Summary
In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.
Abstract
Abbiamo identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono a trigger di aritmia atriale nei topi. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dai cuori di topo che derivati da quelli progettati per isolare cardiomiociti murini neonatali. Al fine di ottenere melanociti cardiache sane adatte per una più ampia patch clamp o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata per isolare e placcatura melanociti cardiaci basati su quelli originariamente progettato per isolare melanociti cutanei. La procedura raffinata è dimostrato in questa recensione e produce un numero maggiore di cellule melanociti-come sani che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.
Introduction
Abbiamo recentemente identificato una popolazione di cellule romanzo nel cuore di topi e gli esseri umani che esprimono enzimi melanina-sintesi e morfologicamente assomigliano melanociti cutanei. Abbiamo chiamato 'melanociti cardiaci' queste cellule e l'ho trovato sono presenti in posizioni anatomiche da cui aritmia atriale trigger spesso origine negli esseri umani. Abbiamo anche trovato melanociti cardiaci contribuiscono ad aritmie atriali nei topi con delezione linea germinale di Dct. Melanociti cardiache sono scarsamente distribuiti in tutto l'atrio del mouse dove essi costituiscono meno dello 0,1% di tutte le cellule atriali. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dal cuore mouse utilizzando marcatori specifici melanociti Cre-inducibile. La nostra procedura iniziale è stato sviluppato da quelli utilizzati per isolare cardiomiociti murini neonatali e fruttate molto piccolo numero di cellule adatti per le registrazioni di patch clamp o analisi PCR. Tuttavia, per migliorare la guarigioneesima e la vitalità dei melanociti cardiaci, per più approfondita analisi elettrofisiologica o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata da quelli progettati per isolare melanociti cutanei. La procedura descritta e dimostrata in questa recensione ha il vantaggio di produrre sani melanociti cardiaco che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Preparare le soluzioni necessarie e attrezzature
- In primo luogo, sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze diritte forma, pinze forma curva, forbici forma diritta, e forbici forma curva) da loro autoclave per 15 min. a 121 ° C. Preparare 2 set di strumenti, in cui viene utilizzato un set per sezionare i cuori e l'altro insieme saranno utilizzati per tritare il tessuto.
- Sciogliere 1 bustina di MCDB153 cultura media in 900 ml di sterile, acqua filtrata e mescolare lentamente fino a che la polvere si è sciolta. Aggiungere 1,2 g di bicarbonato di sodio, o 15,7 ml di soluzione di bicarbonato di sodio [7,5% w / v], per ogni litro di volume finale di soluzione in fase di preparazione e mescolare fino alla dissoluzione. Regolare il pH a 7,2 aggiungendo o 1 N HCl o NaOH 1 N, quindi versare i media attraverso un filtro 0,2 micron top bottiglia in condizioni di sterilità in una cappa coltura tissutale (cabinet biosicurezza). Poi raccogliere i media e conservarlo a 4 ° C.
- Preparare i supplementi aiaggiungere al terreno di coltura (Elenco materiali). Gli integratori devono essere aggiunti ai media poco prima è necessario il supporto per la placcatura le cellule.
- Preparare DPBS con 10% FBS più antibiotici (penicillina e streptomicina).
- Avanti, preparare una soluzione di tripsina 0,25% con l'aggiunta di 0,25 g di tripsina (pancreas bovino, attività> 2.500 unità USP / mg, ultrapura, USB) a 100 ml di DPBS più antibiotici (penicillina e streptomicina).
- Altre apparecchiature necessarie necessaria per completare questa procedura includono uno stereomicroscopio, Petri-piatti (10 cm), tubi conici da 50 ml, filtri cellulari 40-micron, DPBS più antibiotici, 60 mm piatti della cultura e da 35 mm piatti della cultura.
2 Isolare Cuori da neonatali mouse Pups
- In primo luogo, ottenere P0 a P2 cuccioli di topo neonatale (n = 6 a 8). Si consiglia di utilizzare cuccioli generati da allevamento DCT-Cre femmine omozigoti con i maschi che sono eterozigoti per entrambi il R26R: EYFP allele o Z / EG allele per etichettare l'cellule melanociti-like. Entrambi R26R: EYFP e Z / EG topi sono disponibili da Jackson Laboratories (numeri azionari 006.148 e 003.920 rispettivamente).
- Avanti, eutanasia neonatale i cuccioli di topo, pulire il petto con un batuffolo imbevuto di alcool e poi mettere i cuccioli in un cm 10 Scatola di Petri con DPBS.
- Tagliare la pelle sul petto e lo sterno con le pinze e forbici sterilizzate e poi aprire con cautela il petto sotto uno stereomicroscopio. I cuori di cuccioli neonati di topo sono molto piccole quindi fate attenzione a fare in modo di rimuovere l'intero cuore con gli atri allegate.
- Lavare i cuori in DPBS e trasferirli in un nuovo piatto di Petri di 10 cm.
3 Digestione enzimatica
- Portare la piastra di Petri con il cuore asportato ad una cappa di coltura tissutale (cabinet biosicurezza) e poi seguire le istruzioni riportate di seguito utilizzando tecniche sterili nella cappa.
- In primo luogo, lavare i cuori per tre volte in DPBS sterili, più antibiotici.
- Posizionare i cuori (n = 6-8) in un60-mm piatto di coltura e aggiungere 6-8 ml di soluzione di tripsina allo 0,5% al piatto.
- Quindi, tagliare i cuori in piccoli pezzi (meno di 1 mm di dimensioni) e incubare a 37 ° C per 30 minuti in una atmosfera di CO 2 5%.
- Dopo il periodo di incubazione è completa, versare la soluzione risultante di tessuto cardiaco e tripsina dal piatto in un tubo conico da 50 ml sterile.
- Poi, usando una pipetta sterile da 10 ml, rapidamente ma delicatamente, triturare la soluzione nel tubo conico da 50 ml 30-50 volte.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro cella 40 micron sulla cima di una nuova pulita tubo conico da 50 ml, per raccogliere il filtrato.
- Successivamente, centrifugare la provetta da 50 ml a 240 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. Poi, delicatamente Aspirare il sopranatante e risospendere il pellet residuo in 6-8 ml di DPBS sterili. Ripetere questa operazione altre 2 volte. Questo passaggio Pellet miociti atriali e melanociti cardiache, ma non far cadere il fifibroblasti in quanto i fibroblasti sono più piccole e rimarranno nel surnatante.
Celle 4 placcatura cardiaca melanocita-like
- Dopo il terzo risciacquo dopo la centrifugazione, scarico con attenzione o aspirare al largo della soluzione di lavaggio (DPBS) e risospendere il pellet in 6 ml di terreni di coltura MCDB a cui sono stati aggiunti i supplementi.
- Ora, disegnare la soluzione risospeso in una pipetta di trasferimento sterile e posizionare le cellule in un piatto da 35 mm, o in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, e in comune le cellule cardiache isolate da 3 topi neonati in un piatto da 35 mm o bene.
- Incubare i piatti per una notte a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%, aspirare fuori dal terreno di coltura insieme a tutte le cellule non attaccati e poi sciacquare le piastre una volta con DPBS. Quindi aggiungere mezzi freschi per le piastre e sostituire i media ogni 2 giorni. Le cellule isolate da cuori neonatale o embrionali possono essere mantenuti in coltura per fino a 3 settimane, mentre le cellule isolate da sentire adultots possono essere mantenute in coltura per un massimo di 10 giorni.
Cellule 5. isolamento Cardiac melanocita-come da Cuore topo adulto
- In primo luogo, rimuovere i cuori di topi maturo (3-4 settimane di età, n = 3) attraverso una sternotomia linea mediana dopo somministrazione di eparina 100 U intraperitoneale ai topi e poi li eutanasia. Si consiglia di utilizzare pentobarbital di eutanasia topi per questa procedura, ma questo farmaco non è disponibile in tutte le località.
- Successivamente, lavare i cuori asportati in DPBS sterili contenenti antibiotici in una cappa coltura tissutale (cabinet biosicurezza). Spremere il cuore leggermente con dissettore curve per rimuovere il sangue residuo da loro e poi sciacquare i cuori in DPBS ancora una volta.
- Rimuovere gli atri e anello atrioventricolare dal cuore (queste strutture contengono le cellule melanociti-like) e posizionare i campioni di tessuto asportato in un piatto da 35 mm.
- Tagliare i cuori in piccoli pezzi con le forbici curve e forzaps e poi aggiungere 6-8 ml di soluzione di tripsina allo 0,5% al piatto. Poi incubare le piastre a 37 ° C per 45-60 min.
- Ora, seguire i passaggi della procedura di cui sopra a partire dal punto 3.6 in poi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il protocollo descritto in questo articolo è una tecnica migliorata rispetto a quella che abbiamo già pubblicato per isolare melanociti cardiache dal cuore murino. Questa procedura impiega l'uso di marcatori fluorescenti guidati da sintesi della melanina specifica-enzima Cre-ricombinasi di etichettare cellule melanociti-simile cardiaci. E 'importante utilizzare un marcatore per etichettare melanociti cardiaci quando si lavora con le cellule embrionali o neonatali appena isolate, dal momento che le differenze morfologiche che distinguono melanociti cardiaci da miociti atriali non hanno ancora sviluppato (Figura 1A). Come mostrato nella Figura 1A quando il passo di isolamento va bene, un gran numero di miociti cardiaci atriali e melanociti aderirà al piatto laminina rivestite con poche cellule non aderenti. In questo caso le cellule aderenti apparirà piatta sul fondo del piatto (frecce gialle Figura 1A, punta di freccia). D'altra parte, quando il procedure non funziona bene la maggior parte delle cellule sarà non-aderenti e spesso guardare sferica e arrotondato per eccesso (punte di freccia luce blu, Figura 1A).
Quando le cellule isolate vengono visualizzati mediante imaging di fluorescenza verde, è chiaro che le cellule sono melanociti cardiache e quali cellule sono miociti atriali (Figura 1). Come accennato in precedenza nel protocollo (punto 3.9), i fibroblasti vengono rimossi dal pool di cellule atriali isolate con bassa forza di centrifugazione che Pellet più grandi miociti atriali e melanociti cardiaci, ma non abbattere i più piccoli fibroblasti cardiaci. Le cellule appena isolate possono ora essere utilizzati per singola cella registrazioni elettrofisiologiche (Figura 2), singola analisi RNA cellulare o saggi biochimici.
Abbiamo anche colto e mantenuto isolate le cellule atriali neonatale o embrionali usando questo protocollo per un massimo di 21 giorni. Usando le condizioni di coltura descritti in questoprotocollo, le cellule melanociti-come cardiache ulteriormente differenziarsi e proliferare, mentre i miociti atriali tendono a staccarsi dal piatto e morire entro i 2-3 giorni dopo che sono isolati. Mostrato nella Figura 3A sono sani melanociti cardiaci 5 giorni dopo sono stati isolati da un cuore neonatale mouse. Si noti la mancanza di miociti atriali intorno a queste cellule (in contrasto con le cellule appena isolate mostrati in Figura 1). Inoltre, questi melanociti cardiaci si sono sviluppati estesi processi dendritici e molto simili melanociti cutanei che sono stati anche nella cultura per lo stesso numero di giorni (Figura 3B).
Figura 1 Rappresentante (A) DIC e (B) immagini GFP di recente icellule atriali Solated da un embrionale (E19.5) DCT-Z / EG topo cucciolo. La freccia bianca indica il melanocita cardiaca in entrambi i pannelli. Si noti che senza l'aiuto del marcatore fluorescente, il melanocita cardiaca è difficile da identificare e distinguere dai miociti atriali (frecce gialle) allegati al piatto. Le frecce azzurre indicano le cellule atriali che non sono ben collegati al piatto.
Figura 2 Dct - / - melanociti cardiaci dimostrare azione prolungata durata del potenziale. Registrazioni clamp attuali di (A) Dct cardiaca +/- e (B) cardiaca Dct - / - cellule dimostrano aumentate durata del potenziale d'azione in assenza di Dct. Potenziale di riposo della cellula Dct +/- è -62 mV, mentre DCT - / - cellula ha un potenziale di riposo di-60 MV. Riprodotto con permesso, da Levin et al. J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Figura 3. Immagini rappresentative della isolato (A) cellule melanociti-simili cardiaci e (B) melanociti cutanei. I melanociti sono stati isolati dal cuore e la pelle di topi neonati (P1), rispettivamente, e poi coltivate per 5 giorni.
Figura 4. cellule DCT-esprimono popolano il cuore. (A) In ibridazione in situ di un cuore topo E13.5 mostra espressione Dct(frecce piene) in tutto il os vena polmonare (punta di freccia aperta). (B) immunofluorescenza di cellule DCT-positivi (frecce) all'interno delle vene polmonari. (C) X-gal colorazione delle cellule DCT-positivi nell'atrio posteriore di un mouse e16.5 DCT-LacZ cuore (frecce). (D) X-gal colorazione in un E17.5 DCT-LacZ cuore mouse lungo il setto RA nelle regioni del forame ovale, coronarico os del seno e della vena cava inferiore; scala inset = 500 micron. (E) topo adulto (p60) derivante da attraversare un DctCre +/- e R26R topo dimostra cellule positive LacZ (frecce) all'interno delle vene polmonari e atrio sinistro. cellule (F) DCT-positivi rilevati da colorazione immunofluorescenza (frecce) sull'endotelio di una vena polmonare umano rimosso chirurgicamente. Scala = 500 micron di tutti i pannelli eccetto i pannelli (B e D; scala = 100 micron) e il pannello (F; scala = 50 micron). Abbreviazioni: PV, vena polmonare; LA, atrio sinistro; Ao, aorta; PA, pulmoarteria nario; RA, atrio destro; IVC, vena cava inferiore; FO, forame ovale; CS, seno coronarico. Riprodotto con permesso, da Levin et al. J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Melanociti cardiache sono presenti in sedi anatomiche all'interno del cuore che spesso danno luogo a trigger aritmie atriali. Queste regioni comprendono le vene polmonari, l'anello atrioventricolare, posteriore sinistra dell'atrio e del forame ovale (Figura 4). Per comprendere il ruolo di queste cellule svolgono in aritmogenesi, sviluppiamo tecniche per isolare loro e studiare la loro fisiologia. Tuttavia, abbiamo riconosciuto che il miglioramento di questa tecnica a cedere quantitativi più sani e più grandi di melanociti cardiaci dovrebbero permettere ulteriori studi per indagare la risposta dei melanociti cardiache a stimoli esogeni. Inoltre, tecniche di isolamento migliorati possono anche permettere studi per studiare l'interazione dei melanociti cardiaci con miociti atriali durante la normale fisiologia e patologia.
Questo documento descrive una procedura per isolare cellule melanociti-vitali come il cuore del mouse che abbiamo sviluppato da protocolli progettati per Isolmangiato melanociti della pelle. Il passo fondamentale in questo protocollo è l'estrazione delle cellule melanociti-come dal cuore. Mentre isolare melanociti cardiache dal cuore neonatale è relativamente semplice, l'estrazione di melanociti cardiache dal cuore maturo è molto più difficile a causa della maggiore quantità di fibrosi interstiziale. In questo protocollo abbiamo usato tripsina digestione per estrarre cellule melanociti-come dal cuore maturo. Per sviluppare questo protocollo abbiamo testato diverse combinazioni enzimatiche differenti che consistevano di varie concentrazioni di tripsina, collagenasi, e dispasi.
Abbiamo trovato che il trattamento atri neonatali con una combinazione di collagenasi (per i primi 30 minuti) seguita da tripsina (per il prossimo 15 min) inizialmente prodotto rendimenti più elevati di cellule melanociti-like, ma le cellule isolate erano meno sano con diminuita vitalità. D'altra parte, la digestione con tripsina da solo ha prodotto un moderato numero di cellule melanociti-come sani di mi cuori del mouse atura. Pertanto, si consiglia semplicemente usando tripsina per isolare cellule melanociti-come da cuori murini maturi. Inoltre, abbiamo trovato che vigorosamente triturazione liquame prodotto dopo tripsina digestione di cuori maturi di topo ha migliorato il rendimento delle cellule melanociti-come vitali. Dobbiamo ricordare che la tripsina ha il potenziale per digerire parzialmente canali di membrana o di portatori di carica, e questo può influenzare la densità canale durante l'esecuzione di studi di patch clamp. Anche se non abbiamo effettuato un'analisi rigorosa per determinare se tripsina digestione influenza la densità di corrente di mature cellule isolate, melanociti, come noi non abbiamo notato alcun effetto significativo sulle correnti o potenziali d'azione negli studi che abbiamo eseguito utilizzando questo protocollo.
Cellule melanociti-come cardiache sono una popolazione molto sparsa di cellule nel cuore (meno dello 0,1% di tutte le cellule atriali) che assomiglia morfologicamente melanociti cutanei (Figura 1 e Figura 3 </ Strong>). Poiché ci sono relativamente pochi melanociti cardiache presenti nel cuore; fino a poco tempo siamo stati solo in grado di utilizzarli per analisi unicellulari (cioè la registrazione di bloccaggio di patch o single-cell PCR). Tuttavia, abbiamo ottenuto grandi quantità di melanociti cardiaci mettendo in comune 20-30 neonatale, o 5-8 cuori maturi, e trovato che questo approccio produce una quantità sufficiente di tessuto per l'esecuzione di immunoblot o saggi biochimici. Inoltre, dato il basso numero di cellule melanociti-come nel cuore murino, per migliorare il rendimento di queste cellule dopo che sono stati isolati ci pone spesso 15-20 mm circolare, Teflon inserisce sui piatti da 35 mm utilizzando grasso per vuoto sterilizzato . Le cellule possono quindi essere posizionati all'interno degli inserti per ridurre l'area di placcatura e aumenta la loro densità. Utilizzando Teflon inserisce inoltre migliora la vitalità delle cellule melanociti-come seguire il loro isolamento e durante il periodo di placcatura pure.
Alcuni Melano cardiacocellule cyte-like hanno una morfologia bipolare in seguito l'isolamento, che a nostro avviso rappresenta uno stato meno differenziato di queste cellule. Inoltre, abbiamo trovato che la coltura di melanociti cardiaci per 3 giorni successivi isolamento sembra indurre un'ulteriore differenziazione del fenotipo melanocita-like dove le cellule cominciano a formarsi dendriti. Abbiamo anche trovato questo protocollo produce cellule melanociti-come da cuori maturi che possono essere mantenuti fino a 10 giorni di coltura. Tuttavia, al di là di 10 giorni in coltura cellule melanociti-come isolati da cuori maturi smetterà di proliferare e può diventare senescenti. Melanociti cardiaci isolati e placcati possono essere utilizzati per analisi elettrofisiologiche cellulari o altre analisi molecolari / cellulari biologici, come ad esempio l'RNA profiling o studi per valutare le loro risposte fisiologiche a fattori esogeni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of award Salute R01 HL105734 a VVPMDL è supportato, in parte, dal National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP è un ricercatore innovativo della American Heart Association sostenuta da sovvenzioni 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
