Summary
I denne protokol, w e identificeret en ny population af melanocytstimulerende lignende celler (også kendt som kardiale melanocytter) i hjerterne på mus og mennesker, der bidrager til atriearytmien udløser i mus.
Abstract
Vi identificerede en ny population af melanocytstimulerende lignende celler (også kendt som kardiale melanocytter) i hjerterne på mus og mennesker, der bidrager til atriearytmien triggers i mus. For at undersøge de elektriske og biologiske egenskaber kardiologiske melanocytter vi udviklet en procedure for at isolere dem fra mus hjerter, vi stammer fra dem, designet til at isolere neonatale murine kardiomyocytter. For at opnå sundere kardiale melanocytter er egnede til mere omfattende patch clamp eller biokemiske undersøgelser, har vi udviklet en raffineret fremgangsmåde til isolering og forkromning kardiale melanocytter baseret på dem, der oprindeligt designet til at isolere kutane melanocytter. Den raffinerede procedure påvises i denne anmeldelse og producerer større mængder af sunde melanocytstimulerende-lignende celler, som kan være belagt som en ren population eller med kardiomyocytter.
Introduction
Vi har for nylig identificeret en ny celle population i hjertet af mus og mennesker, der udtrykker melanin syntese enzymer og morfologisk ligner kutane melanocytter. Vi kaldes disse cellers kardiale melanocytter 'og fundet de er til stede i anatomiske steder, hvorfra atriearytmien udløser ofte oprindelse i mennesker. Vi fandt også kardiologiske melanocytter bidrage til atrial arytmi i mus med germlinie sletning af DCT. Hjerte melanocytter er tyndt fordelt i hele musen atrium, hvor de omfatter mindre end 0,1% af alle atrielle celler. For at undersøge de elektriske og biologiske egenskaber kardiologiske melanocytter vi udviklet en procedure for at isolere dem fra muse-hjerte ved hjælp af Cre-inducerbare melanocytstimulerende specifikke markører. Vores indledende procedure blev udviklet fra dem, der anvendes til at isolere neonatale murine cardiomyocytter og gav meget lille antal celler, der er egnede til patch clamp optagelser eller PCR-analyse. For at forbedre helbredeth og levedygtighed af hjerte melanocytter, for mere dybtgående elektrofysiologiske analyser eller biokemiske undersøgelser, har vi udviklet en raffineret procedure fra dem, designet til at isolere kutane melanocytter. Den beskrevne og demonstreret i denne anmeldelse fremgangsmåde har den fordel at producere sundere kardielle melanocytter, der kan være belagt som en ren population eller med kardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af de nødvendige løsninger og udstyr
- Først sterilisere kirurgiske instrumenter (lige form pincet, buet form pincet, lige form saks, og buede form saks) ved autoklavering dem i 15 min. ved 121 ° C. Forbered 2 sæt instrumenter, hvor det ene sæt bruges til at dissekere ud hjerter og det andet sæt vil blive brugt til hakning op vævet.
- Opløs 1 pakke MCDB153 kulturmedier i 900 ml steriliseret, filtreret vand og omrøres langsomt, indtil pulveret er opløst. Tilsæt 1,2 g natriumbicarbonat, eller 15,7 ml natriumbicarbonatopløsning [7,5% vægt / volumen] for hver liter slutrumfang medium forberedes, og der omrøres indtil opløsning. PH justeres til 7,2 ved tilsætning af enten 1 N HCI eller 1 N NaOH, så hæld mediet gennem et 0,2 um flaske top filter under sterile forhold i en vævskultur hætte (biosikkerhed kabinet). Derefter indsamle medierne og opbevare det ved 4 ° C.
- Forbered tillæggene tilføje til dyrkningsmediet (Materialer List). Kosttilskud bør sættes til mediet lige før mediet er nødvendige for udpladning af cellerne.
- Forbered DPBS med 10% FBS plus antibiotika (penicillin og streptomycin).
- Herefter skal du forberede en 0,25% trypsin ved tilsætning af 0,25 g trypsin (Kvæg bugspytkirtel, aktivitet> 2.500 USP enheder / mg, ultrarent, USB) til 100 ml DPBS plus antibiotika (penicillin og streptomycin).
- Andre nødvendige udstyr til at udføre denne procedure omfatter et stereomikroskop, Petri-skåle (10 cm), 50 ml koniske rør, 40-um celle harper, DPBS plus antibiotika, 60 mm dyrkningsskåle og 35 mm dyrkningsskåle.
2. Isolering hjerter fra neonatale museunger
- Først få P0 til P2 neonatal museunger (n = 6 til 8). Det anbefales at bruge unger genereret af ynglende DCT-Cre homozygote kvinder med mænd, der er heterozygote for enten R26R: EYFP allel eller Z / EG allel til at mærkemelanocyt-lignende celler. Både R26R: EYFP og Z / EG-mus er tilgængelige fra Jackson Laboratories (varenumre 006.148 og 003.920, henholdsvis).
- Dernæst aflive den neonatale museunger, tørre deres kister med en spritserviet, og derefter placere hvalpene i en 10 cm petriskål med DPBS.
- Skær huden over brystet og brystbenet med steriliseret pincet og saks og derefter åbne brystet forsigtigt under et stereomikroskop. Hjerter af neonatale museunger er meget lille, så vær omhyggelig med at sørge for at fjerne hele hjerte med forkamre vedlagt.
- Vask hjerter i DPBS og overføre dem til et nyt 10-cm petriskål.
3. enzymatisk nedbrydning
- Bring Petri-skål med udskårne hjerter til en vævskultur hætte (biosikkerhed kabinet), og følg derefter nedenstående trin ved hjælp af sterile teknikker i hætten.
- Først vaskes hjerter tre gange i sterile DPBS plus antibiotika.
- Placer hjerter (n = 6-8) i en60 mm dyrkningsskål og tilføje 6-8 ml 0,5% trypsin-opløsning i skålen.
- Dernæst skæres hjerterne i små stykker (mindre end 1 mm i størrelse) og inkubere dem ved 37 ° C i 30 minutter i en 5% CO2-atmosfære.
- Efter inkubationstiden er afsluttet, hældes den resulterende opløsning af hjertevæv og trypsin fra fadet ind i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Så ved hjælp af en 10-ml steril pipette, hurtigt, men forsigtigt, udriv opløsningen i 50 ml konisk rør 30-50 gange.
- Filtrer den resulterende opløsning gennem en 40 um cellefilter på toppen af en ny, ren 50 ml konisk rør til opsamling af filtratet.
- Dernæst centrifugeres 50 ml rør ved 240 x g i en table-top centrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter forsigtigt aspireres supernatanten og resuspender resterende pellet i 6-8 ml sterile DPBS. Gentag dette trin 2 gange mere. Dette trin træpiller atriale myocytter og kardielle melanocytter, men ikke bringe ned fibroblasts siden fibroblasterne er mindre og vil forblive i supernatanten.
4. Belægning Cardiac Melanocyte-lignende celler
- Efter den tredje skylning efter centrifugering, omhyggeligt afløb eller aspireres fra vaskeopløsningen (DPBS), og pellet resuspenderes i 6 ml MCDB dyrkningsmedier som kosttilskud er blevet tilføjet.
- Nu trækker den resuspenderede opløsning i en steril overførsel pipette og placere celler i en 35 mm skål eller i en brønd i en 6-brønds plade, og samle de isolerede hjerteceller fra 3 neonatale mus i en 35 mm skål eller godt.
- Inkuber retterne natten over ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære, aspireres fra dyrkningsmediet sammen med eventuelle ubundne celler og skyl pladerne gang med DPBS. Derefter tilsættes frisk medium til pladerne og erstatte medierne hver 2 dage. Celler isoleret fra neonatale eller embryonale hjerter kan opretholdes i kultur i op til 3 uger, mens celler isoleret fra voksne hørets kan opretholdes i kultur i op til 10 dage.
5. Isolering Cardiac melanocytstimulerende lignende celler fra voksne mus Heart
- Først skal du fjerne hjerter fra modne mus (3-4 uger gamle, n = 3) gennem en mid-line sternotomi efter administration heparin 100 E intraperitoneal til musene, og derefter euthanizing dem. Det anbefales at anvende pentobarbital aflive mus til denne procedure, men dette stof er ikke tilgængelig i alle områder.
- Dernæst vaskes udskårne hjerter i sterile DPBS indeholdende antibiotika i en vævskultur hætte (biosikkerhed kabinet). Klem hjerterne lidt med buede Dissecting pincet til at fjerne eventuelle rester af blod fra dem, og skyl derefter hjerter i DPBS én mere tid.
- Fjern forkamre og atrioventrikulær annulus fra hjerter (disse strukturer indeholder melanocytstimulerende lignende celler) og placere udskårne vævsprøver i en 35 mm skål.
- Skær hjerterne i små stykker ved hjælp af krum saks og kraftps og derefter tilføje 6-8 ml 0,5% trypsin løsning til fadet. Derefter inkuberes retter ved 37 ° C i 45-60 min.
- Nu skal du følge trinene fra ovenstående procedure fra trin 3.6 og fremefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrevet i denne artikel protokol er en forbedret teknik i forhold til den, vi tidligere offentliggjorte til isolering kardiale melanocytter fra den murine hjerte. Denne procedure anvender brugen af fluorescerende markører drevet af melanin syntese enzym-specifik Cre-rekombinase at mærke kardiale melanocyt-lignende celler. Det er vigtigt at bruge en markør til at mærke kardiale melanocytter, når der arbejdes med frisk isolerede embryoner eller neonatale celler, idet de morfologiske forskelle, der adskiller kardiale melanocytter fra atriale myocytter endnu ikke har udviklet (figur 1A). Som vist i figur 1A, når isolation skridt er gået godt, vil et ret stort antal atrielle myocytter og kardielle melanocytter holde sig til laminin belagt skål med blot nogle få ikke-klæbende celler. I dette tilfælde adhærente celler vises fladt på bunden af skålen (gule pilespidser figur 1A, pilespids). På den anden side, når procedure fungerer ikke godt de fleste af cellerne vil være ikke-klæbende og ofte ser sfæriske og rundes op (lyseblå pilespidser, figur 1a).
Når de isolerede celler visualiseret under anvendelse af grøn fluorescens billeddannelse, er det klart, hvilke celler er kardiale melanocytter og hvilke celler er atriale myocytter (figur 1). Som nævnt ovenfor i protokollen (trin 3.9), bliver fibroblasterne fjernes fra puljen af isolerede atriale celler ved hjælp af lav-force centrifugering som pellets de større atriale myocytter og kardielle melanocytter, men ikke bringe ned de mindre kardiale fibroblaster. De frisk isolerede celler kan nu anvendes til enkelt celle elektrofysiologiske optagelser (Figur 2), enkelt celle RNA-analyse eller biokemiske assays.
Vi har også dyrket og vedligeholdt isolerede neonatale eller embryonale atriale celler ved hjælp af denne protokol i op til 21 dage. Brug af dyrkningsbetingelser beskrevet i denneprotokol vil de kardielle melanocytstimulerende lignende celler yderligere differentiering og formere sig, mens den atrielle myocytterne tendens til at løsne sig fra skålen og dør inden for 2-3 dage efter, at de er isolerede. Vist i figur 3A er sunde kardiale melanocytter 5 dage efter de blev isoleret fra en neonatal mus hjerte. Bemærk manglen på atriale myocytter i disse celler (i modsætning til de frisk isolerede celler er vist i figur 1). Desuden har disse kardiale melanocytter udviklet omfattende dendritiske processer og ligner kutane melanocytter, der også har været i kultur i det samme antal dage (figur 3B).
Figur 1. repræsentant (A) DIC og (B) GFP-billeder af frisk jegsolated atrial celler fra et embryo (E19.5) DCT-Z / EG mus pup. Den hvide pil identificerer hjertets melanocyt i begge paneler. Bemærk, at uden hjælp af den fluorescerende markør, er vanskeligt at identificere og skelne fra den atriale myocytter (gule pilespidser), der er knyttet til skålen hjertets melanocyt. De lyseblå pilespidser peger på atriale celler, der ikke er godt fastgjort til fadet.
Figur 2. DCT - / - kardiale melanocytter demonstrere forlænget virkning potentiel varighed. Strømtang optagelser fra (A) hjertestop DCT +/- og (B) hjertestop DCT - / - celler som viser øget aktionspotentialets varighed i fravær af DCT. Resting potentiale DCT +/- cellen er -62 mV, medens DCT - / - celler har et hvilende potentiale-60 MV. Gengivet med tilladelse fra Levin et al. J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Figur 3. Repræsentative billeder af isolerede (A) Hjerte melanocytstimulerende lignende celler og (B) kutane melanocytter. Melanocytter blev isoleret fra hjerte og hud neonatale mus (P1), henholdsvis, og derefter dyrket i 5 dage.
Figur 4. DCT-udtrykkende celler udfylde hjertet. (A) In situ hybridisering af en E13.5 mus hjerte viser DCT udtryk(fyldte pile) i lungevenen OS (åben pilespids). (B) immunfluorescensfarvning af DCT-positive celler (pilespidser) i lungevenerne. (C) X-gal-farvning af DCT-positive celler i den bageste atrium en E16.5 mus DCT-LacZ-hjerte (pile). (D) X-gal-farvning i en e17.5 DCT-LacZ-mus hjerte langs RA septum regionerne foramen ovale, koronar sinus OS og inferior vena cava; indsatte skala = 500 um. (E) Voksen mus (P60) som følge af at krydse en DctCre +/- og R26R mus demonstrerer LacZ positive celler (pile) inden for de pulmonale vener og venstre forkammer. (F) DCT-positive celler påvist ved immunfluorescensfarvning (pile) på endotel i et kirurgisk fjernet menneskelig lungevene. Scale = 500 um i alle paneler, undtagen plader (B og D, skala = 100 um) og panel (F; skala = 50 um). Forkortelser: PV, lungevene; LA, venstre atrium; Ao, aorta; PA, Pulmomindeligt arterie; RA, højre atrium; IVC, vena cava inferior; FO, foramen ovale; CS, koronar sinus. Gengivet med tilladelse fra Levin et al. J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerte melanocytter er til stede i anatomiske steder i hjertet, der almindeligvis giver anledning til atriearytmien udløsere. Disse regioner omfatter lungevenerne, atrioventrikulær ringformede, bageste venstre forkammer og foramen ovale (figur 4). For at forstå den rolle, disse celler spiller i arrhythmogenesis udvikler vi teknikker til at isolere dem og studere deres fysiologi. Vi erkendte dog, at forbedring af denne teknik til at give sundere og større mængder af kardiologiske melanocytter ville tillade yderligere studier for at undersøge svar af hjerte melanocytter for udefrakommende stimuli. Desuden kan forbedrede isoleringsteknikker tillader også studier for at undersøge interaktionen af hjerte melanocytter med atrielle myocytes under normal fysiologi og sygdom.
Dette papir beskriver en fremgangsmåde til isolering af levedygtige melanocytstimulerende lignende celler fra muse-hjerte, at vi har udviklet fra protokoller designet til at isolspiste melanocytter fra huden. Den kritiske skridt i denne protokol er at udvinde melanocyt-lignende celler fra hjertet. Mens isolering hjertepatienter melanocytter fra neonatale hjerter er forholdsvis ligetil, udvinding kardiale melanocytter fra modne hjerte er langt mere vanskelig på grund af den øgede mængde af interstitiel fibrose. I denne protokol, der bruges vi trypsinfordøjelse at udtrække melanocytstimulerende lignende celler fra den modne hjerte. At udvikle denne protokol testede vi flere forskellige enzymatiske kombinationer, der bestod af forskellige koncentrationer af trypsin, collagenase og dispase.
Vi fandt, at behandling af neonatale atrier med en blanding af kollagenase (de første 30 minutter) efterfulgt af trypsin (for de næste 15 minutter) oprindeligt produceret højere udbytter af melanocyt-lignende celler, men de isolerede celler var mindre sunde med nedsat levedygtighed. På den anden side, fordøjelse med trypsin alene gav et moderat antal raske melanocyt-lignende celler fra mratur mus hjerter. Derfor anbefaler vi kun at bruge trypsin at isolere melanocytstimulerende lignende celler fra modne murine hjerter. Endvidere fandt vi, at kraftigt triturering opslæmningen fremstillet efter trypsinfordøjelse af modne muse hjerter forbedret udbytte af levedygtige melanocyt-lignende celler. Vi bør nævne, at trypsin har potentiale til delvis fordøje membran kanaler eller ladningsbærere, og dette kan påvirke kanaltætheden når du udfører patch clamp-forsøg. Selvom vi ikke har foretaget en grundig analyse for at afgøre, om trypsinfordøjelse påvirker strømtæthed af isolerede, modne melanocytstimulerende lignende celler har vi ikke bemærket nogen signifikante virkninger på strøm eller virkningspotentialer i undersøgelserne, vi har udført ved hjælp af denne protokol.
Hjertesygdomme melanocytstimulerende lignende celler er en meget sparsomme cellepopulation i hjertet (mindre end 0,1% af alle atrielle celler), der morfologisk ligner kutane melanocytter (figur 1 og figur 3 </ Strong>). På grund af det faktum, at der er relativt få kardiale melanocytter til stede i hjertet; indtil for nylig har vi kun været i stand til at bruge dem til encellede assays (dvs. patch fastspænding optagelse eller enkelt-celle PCR). Men vi har fået større mængder af hjertepatienter melanocytter ved at samle 20-30 neonatale eller 5-8 modne hjerter, og fandt denne fremgangsmåde producerer en tilstrækkelig mængde væv til udførelse immunblot eller biokemiske analyser. I betragtning af det lave antal melanocytstimulerende lignende celler i den murine hjerte, at forbedre udbyttet af disse celler, efter at de er blevet isoleret, vil vi ofte sætte 15-20 mm cirkulær, Teflon indsætter på 35 mm retter med steriliseret vakuum fedt . Cellerne kan derefter placeres inden for de indsatser for at reducere klædningen område og øger deres densitet. Brug teflon indsætter også forbedrer levedygtigheden af melanocytstimulerende lignende celler efter deres isolation og under klædningen periode samt.
Nogle kardiel melanoCyte-lignende celler har en bipolær morfologi efter isolering, som vi mener repræsenterer en mindre differentieret tilstand af disse celler. Endvidere fandt vi, at dyrkning af kardiale melanocytter til 3 dage efter isolering synes at inducere yderligere differentiering af melanocyt-lignende fænotype, hvor cellerne begynder at danne dendritter. Vi har også fundet denne protokol giver melanocytstimulerende lignende celler fra modne hjerter, som kan opretholdes i op til 10 dage i kultur. Men ud over 10 dage i kultur melanocyt-lignende celler isoleret fra modne hjerter vil stoppe prolifererende og kan blive senescent. Isolerede og belagte kardiale melanocytter kan anvendes til cellulær elektrofysiologiske analyser eller anden molekylær / cellulær biologisk analyse, såsom RNA-profilering eller undersøgelser for at vurdere deres fysiologiske reaktioner på udefra kommende faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health award R01 HL105734 til VVPMDL understøttes delvist af National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP er en innovativ forsker i American Heart Association støttet af tilskud 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
