종종 개입없이 스스로를 해방 할 수 있습니다으로는 접착제 씰에 불편한 점이 실수로 날아 경우, 혼자 파리를 출발합니다. 8-24 시간 새로운 환경에 적응하고 luciferin 기판을 섭취하는 LL의 보육에 microwell 판을 반환합니다. - 문화 박테리아, S. marcescens, 이상 설명한 바와 같이 감염을위한 솔루션을 준비합니다.
- 마취시키다 t그는 저압 CO 2 라인에 부착 된 micropipette 팁을 사용하여 이동합니다. 직접 각도에 한 환기 구멍 위의 micropipette 팁을 놓으십시오. CO 2 압력이 파리를 마취시키다 할 수있을만큼 높지하지만 플라이로 부상을 방지 할 수있을만큼 낮은 수 있도록주의보세요. 여덟 그룹에서 개별적으로 CO 2 패드를 각 플라이를 전송하고, 위에서 설명한대로 감염. 감염 후, 잘 원래 각 플라이를 반환하고 microplate를 봉인.
- 측정 발광 (TopCount-NXT의 발광과 섬광 카운터, Perkin-엘머). TopCount 발광 카운터는 시간의 길이 (보통 최대 5 일)를 원하는 단위에서 지속적으로 프로그래밍 및 자동 판독이 가능 플레이트에 대한 스택 카세트가 포함되어 있습니다. 이 기능은 모든 악기에서 사용할 수 없습니다, 다른 악기와 함께 실험을위한 데이터 수집 따라서 덜 자주있을 수 있습니다. 발광 카운터는 RO에 자리 잡고 있습니다제어 온도 및 조명 일정 톰. 스태킹 카세트에 접시를로드 할 때, 파리 빛받을 수 있도록 명확한 빈 플레이트들 사이의 파리가 들어있는 접시를 쌓아. 판독 24 시간의 최소 시간 간격으로 수집하는 제조업체의 사양에 따라 프로그램을 luminometer. 이 예에서 경보기가 10 초 각 우물을 읽고 초당 카운트 (임의의 단위)로 결과를 표현하는 프로그램입니다. 이 값은 잘 당 3 판독에 걸쳐 평균입니다. 스프레드 시트에 데이터 파일을 내보내 표준 분석을 수행, 발광의 결과를 그래프.
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Representative Results
- 감염은 수면을 촉진합니다. 이 예에서는 광동-S는 (CS) 야생 타입 파리와 NFκB 유전자 양념 (상대적 E20) 14이 부족한 돌연변이 파리는 두 DAM2 활동 모니터에로드 된 (N = 각 유전자형 32)와 위에서 설명한대로 감염. 파리는 행동과 감염 2,7,8에 circadian 시계의 영향을 제거하기 위해 지속적으로 빛을 유지했다. 로 이전 11 설명 상대적 E20의 돌연변이는 CS에 isogenized했다. 파리의 두 세트 S.에 감염되었습니다 marcescens 그 결과는 그림 3에 그려져있다. 어떤 경우에는 추가 처리 제어 그룹은 감염 2의 효과를 처리 효과를 구별하는 데 유용합니다. 처리 제어 그룹은 같은 시간 기간 동안 인큐베이터 및 anesthetization의 제거를 포함 감염된 그룹과 같은 환경 변화에 노출되어 있지만 주사를받지 못. 그러나,이 예에서, 그것은 상대적 E20 뮤턴트 CS 제어 감염 (그림 3A) 이후에 날아보다 적은 수면을 경험 것이 분명하다. 이전 6 설명한 바와 같이, 댐 분석에서 측정 할 수있는 다른 행동 매개 변수가 있습니다. 이러한 단위 시간 당 총 작업 수를 (그림 3B)를 포함 할 수있다. 이 예에서 감염 거울 수면 그 후 활동의 변화. 우리는 활동 속도, 또는 깨어있는 분당 활동 횟수 (그림 3C)를보고합니다. 이 매개 변수는 파리에서 전위의 능력 중 하나 지표입니다. 이 경우, 깨어 활동 요금은 활동이나 수면의 증가에 해당 감소가 감소 전위의 능력의 결과가 아닙니다 제시 감염, 동안 두 유전자형에 변경하지 마십시오.
- 그림 4A 감염 후 생존의 속도를 도시한다. 에서 이전에 발견 14,15에 의거하여 상대적 E20 돌연변이 빠르게 굴복fection는 야생 타입 파리에 비해. 대부분의 감염과 아닌 사출로 인한 부상에 굴복 입은 나타내는 무균 제어 분사 (그림 4B)을 살아 이동합니다. 맛의 돌연변이가 이렇게 빨리 사망 때문에, 유일한 CS가 난다는 감염 후 세균 하중 (그림 5) 설명하는 데 사용되었습니다. 그림은 5 쇼 그 S. marcescens 감염 후 즉시 24 시간에 세포 분열 따위에 의해 번식하고 있습니다.
- 루시 페라 제 리포터 활동은 네 개인 파리 (그림 6)의 분석에 시간을 가로 질러 그려져 있습니다. 데이터 포인트와 개별 파리 사이에 큰 변화가 우물 안에서 움직이는 파리에 귀속 될 수 있습니다. 신호가 즉시 내의 모든 조직에서 파생되지만, 그것은 모든 조직은 신호의 동일한 금액을 방출 것이며, 검출기에 조직의 가시성이 즉시 동작으로 다를 것으로 예상되지 않습니다. 이 예에서는 파리는 감염 비교했다처리 제어 그룹과. 죽은 파리는 그림 7A에 표시된 파리의 그룹에 걸쳐 분석에서 제외되었습니다. 죽은 파리는 육안 검사에 의해 결정됩니다. 이 파리에서 루시 페라 신호의 날카로운 드롭뿐만 아니라 신호 변화의 감소는 파리가 이동하지 않습니다 나타냅니다있다. κB 룩의 기자 활동이 지속적으로 감염 (그림 7A)과 무균 부상 후 상승 (그림 7b는 ). 기자 활동 12 시간 후 부상 후 감염 주변 봉우리. 파리의 유전자 및 / 또는 행동 모두 조작은 감염시 κB 룩의 기자 활동을 수정 할 것으로 기대됩니다. 예를 들어, 우리는 이미이 κB 룩 기자가 NFκB에 고유 나타내는 상대적 E20 돌연변이에 감염 동안 κB 룩의 기자 활동의 유도가 크게 감소이라고 2 설명했다.
1 그림. . (B) 단계의 순서는 NFκB에 의존 측정하는 설명되어 있습니다, Drosophila의 면역 반응을 측정의 주요 단계를 설명합니다 (A) 단계의 순서는 측정 수면, 생존, 그리고 감염시 세균 부하에 대해 설명되어 있습니다 흐름도 감염시 루시 페라 제 리포터 활동. 실험은 사용 박테리아 종의 lethality에 따라 1-5일에서 아무 곳이나 계속할 수 있습니다.
그림 2. 물론 개인 microplate의 개략적. 파리는 불투명, 중간 및 그림과 같이 적용을 포함하는 96 잘 접시에 배치됩니다. 파리는 개별적으로 감염 처리됩니다하므로 중요한 t이다합리적으로 실험 상황에 따라, 주어진 기간 내에 관리 할 수 금액 접시 당 파리의 수를 제한 O.
그림 3. S.에 감염된 파리의 행동 반응 marcescens. (A) 평균 ± 동안 수면 및 (B) 평균을 이동합니다 SEM %의 시간을 ± SEM 총 활동 횟수는 S.과 감염 이전과 이후 1 일 4 시간 단위로 역모 아르 marcescens. (C) 평균 ± 깨어있는 분당 SEM 활동 수를 S.과 감염되기 전에 (BL = 기준선)과 후 marcescens은 8 시간 단위로 도시된다. 행동은 최소 24 시간 게시물 감염 살아 야생 형 CS의 파리에 대해보고하고, 면역 - 결함 상대적 E20에 대한 THA을 날아된다t는 최소한 8 시간 포스트 감염 살아 남았습니다. CS 및 상대적 E20를위한 N = 13. ** = P <0.01 및 * = P <0.05, 학생의 T - 테스트합니다.
4 그림. 감염 감염되지 않은 파리의 생존 결과. (A) 대표 카플란 - 마이어의 생존 곡선은 S. 감염된 야생 형 CS 및 면역 - 결함 상대적 E20가 난다 모두 역모 아르 marcescens. P = 8.13x 10 -13, 직업 테스트를 기록합니다. N CS과 n에 대한 = 31 상대적 E20의 파리에 = 32. 파리 박테리아가없는 액체 매체와 주입에 의한 무균 부상을당한 경우를 제외하고 (B) 대표 카플란 - 마이어의 생존 곡선은 (A)와 같이보고됩니다. 거의 모든 파리는 실험의 끝 (60 시간 게시물 부상)까지 무균 부상을 살아 남았습니다. P> 0.97, 로그 Rank 시험, N CS와 상대적 E20 파리에 = 32.
그림 5. S.에 감염 파리에있는 세균 부하의 정량화 marcescens. CS에서 (A) 대표 세균 문화 S.에 감염 파리 즉시 감염 (왼쪽 패널) 또는 감염 (오른쪽 패널) 후 24 시간 이후에 수확 된 marcescens. 희석 요인은 각 그림 아래 표시됩니다. 이 예에서, 10 파리는 각 그룹에 400 μl 솔루션 균질되었습니다. 최종 희석의 100 μl은 각 플레이트에 확산되었다. 왼쪽 판은 29 식민지 성형 단위 (CFU)가 포함되어 있습니다. CFU를 계산 / 날아 의해 29 CFU를 나누어 [10 파리 * 0.001 (희석 계수) * 100 μl (판 위에 볼륨 확산)], 29와 동일하고 400 μl = 11,600의 초기 볼륨에 의해 곱합니다. 이 특정 판의 경우, 우리는 1.16 X의 평균이 10 4CFU / 플라이. 오른쪽 판은 257 식민지가 포함되어 있습니다. 같은 수식을 사용하여, 우리는 1.03 × 10 6 CFU / 플라이의 평균을 찾습니다. 그림과 같이 (B) 각 실험 조건에서 각 접시에서 CFU / 플라이를 계산 한 후, 상자 및 수염 플롯을 생성합니다. 이 예에서 25 50번째 (중간)와 75번째 퍼센트는 하단, 중, 상자의 상단으로 제공됩니다. 오류 막대는 세 독립적 인 실험에서 표준 편차를 나타냅니다. ** P <0.01 학생의 t-테스트합니다.
6 그림. S.에 감염 개별 파리에서 NFκB에 의존 루시 페라 제 리포터 활동 .와 감염된 파리 (오른쪽 패널), 원시 데이터의 marcescens 대표 사례는 개별 감염되지 않은 파리 (왼쪽 패널 처리 제어)에 표시됩니다. 기본 읽기 (시간 '0 '은) 즉시 감염 또는 취급하기 전에 수집 된, 모든 다른파리 치료 된 후 시간이 포인트는 수집되었습니다. 감염 처리 제어 조건에서 파리 사이의 Y 축에 규모의 차이를 확인합니다. 각 플라이 내에서 신호의 큰 변화는 microwell 안에 파리의 움직임으로 표시 될 수 있습니다.
그림 7. S.과 감염 무균 주사로 marcescens이나 부상이 사는 파리에 κB 룩의 기자 활동을 증가시킵니다. ± SEM 루시 페라 제 활동 (임의의 단위)가 감염 된 모든 파리에서 매 4 시간을 꾸몄다 (A) 또는 무균 주사 (B)에 의해 부상 및 최대 살아있다 평균 검정에 24. 반복 조치를 편도 ANOVA은 기자 활동 (inj, P <0.01) 부상 (P <0.05)에 감염된 크게 증가하는 표시, 그들의 처리 사기꾼trol (HC, P <0.01)의 기준에 상대적 그룹 (시간 '0 '; Tukey의 사후 특별). (삽입, 패널 A) : HC 그룹의 데이터는 다른 규모에 표시됩니다. HC 그룹의 기자 활동에서 작지만 상당한 증가는 파리는 가벼운 스트레스를 경험하거나 처리 (와 microwell 판과 anesthetization로 이에 상응하는 금액에서 감염된 파리로 전송)에서 잠이 오지 않음을 증가 수 있습니다 제안합니다. 모두 감염된와 부상당한 그룹은 지정된 시간 지점에서 HC 그룹에 그보다 훨씬 더이었다 κB 룩의 기자 활동의 강력한 입회식을 보여 주었다 * = P <0 0.05, ** = P <0 0.01,. 학생의 t - 시험 (A) N = 20 HC과 n = 13 감염 (B) N = 15 HC과 n = 14 부상.
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Discussion
이 프로토콜은 문제는, 특히 잠, 면역 반응 매개 변수에 연결되는 방식을 조사 할 방법을 설명합니다. 이 매개 변수는 생체의 루시 페라 제 리포터에 의해 측정으로 세균로드, 생존 결과 및 NFκB 활동이 포함되어 있습니다. 함께 이러한 매개 변수는 파리가 감염을 싸울 수있는 방법을 잘에 대한 정보를 제공합니다. 박테리아 부하와 생존 결과는 Drosophila의 직접적인 측정을 포함 면역 반응 매개 변수입니다. 굴복 빠르게 세균 감염에 대한 면역 반응의 핵심입니다 NFκB 전사 인자를 부족 상대적 E20 돌연변이. 행동의 유전자 또는 다른 조작도 가능 NFκB 활동 자체에 영향을 미치는으로 해당 면역 반응 매개 변수에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 양념의 mRNA의 감염이 증가 표현 이전에 빈곤을 자고하고, CFU을 감소 / 비 박탈 컨트롤 11 상대적으로 날아. Mutan시계 유전자, 기간 7 영원한 8의 TS는 또한 감염 동안 생존뿐만 아니라 세균 통관 8 줄이기 위해보고되었습니다. 이 방법을 사용하여 추가 연구가 문제가 면역 기능에 영향을 미칠 수있는 방법으로 기계론의 통찰력을 제공 할 것으로 기대됩니다.
우리가 여기서 설명하는 분사 / 감염 절차는 우 외 (16)에 의해 이전에 설명 된 방법에서 수정됩니다. 이 절차는 간단하고 저렴합니다. 그러나, 단점은 표시등이 원유이며, 다양성에 기여할 수와 같은 염료의 사용과 사출 볼륨의 수동 제어합니다. 다른 그룹은 일정한 주입 볼륨 17를 사용하도록 설정 microinjector을 사용했거나 바늘로 파리가 박테리아 문화 18에 담근 칼로 찔 렀어. 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 방법은 실험 조건 11,19에서 세균 통관의 변화를 감지에 성공 </>를 논의하게 될 것입니다.
감염 동안 파리의 생존은 일반적으로 정기적으로 시간 초과 간격으로 남아있는 파리를 계산하여 정량화되어 있습니다. 여기 활동의 중지로 표시됩니다 개별 파리에서 사망 시간을 모니터링 할 수 Trikinetics 댐 시스템을 사용합니다. 우리는 전위의 활동에 의해 결정 생존 결과는 감염 (게시되지 않은) 동안 활동 튜브에 파리의 육안 검사에 의해 결정 그와 같은 것을 확인했습니다. 이 방법은 생명에게 기간 20,21을 측정하기 위해 이전에 사용되었습니다. 그러나, DAM 시스템의 생존의 평가가 격리 파리에서 해당로 제한하고,이 조건에서 파생 된 결과가 그룹화 조건에서 다를 것으로 예상되어 있사오니, 이용에 참고하는 것이 중요합니다. 초기 연구는 호스트가 격리 된 상태 22 비교 그룹에 배치됩니다 생존의 차이를 보여 주었다. 최근 작업은 또한 파리의 그룹에서 수명이 긴 것을 확인했습니다절연 파리 20 년보다.
루시 페라 제 리포터 활동은 생활 파리에서 시계 유전자 발현 (예를 들어, 심판 23)의 분석을 위해 이전에 사용되었습니다. 이러한 경우에는, 다른 기술 고려 특히, 분석을 실행 며칠 동안 발생하는 luciferin 기판의 고갈 필요합니다. 반면에, 검정 여기에 감염된 파리의 생존으로 제한됩니다 설명과 감염 후 24 시간 동안 간단한 측정을 참여. 반복 측정 ANOVA는 각 그룹 내에서 기본에서 변경 내용을 평가하기에 충분했다. 기판 고갈에 대한 해결하기 위해 정상화 단계와 함께 루시 페라 제 기자의 circadian 진동을 분석하는 데있어 통계 방식이 완전히 다른 24 설명되어 있습니다. 각각의 경우에, 각 파리에서 실시간으로 기자 활동을 측정하는 것은 역보다 그 시간적 역학에 대한 정보를 추출하기위한보다 효율적인 방법입니다ndard 생화학 및 immunohistochemical assays.
그러나 생체에서 루시 페라 제 리포터 활동을 모니터링에 대한 잠재적 인 단점은 luciferin 기판을 먹고 파리에 의존한다는 것입니다. 거식증은 파리의 감염과 관련이 있으며, 먹이은 감염의 유형이나 genotypes 25 중 변경 될 수 있습니다. 기판의 섭취에 대한 우려를 회피하려면, 파리는 감염 후 별도의 신체 부위 또는 조직으로 해부 할 수 있으며, 이전에 26에 설명 된대로 기자 활동이 문화에 측정 할 수 있습니다. 또한, 루시 페라 제 분석의 결과는 또한 먹이에 의존하지 않는 표준 분석을 사용하여 확인 할 수 있습니다. 예를 들어, 정량 PCR은 항균 펩타이드 (AMP) mRNA의 표현 수준을 측정 할 수있는 일반적으로 사용되는 방법이었다. 증폭기는 NFκB의 알려진 대상이며, 따라서 활동의 수준을 나타냅니다.
대표 DATNFκB는 면역 도전과 수면 2 이후 증가 상승을 보여 이전 작업을 요점을 되풀이 여기 설명했다. 그러나, 독자 Trikinetics 댐 시스템에서 해당 잠이 5 연속 분 27 최소 비활성으로 표시됩니다주의합니다. videography하여 파리의 수면 측정은 활동이 없으면 28 일에 의존하고 있습니다. 그것은 또한 면역 도전 동물이 29 수면없이 오랜 기간에 대해 운영 중지 상태가됩니다 것으로 알려져 있기 때문에 파리에있는이 수면 정의는 잠재적으로 감염시 문제가 될 수 있습니다. , 측정 감각 응답은 파리 실제로 잠되어 있는지 확인하는 데 필요한 것을 assays을이 문제를 극복합니다. 조사는 나무 막대기 31 또는 난방 관 27의 한쪽 끝으로 활동 튜브를 닦고 같은 연필 탭 30 감각 자극,에 파리의 대응 능력을 결정했습니다. 모든 경우에, 잠 파리 적은 반응 (측정두 응답 지연 또는 %까지 깨어 파리보다) 그룹으로 응답 이동합니다. 우리는 잠 감염된 파리가 최대 감각 자극에 실제로 덜 민감하게 반응하는 것으로 확인되었습니다 6-8 시간 후 감염 (TH. 쿠오와 JA 윌리엄스되지 않은 관찰). 기술적 한계에도 불구하고, Trikinetics 댐 시스템은 수면과 면역 기능 사이의 유전자와 분자 링크를 탐험 파리 향후 연구에 도움이 될 높은 처리량 장점을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부여 # IOS-1025627 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원과 보조금에 따라 국립 보건원 # 1R21NS078582-01의 턱에 한
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
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