Summary
في هذا البروتوكول، ث ه التعرف على السكان رواية من خلايا تشبه الخلايا الصباغية (المعروف أيضا باسم الخلايا الصباغية القلب) في قلوب الفئران والبشر التي تساهم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني يتسبب في الفئران.
Abstract
حددنا عدد سكانها رواية من خلايا تشبه الخلايا الصباغية (المعروف أيضا باسم الخلايا الصباغية القلب) في قلوب الفئران والبشر التي تساهم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني المشغلات في الفئران. للتحقيق في الخواص الكهربائية والبيولوجية للخلايا الميلانين القلب وضعنا الداخلي لعزلهم من قلوب الماوس أننا المستمدة من تلك المصممة لعزل العضلية الفئران حديثي الولادة. من أجل الحصول على الخلايا الصباغية القلب صحية مناسبة لالمشبك التصحيح أكثر اتساعا أو الدراسات البيوكيميائية، وضعنا إجراء المكرر لعزل وطلاء الخلايا الصباغية القلب بناء على تلك المصممة أصلا لعزل الخلايا الصباغية الجلدية. ويتجلى هذا الإجراء المكرر في هذا الاستعراض، وتنتج أعدادا أكبر من خلايا تشبه الخلايا الصباغية الصحية التي يمكن مطلية حيث يبلغ عدد سكانها النقي أو مع العضلية.
Introduction
حددنا مؤخرا سكان الخلية رواية في قلب الفئران والبشر التي تعبر عن الانزيمات الميلانين التوليف وشكليا تشبه الخلايا الصباغية الجلدية. كنا نسميها "الخلايا الصباغية القلب" وجدت هذه الخلايا كانت موجودة في مواقع تشريحية من عدم انتظام ضربات القلب الأذيني مشغلات التي غالبا ما تنشأ في البشر. وجدنا أيضا تساهم الخلايا الصباغية إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني في الفئران مع حذف سلالة الجرثومية من محول جيب التمام. وتوزع الخلايا الصباغية القلب قليلة في جميع أنحاء الأذين الماوس حيث أنهم يشكلون أقل من 0.1٪ من مجموع خلايا الأذيني. للتحقيق في الخواص الكهربائية والبيولوجية للخلايا الميلانين القلب وضعنا الداخلي لعزلهم من القلب الماوس باستخدام علامات محددة الصباغية جنة المساواة العرقية، محرض. وقد وضعت لدينا الإجراء الأولي من تلك المستخدمة لعزل العضلية الفئران حديثي الولادة وأسفرت عن أعداد صغيرة جدا من الخلايا مناسبة للتسجيلات المشبك التصحيح أو تحليل PCR. ومع ذلك، من أجل تحسين شفاءعشر وبقاء الخلايا الصباغية القلب، لأكثر تعمقا تحليل الكهربية أو الدراسات البيوكيميائية، وضعنا إجراء المكرر من تلك المصممة لعزل الخلايا الصباغية الجلدية. الإجراء الموضح وأظهرت في هذا الاستعراض في الاستفادة من إنتاج الخلايا الصباغية صحة القلب التي يمكن مطلية حيث يبلغ عدد سكانها النقي أو مع العضلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحلول اللازمة والمعدات
- أولا، تعقيم الأدوات الجراحية (ملقط مستقيمة الشكل، الشكل المنحني ملقط، مقص شكل مستقيم، ومقص الشكل المنحني) بواسطة التعقيم لمدة 15 دقيقة. في درجة حرارة 121 مئوية. 2 إعداد مجموعات من الأدوات، حيث يتم استخدام مجموعة واحدة للتشريح من قلوب ومجموعة أخرى سيتم استخدامها لتنميق تصل الأنسجة.
- حل 1 علبة MCDB153 سائل الإعلام والثقافة في 900 مل من تعقيمها، الماء المصفى ويقلب ببطء حتى يذوب المسحوق. إضافة 1.2 ز بيكربونات الصوديوم، أو 15.7 مل من محلول بيكربونات الصوديوم [7.5٪ ث / ت]، لكل لتر من الحجم النهائي من المتوسط الذي يجري إعداده ويحرك حتى يذوب. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 بإضافة إما 1 N 1 N حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم، ثم صب وسائل الإعلام من خلال كبار مرشح 0.2 ميكرومتر زجاجة تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية). ثم جمع وسائل الإعلام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد ملاحقإضافة إلى وسائل الإعلام ثقافة (قائمة المواد). يجب إضافة ملاحق إلى وسائل الإعلام قبل هناك حاجة إلى وسائل الإعلام لطلاء الخلايا.
- إعداد DPBS مع 10٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
- المقبل، إعداد محلول التربسين 0.25٪ بإضافة 0.25 غرام من التربسين (البنكرياس الأبقار، النشاط> 2،500 USP وحدة / ملغ، عالى النقاء. USB) إلى 100 مل من DPBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
- المعدات المطلوبة الأخرى اللازمة لإتمام هذا الإجراء تشمل stereomicroscope، أطباق بتري (10 سم)، أنابيب مخروطية 50 مل، مصافى الخلية 40 ميكرومتر، DPBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية، أطباق ثقافة 60 ملم وأطباق ثقافة 35 ملم.
2. عزل قلوب من الأطفال حديثي الولادة ماوس الجراء
- أولا، يجب الحصول على P0 P2 الماوس الجراء حديثي الولادة (ن = 6 إلى 8). فمن المستحسن استخدام الجراء الناتجة عن تربية DCT-لجنة المساواة العرقية الإناث مع الذكور متماثلة اللواقح التي هي متخالف سواء لR26R: EYFP أليل أو Z / EG أليل لتسميةخلايا تشبه الخلايا الصباغية. كلا R26R: تتوفر من جاكسون مختبرات (أرقام الأسهم و006148 003920 على التوالي) EYFP وZ / EG الفئران.
- المقبل، الموت ببطء الجراء الماوس حديثي الولادة، يمسح صدورهم مع مسحة الكحول ثم وضع الجراء في 10 سم طبق بتري مع DPBS.
- قطع الجلد فوق الصدر والقص مع ملقط معقم ومقص ثم فتح الصدر بعناية تحت stereomicroscope. قلوب الجراء الماوس حديثي الولادة صغيرة جدا لذا كن حذرا للتأكد من إزالة قلب كامل مع الأذينين المرفقة.
- غسل قلوب في DPBS ونقلها إلى طبق بتري 10 سم الجديد.
3. الأنزيمية الهضم
- جلب طبق بيتري مع قلوب رفعه إلى نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) ثم اتبع الخطوات التالية باستخدام تقنيات معقمة في غطاء محرك السيارة.
- أولا، وغسل قلوب ثلاث مرات في DPBS معقمة بالإضافة إلى المضادات الحيوية.
- وضع قلوب (ن = 6-8) في60 ملم صحن الثقافة وإضافة 6-8 مل من 0.5٪ محلول التربسين إلى الطبق.
- المقبل، وقطع القلوب الى قطع صغيرة (أقل من 1 ملم في الحجم)، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- بعد فترة حضانة كاملة، صب المحلول الناتج من الأنسجة القلبية والتربسين من الطبق إلى العقيمة أنبوب مخروطي 50 مل.
- ثم، وذلك باستخدام ماصة معقمة 10 مل، بسرعة ولكن بلطف، ويسحن الحل في أنبوب مخروطي 50 مل 30-50 مرات.
- تصفية المحلول الناتج من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على رأس ونظيفة أنبوب مخروطي 50 مل جديد لجمع الرشاحة.
- المقبل، الطرد المركزي أنبوب 50 مل في 240 ز س في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، نضح بلطف وطاف resuspend الكرية المتبقية في 6-8 مل من DPBS العقيمة. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر. هذه الخطوة الكريات في myocytes القلب الأذيني والخلايا الصباغية ولكن لا اسقاط فايbroblasts منذ الليفية هي أصغر وستبقى في طاف.
الخلايا الصباغية القلب 4. تصفيح شبيهة
- بعد شطف الثالث بعد الطرد المركزي، واستنزاف بعناية أو نضح قبالة محلول الغسيل (DPBS) و resuspend بيليه في 6 مل من وسائل الإعلام ثقافة MCDB التي تمت إضافتها الملاحق.
- الآن، واستخلاص الحل معلق في نقل ماصة معقمة ووضع الخلايا في صحن 35 ملم، أو في بئر من لوحة 6 جيدا، وتجميع خلايا القلب معزولة من 3 الفئران حديثي الولادة في واحد 35 ملم طبق أو أيضا.
- احتضان الأطباق ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، نضح من وسائل الإعلام الثقافة جنبا إلى جنب مع أي خلايا غير مرتبط ثم شطف الأطباق مرة واحدة مع DPBS. ثم إضافة وسائط جديدة للوحات واستبدال وسائل الإعلام كل يوم 2. خلايا معزولة من قلوب الأطفال حديثي الولادة أو الجنينية يمكن الحفاظ في الثقافة لمدة تصل إلى 3 أسابيع، في حين أن الخلايا المعزولة من يسمع الكباريمكن الحفاظ TS في الثقافة لمدة تصل إلى 10 يوما.
الخلايا الصباغية 5. عزل القلب مثل القلب من الكبار ماوس
- أولا، إزالة قلوب من الفئران الناضجة (3-4 أسابيع من العمر، ن = 3) من خلال القص منتصف الخط بعد إعطاء الهيبارين 100 U داخل الصفاق للفئران ثم القتل الرحيم لهم. فمن المستحسن استخدام بنتوباربيتال إلى الموت ببطء الفئران لهذا الإجراء، ولكن هذا الدواء غير متوفر في جميع المواقع.
- المقبل، وغسل قلوب رفعه في DPBS العقيمة التي تحتوي على المضادات الحيوية في نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية). ضغط على قلوب قليلا مع ملقط تشريح المنحنية لإزالة أي الدم المتبقي منها ثم شطف قلوب في DPBS مرة أخرى.
- إزالة الأذينين وبالطوق الأذينية البطينية من قلوب (هذه الهياكل تحتوي على خلايا تشبه الخلايا الصباغية) ووضع عينات الأنسجة رفعه في صحن 35 ملم.
- قطع قلوب الى قطع صغيرة باستخدام مقص منحني القوة وملاحظة ثم قم بإضافة 6-8 مل من 0.5٪ محلول التربسين إلى الطبق. ثم احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
- الآن، اتبع الخطوات من الإجراء أعلاه بدءا من الخطوة 3.6 وما بعده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول الموضحة في هذه المقالة هي تقنية محسنة مقارنة مع واحد ونحن سبق نشرها لعزل الخلايا الصباغية القلب من القلب الفئران. يستخدم هذا الإجراء استخدام علامات الفلورسنت يقودها الميلانين انزيم معين لجنة المساواة العرقية-recombinase لتسمية خلايا تشبه الخلايا الصباغية القلب. من المهم استخدام علامة لتسمية الخلايا الصباغية القلب عند العمل مع الخلايا الجنينية أو الوليدية المعزولة حديثا، منذ الاختلافات الشكلية التي تميز الخلايا الصباغية من myocytes القلب الأذيني لم تتطور بعد (الشكل 1A). كما هو مبين في الشكل 1A عندما ذهبت خطوة العزلة جيدا، فإن عددا كبيرا نسبيا من myocytes القلب الأذيني والخلايا الصباغية التمسك طبق laminin المغلفة مع عدد قليل من الخلايا غير ملتصقة. في هذه الحالة سوف تظهر الخلايا الملتصقة شقة على الجزء السفلي من الطبق (النصال الصفراء الشكل 1A، رأس السهم). من ناحية أخرى، عندما اإلجراءاتdure لا يعمل بشكل جيد معظم الخلايا سوف تكون غير ملتصقة وغالبا ما تبدو كروية وجمعوا (السهام الزرقاء الخفيفة، الشكل 1A).
عندما يتم تصور الخلايا المعزولة باستخدام التصوير مضان أخضر، فمن الواضح أي الخلايا هي الخلايا الصباغية القلب والخلايا التي توجد myocytes الأذيني (الشكل 1). كما هو مذكور أعلاه في بروتوكول (الخطوة 3.9)، تتم إزالة الخلايا الليفية من تجمع الخلايا المعزولة باستخدام الأذيني انخفاض قوة الطرد المركزي التي بيليه في myocytes الأذيني في القلب أكبر والخلايا الصباغية، ولكن لا اسقاط الليفية القلب أصغر. يمكن الآن استخدام الخلايا المعزولة حديثا لخلية واحدة التسجيلات الكهربية (الشكل 2)، واحد تحليل RNA الخلية أو فحوصات البيوكيميائية.
لدينا أيضا من الثقافة والمحافظة على الخلايا الجنينية أو حديثي الولادة الأذيني المعزولة باستخدام هذا البروتوكول لمدة تصل إلى 21 يوما. باستخدام الشروط الموضحة في هذه الثقافةبروتوكول، فإن خلايا تشبه الخلايا الصباغية القلب مزيد من التفريق وتتكاثر، في حين تميل myocytes الأذيني لفصل من الطبق ووفاته في غضون 2-3 أيام بعد أن يتم عزل. هو مبين في الشكل 3A هي الخلايا الصباغية القلب صحية بعد 5 أيام كانوا عزل من قلب الفأر حديثي الولادة. لاحظ عدم وجود أي myocytes الأذيني حول هذه الخلايا (على العكس من الخلايا المعزولة حديثا هو مبين في الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، وضعت هذه الخلايا الصباغية عمليات القلب شجيري واسعة وتشبه الخلايا الصباغية الجلدية التي كانت أيضا في الثقافة لنفس عدد الأيام (الشكل 3B).
الرقم 1. الممثل (A) DIC و (B) صور GFP من طازجة طخلايا الأذيني solated من الجنينية (E19.5) DCT-Z / EG الماوس الجرو. السهم الأبيض يحدد الصباغية القلب في كلا الفريقين. لاحظ أنه بدون مساعدة من علامة فلوري، والخلايا الصباغية القلب من الصعب تحديد وتمييز من myocytes الأذيني (النصال الصفراء) التي تعلق على طبق. وتشير النصال الضوء الأزرق إلى خلايا الأذيني التي لم تعلق جيدا إلى الطبق.
الشكل 2. محول جيب التمام - / - الخلايا الصباغية القلب تثبت العمل لفترات طويلة المدة المحتملة. تسجيلات المشبك الحالية من (A) محول جيب التمام القلب +/- و (B) محول جيب التمام القلب - / - خلايا تبرهن زيادة مدة العمل المحتملة في حالة عدم وجود محول جيب التمام. يستريح المحتملة للخلية محول جيب التمام هي +/- -62 بالسيارات، في حين أن محول جيب التمام - / - خلية لديها إمكانات يستريح-60 بالسيارات. مستنسخة، بإذن، من ليفين وآخرون. J. كلين. استثمار. 119، 2920-2936 (2009).
الرقم 3. صور الممثل معزولة (A) خلايا تشبه الخلايا الصباغية القلب و(B) الخلايا الصباغية الجلدية. تم عزل الخلايا الصباغية من قلوب والجلد من الفئران حديثي الولادة (P1) على التوالي، ومن ثم تربيتها لمدة 5 أيام.
الرقم 4. خلايا DCT-معربا عن تسكين القلب. (A) في الموقع التهجين من قلب E13.5 الماوس يظهر محول جيب التمام التعبير(السهام شغل) حول الوريد الرئوي نظام التشغيل (رأس السهم مفتوح). (B) مناعي تلطيخ الخلايا DCT-الإيجابية (السهام) داخل الأوردة الرئوية. (C) X-غال تلطيخ الخلايا DCT-الإيجابية في الأذين الخلفي من e16.5 الماوس DCT-LacZ القلب (السهام). (D) X-غال تلطيخ في E17.5 DCT-LacZ قلب فأر على طول الحاجز RA في مناطق الثقبة البيضوية، التاجي نظام التشغيل الجيوب الأنفية والوريد الأجوف السفلي. أقحم النطاق = 500 ميكرومتر. (E) الماوس الكبار (P60) الناتجة عن عبور DctCre +/- وR26R الماوس يوضح خلايا إيجابية LacZ (الأسهم) داخل الأوردة الرئوية والأذين الأيسر. خلايا (F) DCT-إيجابية الكشف عنها بواسطة تلطيخ مناعي (الأسهم) على البطانة من الوريد الرئوي البشري ازالتها جراحيا. النطاق = 500 ميكرومتر في كل اللوحات باستثناء لوحات (B و D، على نطاق و= 100 ميكرون) ولوحة (F، على نطاق و= 50 ميكرون). الاختصارات: PV، الوريد الرئوي. LA، الأذين الأيسر. آو، الشريان الأورطي. PA، pulmoالشريان نارى. RA، الأذين الأيمن. IVC، الوريد الأجوف السفلي. FO، الثقبة البيضوية. CS، الجيب التاجي. مستنسخة، بإذن، من ليفين وآخرون. J. كلين. استثمار. 119، 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الصباغية القلب موجودة في مواقع التشريحية داخل القلب التي تعطي عادة يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني المشغلات. وتشمل هذه المناطق الأوردة الرئوية، وبالطوق الأذينية البطينية، والأذين الأيسر الخلفي والثقبة البيضوية (الشكل 4). لفهم الدور الذي تقوم به هذه الخلايا في arrhythmogenesis، ونحن نطور التقنيات لعزلهم ودراسة علم وظائف الأعضاء. ومع ذلك، أدركنا أن تحسين هذه التقنية لانتاج كميات من شأنه صحة وأكبر من الخلايا الصباغية القلب تسمح مزيد من الدراسات للتحقيق في استجابة الخلايا الصباغية القلب للمؤثرات الخارجية. وعلاوة على ذلك، قد تحسنت تقنيات عزل تسمح أيضا دراسات للتحقيق التفاعل بين الخلايا الصباغية القلب الأذيني مع myocytes خلال علم وظائف الأعضاء والمرض العادي.
وتصف هذه الورقة إجراء لعزل خلايا تشبه الخلايا الصباغية قابلة للحياة من القلب الماوس التي قمنا بتطويرها من بروتوكولات تهدف إلى ISOLأكل الخلايا الصباغية من الجلد. في خطوة حاسمة في هذا البروتوكول واستخراج خلايا تشبه الخلايا الصباغية من القلب. وعزل الخلايا الصباغية القلب من قلوب الأطفال حديثي الولادة هو نسبيا على التوالي إلى الأمام، واستخراج الخلايا الصباغية القلب من القلب نضجا وأكثر صعوبة بسبب زيادة كمية التليف الخلالي. في هذا البروتوكول كنا التربسين الهضم لاستخراج خلايا تشبه الخلايا الصباغية من القلب ناضجة. لتطوير هذا البروتوكول اختبرنا عدة مجموعات الأنزيمية المختلفة التي تتكون من تركيزات مختلفة من التربسين، كولاجيناز، وdispase.
وجدنا أن علاج الأطفال حديثي الولادة الأذينين مع مزيج من كولاجيناز (لأول 30 دقيقة)، يليه التربسين (لمدة 15 دقيقة القادم) أنتجت في البداية عائدات أعلى من خلايا تشبه الخلايا الصباغية، ولكن كانت الخلايا المعزولة أقل صحية مع تناقص الجدوى. من ناحية أخرى، والهضم مع التربسين وحدها تنتج عددا متوسطا من الخلايا مثل الخلايا الصباغية صحية من مقلوب ature الماوس. ولذلك، فإننا نوصي فقط باستخدام التربسين لعزل خلايا تشبه الخلايا الصباغية من قلوب الفئران الناضجة. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن الطحن بقوة الطين تنتج بعد الهضم التربسين القلوب الماوس ناضجة تحسين العائد من خلايا تشبه الخلايا الصباغية قابلة للحياة. يجب أن نذكر أن التربسين لديه القدرة على هضم جزئيا قنوات الغشاء أو حاملات الشحنة، وهذا قد يؤثر على كثافة قناة عند تنفيذ الدراسات المشبك التصحيح. في حين أننا لم تنفذ تحليل دقيق لتحديد ما إذا التربسين الهضم يؤثر على الكثافة الحالية للخلايا تشبه الخلايا الصباغية معزولة، ناضجة نحن لم ألحظ أي آثار كبيرة على التيارات أو إمكانات العمل في دراسات قمنا تنفيذها باستخدام هذا البروتوكول.
خلايا تشبه الخلايا الصباغية القلب هي خلية السكان متفرق جدا في القلب (أقل من 0.1٪ من مجموع خلايا الأذيني) تشبه شكليا الخلايا الصباغية الجلدية (الشكل 1 والشكل 3 </ قوي>). يرجع ذلك إلى حقيقة أن هناك عدد قليل نسبيا من الخلايا الصباغية القلب موجودة في القلب؛ حتى وقت قريب كنا فقط قادرة على استخدامها لفحوصات وحيدة الخلية (أي تسجيل التصحيح لقط واحدة أو خلايا PCR). ومع ذلك، لقد حصلنا على كميات أكبر من الخلايا الصباغية القلب عن طريق تجميع 20-30 حديثي الولادة، أو 5-8 قلوب ناضجة، ووجد هذا النهج تنتج كمية كافية من الأنسجة لأداء طخة مناعية أو فحوصات البيوكيميائية. وعلاوة على ذلك، نظرا لانخفاض عدد خلايا تشبه الخلايا الصباغية في قلب الفئران، لتحسين العائد من هذه الخلايا بعد أن تم عزلها ونحن غالبا ما تضع 15-20 ملم دائري، تفلون يدرج على أطباق 35 ملم باستخدام تعقيمها الشحوم فراغ . ومن ثم يمكن وضع الخلايا داخل إدراج للحد من منطقة الطلاء ويزيد من كثافتها. استخدام تفلون يدرج أيضا يحسن من قابلية خلايا تشبه الخلايا الصباغية التالية عزلتهم وخلال الفترة الطلاء كذلك.
بعض ميلانو القلبخلايا شبيهة cyte لها القطبين العزلة التشكل التالية، التي نعتقد يمثل دولة أقل متباينة من هذه الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن زراعة الخلايا الصباغية القلب لمدة 3 أيام التالية العزلة يبدو للحث على مزيد من التفريق بين النمط الظاهري تشبه الخلايا الصباغية حيث تبدأ الخلايا لتشكيل التشعبات. لقد وجدنا أيضا هذا البروتوكول ينتج خلايا تشبه الخلايا الصباغية من قلوب الناضجة التي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 10 يوما في الثقافة. ومع ذلك، وراء 10 يوما في الثقافة خلايا تشبه الخلايا الصباغية المعزولة من قلوب ناضجة سوف تتوقف المتكاثرة ويمكن أن تصبح هرمة. ويمكن استخدام الخلايا الصباغية القلب معزولة ومطلي لتحليل الكهربية الخلوية أو غيرها / التحليل البيولوجي الجزيئية الخلوية، مثل التنميط RNA أو دراسات لتقييم ردودهم الفسيولوجية لعوامل خارجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL105734 إلى VVPMDL ويدعم، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للبحوث الصحية الوظيفي جائزة K08 HL094748. VVP هو باحث المبتكر من جمعية القلب الأميركية بدعم من منحة 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
