Summary
이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.
Abstract
우리는 생쥐에서 심방 부정맥 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 우리가 신생아 쥐의 심근 세포를 분리하기 위해 설계된로부터 유도 된 마우스의 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 더 광범위한 패치 클램프 또는 생화학 적 연구에 적합한 건강 심장 멜라노를 얻기 위해, 우리는 단리 및 원래 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된 이들에 기초하여 심장 멜라노 도금을위한 정제 과정을 개발 하였다. 정제 과정이 리뷰에서 설명하고 순수한 인구 또는 심근으로 도금 할 수있다 건강한 멜라닌 세포와 같은 세포의 큰 숫자를 생산하고있다.
Introduction
우리는 최근 멜라닌 합성 효소를 표현하고 형태 학적으로 피부 멜라닌 세포를 닮은 쥐와 인간의 심장에 새로운 세포 인구를 확인했다. 우리는이 세포의 멜라닌 세포를 심장 '이라고하고 심방 부정맥은 종종 인간에서 발생 트리거되는 해부학 적 위치에 있습니다 발견했다. 우리는 또한 심장 멜라닌 세포는 DCT의 생식 세포 삭제와 생쥐에서 심방 부정맥에 기여했습니다. 심장 멜라노가 띄엄 그들은 모두 심방 세포의 0.1 % 미만을 포함 할 마우스 심방에 걸쳐 분산된다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 Cre 호텔 유도 멜라닌 세포 특정 마커를 사용하여 마우스 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 당초 절차는 신생아 쥐의 심근 및 패치 클램프 기록 또는 PCR 분석에 적합한 세포의 수득 매우 작은 수를 분리하기 위해 사용되는 것들로부터 개발되었다. 그러나, 치료를 개선하기 위해일 및 전기 생리 분석 또는 생화학 적 연구에 대한 심층적 인 이상 심장 멜라닌 세포의 생존, 우리는 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된에서 정제 과정을 개발했다. 이 리뷰에서 설명하고 입증 절차는 순수한 인구 또는 심근으로 도금 될 수 건강한 심장 멜라닌을 생산하는 장점이있다.
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Protocol
1 필요한 솔루션 및 장비 준비
- 첫째, 15 분간 고압 증기 멸균을하여 수술기구 (직선 모양 집게, 곡선 모양 집게, 직선 모양 가위, 곡선 모양의 가위) 소독. 121 ° C에서. 조직을 닦지에 사용되는 하나의 세트가 마음과 다른 세트를 해부에 사용되는 악기, 2 세트를 준비합니다.
- 살균, 여과 물 900 ㎖에 MCDB153 문화 미디어의 한 패킷을 녹이고 분말이 용해 될 때까지 천천히 저어. 1.2 g의 중탄산 나트륨, 또는 15.7 ml의 나트륨 바이 카보네이트 용액, 배지의 최종 부피의 각각의 리터를 준비하고 용해 될 때까지 교반중인 [V / w 7.5 %]를 추가한다. 다음 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 무균 조건 하에서 0.2 μm의 병 상단 필터를 통해 미디어를 부어, 1 N 염산 또는 1 N의 NaOH를 추가하여 7.2으로 산도를 조정합니다. 그런 다음 미디어를 수집하고 4 ℃에서 보관하십시오.
- 보충제를 준비배양 배지 (자료 목록)에 추가합니다. 보충 미디어 세포 도금에 필요한 미디어 직전에 첨가한다.
- 10 % FBS 플러스 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)와 DPBS를 준비합니다.
- DPBS 플러스 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신) 100 ㎖에, 다음에, 0.25 g의 트립신 (USB 소의 췌장 활동> 2500 USP 단위 / ㎎, 초순수)을 첨가하여 0.25 % 트립신 용액을 제조 하였다.
- 이 절차를 완료하는 데 필요한 기타 필요한 장비는 입체 현미경, 페트리 접시 (10 cm), 50 ML 원뿔 튜브, 40 μm의 셀 스트레이너, DPBS 플러스 항생제, 60-mm 배양 접시 35-mm 배양 접시를 포함한다.
2 신생아 마우스 새끼들까지 잔치에서 하트의 분리
- 먼저, P2 신생아 마우스 새끼에 P0을 얻었다 (N = 6-8). EYFP 대립 유전자 또는 라벨을 붙이기 위해 Z / EG 대립 유전자 : 그것은 R26R 중 이형 아르 남성과 DCT-Cre 호텔에게 동형 접합 여성의 번식에 의해 생성 된 새끼를 사용하는 것이 좋습니다멜라닌 세포 유사 세포. 두 R26R는 : EYFP 및 Z / EG 마우스는 잭슨 연구소 (주식 수는 각각 006,148과 003,920)에서 사용할 수 있습니다.
- 다음으로, 신생아 마우스 새끼를 안락사 알코올 면봉으로 자신의 가슴을 닦아 낸 후 DPBS와 10 cm 페트리 접시에 새끼를 놓습니다.
- 가슴을 통해 피부를 잘라 소독 집게와 가위로 흉골 후 실체 현미경을 이용하여 조심스럽게 가슴을 엽니 다. 신생아 마우스 새끼의 마음이 부착 된 심방과 심장 전체를 제거해야합니다주의해야하므로 매우 작은 수 있습니다.
- DPBS에 마음을 씻고 새로운 10 cm 페트리 접시로 전송.
3 효소 소화
- 조직 문화 후드 (생물 안전 캐비닛)에 절제 마음 페트리 접시를 가져와 다음 후드에서 멸균 기술을 이용하여 아래의 단계를 따릅니다.
- 첫째, 무균 DPBS 플러스 항생제의 마음을 세 번 씻는다.
- 에서 (N = 6-8) 마음을 놓으십시오60 mm 배양 접시와 접시에 0.5 % 트립신 용액 6-8 ML을 추가합니다.
- 다음으로, (크기가 1 mm 이하) 작은 조각으로 마음을 절감하고 5 % CO 2 분위기에서 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품어.
- 잠복기가 완료된 후, 50 ㎖의 멸균 원추형 튜브에 심장 조직과 접시에서 트립신의 생성 된 용액을 붓는다.
- 그런 다음, 신속하게 조심스럽게 10 ml의 멸균 피펫을 사용하여 50-ML 원뿔 튜브 30 ~ 50 시간에서 솔루션을 씹다.
- 여액을 수집하고 새로운 깨끗한 50ml의 원뿔형 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 얻어진 용액을 필터.
- 이어서, 실온에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 240 × g에서 50 mL의 원심 분리 튜브. 그런 다음 조심스럽게 뜨는을 대기음 및 멸균 DPBS의 6-8 ㎖에 남아있는 펠렛을 재현 탁. 이 단계 2 번 더 반복합니다. 이 단계는 심방 근육 세포와 심장 멜라닌 세포를 펠렛하지만 소설을 미치지 않습니다섬유 아세포 이후 broblasts는 작은 상등액에 남아있게됩니다.
4 도금 심장 멜라닌 세포 유사 세포
- 신중하게 배출 또는 세척 용액 (DPBS)를 대기음 및 MCDB 문화 미디어 6 ML에서 펠렛을 재현 탁, 원심 분리 후 세번째 린스를 따라하는 것은 어떤 보충제가 추가되었습니다합니다.
- 이제, 멸균 전송 피펫으로 재 부유 솔루션을 그리고 35 mm 접시에 세포를 올려 놓거나, 6 웰 플레이트의 잘, 그리고 한 35-mm 접시에 세 신생아 쥐에서 분리 된 심장 세포를 풀거나 잘.
- , 5 % CO 2 분위기에서 하룻밤 37 ° C에서 요리를 품어 모든 부착되지 않은 세포와 함께 배양 배지를 흡인 한 후 DPBS 한 번 번호판을 씻어. 그런 다음 접시에 신선한 미디어를 추가하고 미디어마다 이일을 교체합니다. 세포는 성인 듣고에서 격리 반면 신생아 또는 배아 마음에서 고립 된 세포는 최대 3 주 동안 배양 유지 될 수있다TS는 최대 10 일 동안 배양 유지할 수있다.
성인 마우스의 심장에서 5 고립시키기 심장 멜라닌 세포와 같은 세포
- 첫째, 성숙 마우스의 마음 제거 (3-4 주령을, N = 3) 마우스에 헤파린 100 U의 복강 내 투여 한 다음를 안락사 후 중간 줄 흉골 절개를 통해. 그것은이 절차 쥐를 안락사하는 펜토 바르 비탈을 사용하는 것이 좋습니다,하지만이 약은 모든 지역에서 사용할 수 없습니다.
- 다음으로, 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 항생제를 포함하는 멸균 DPBS에 절제의 마음을 씻는다. 그들에 남아있는 혈액을 제거하고 DPBS에 한 번 더 마음을 씻어 곡선 해부 포셉 약간 마음을 짠다.
- 마음에서 심방과 방실 고리를 제거합니다 (이러한 구조는 멜라닌 세포 유사 세포를 포함) 및 35 mm 접시에 절제 조직 표본을 배치합니다.
- 곡선 가위와 힘을 사용하여 작은 조각으로 마음을 잘라추신 후 접시에 0.5 % 트립신 용액을 6-8 ML을 추가합니다. 그런 다음 45 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어.
- 이제, 이후 단계 3.6에서 시작하여 위의 프로 시저의 단계를 따릅니다.
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Representative Results
이 문서에서 설명하는 프로토콜은 우리가 이전에 쥐의 심장에서 심장 멜라닌 세포를 분리 출판 일에 비해 개선 된 기술이다. 이 절차는 심장 멜라닌 세포 유사 세포를 라벨 멜라닌 합성 효소 특이 치운다 재조합 효소에 의해 구동되는 형광 마커의 사용을 채택한다. 이 심방 근육 세포에서 심장 멜라닌 세포를 구별 형태 학적 차이는 아직 (그림 1A)을 개발하지 않았기 때문에, 갓 격리 된 배아 또는 신생아 세포 작업을 할 때 심장 멜라닌 세포에 라벨 마커를 사용하는 것이 중요합니다. 분리 단계는 잘 간 경우도 1a에 나타낸 바와 같이, 심방 심장 근세포 및 멜라노 사이트의 상당히 많은 수의 단지 몇 개의 비 - 부착 세포와 라미닌 코팅 접시에 부착된다. 이 경우, 부착 세포는 접시 (황색 화살촉도 1a, 화살촉)의 바닥에 평평하게 나타날 것이다. 한편, 경우 proce을틀리면 잘 작동하지 않는 세포의 대부분은 비 부착되며 종종 구형보고 (하늘색 화살촉, 그림 1A)를 반올림.
고립 셀 녹색 형광 이미징을 사용하여 시각화하면, 심근 세포 및 멜라닌이다 심방 근육 세포 (도 1)있는 어떤 세포 분명하다. (3.9 단계) 프로토콜에서 전술 한 바와 같이, 섬유 아세포 큰 심방 근세포 및 심장 멜라닌 세포를 펠렛하지만 작은 심장 섬유 아세포를 가져 오지 않는 저하 중 원심 분리를 이용하여 분리 심방 세포의 풀로부터 제거된다. 갓 고립 셀 해주기 단세포 전기 생리 학적 기록 (도 2), 단일 세포 RNA 분석이나 생화학 분석을 위해 사용될 수있다.
우리는 또한 배양이 최대 21 일 동안이 프로토콜을 사용하여 격리 된 신생아 또는 배아 심방 세포를 유지했다. 이 설명에서 배양 조건을 사용심방 근육 세포가 접시에서 분리하고 그들이 고립 된 후 2~3일 안에 사망하는 경향이있는 동안 프로토콜, 심장 멜라닌 세포와 같은 세포는 더욱 차별화하고 증식합니다. 그들은 신생아 마우스 마음에서 고립 된 오일 후 건강한 심장 멜라닌 세포는 그림 3a에있는 바와 같다. (도 1에 도시 된 절연 갓 세포와는 대조적으로)이 셀 주변에있는 심방 근육 세포의 부족을 참고. 또한, 이러한 심장 멜라노 광범위한 수지상 프로세스를 개발하고 또한 밀접 일 동일한 수 (도 3B)에 대한 배양왔다 피부 멜라닌 유사했다.
주제도 1 (A) 및 DIC (B) 갓 I의 GFP 이미지배아 (E19.5)에서 solated입니다 심방 세포 DCT-Z / EG 마우스 강아지. 흰색 화살표는 두 패널의 심장 멜라닌 세포를 식별합니다. 형광 마커의 도움없이, 심장 멜라노 식별하여 접시에 부착 심방 근육 세포 (노란색 화살촉)와 구별하기 어렵다 유의. 라이트 블루 화살촉 잘 접시에 부착되지 않은 심방 세포를 가리 킵니다.
그림 2 DCT는 - / - 심장 멜라닌 세포는 장기간의 활동 전위 기간을 보여줍니다. (A) 심장 DCT +/- 및 (B)에서 DCT 심장 전류 클램프 녹음 - / - 세포는 DCT의 부재 하에서 활동 전위 지속 시간을 증가 보여준다. - / - 세포 휴식 잠재력이 DCT는 DCT +/- 동안 셀의 휴식 전위는 -62를 MV-60 MV. 레빈 외로부터 허가를, 재현. J. Clin는. 투자. 119, 2920년부터 2936년까지 (2009).
격리도 3 (A)의 대표적인 이미지 심장 멜라닌 세포 유사 세포 및 (B) 피부 멜라닌 세포. 멜라닌 세포는 각각 마음과 신생아 마우스 (P1)의 피부에서 분리, 5 일 동안 배양 하였다.
그림 4 DCT-발현하는 세포는 마음을 채 웁니다. E13.5 마우스 심장의 현장 하이브리드 화에서 (A)는 DCT의 식을 보여줍니다폐정맥 운영 체제 (오픈 화살촉) 주위에 (채워진 화살표). 폐 혈관 내의 DCT-양성 세포 (화살촉)의 (B) 면역 염색. e16.5 마우스 DCT-LacZ를 심장 (화살표)의 후방 중앙 홀에서 DCT-양성 세포 (C) X-분은 염색. 난원 공 개존증, 관상 동 OS 및 하대 정맥의 지역에서 RA 중격 따라 E17.5 DCT-LacZ를 마우스 마음에 (D) X-분은 염색; 삽입 된 규모 = 500 μm의. DctCre +/- 및 R26R 마우스를 횡단으로 인한 (E) 성인 마우스 (P60)는 폐정맥과 좌심방 내에서 LacZ를 양성 세포 (화살표)를 보여줍니다. 수술로 제거 인간의 폐 혈관의 내피 세포에 대한 면역 형광 염색 (화살표)에 의해 검출 (F) DCT-양성 세포. 패널을 제외한 모든 패널에서 규모 = 500 μm의에게 (B와 D, 규모 = 100 μm의)와 패널 (F; 규모 = 50 μm의). 약어 : PV, 폐정맥; LA, 중앙 홀 왼쪽; 아오, 대동맥; PA, pulmo어림 동맥; RA, 우심방; IVC, 하대 정맥; FO, 난원 공 개존증; CS, 관상 동. 레빈 외로부터 허가를, 재현. J. Clin는. 투자. 119, 2920년부터 2936년까지 (2009).
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Discussion
심장 멜라닌 세포는 일반적으로 심방 부정맥 트리거를 야기 심장 내에서 해부학 적 위치에 있습니다. 이 지역은 폐 혈관, 방실 고리, 후방 좌심방과 난원 공 개존증 (그림 4)를 포함한다. 이러한 세포가 arrhythmogenesis에서의 역할을 이해하기 위해, 우리는 그들을 격리하고 그들의 생리학을 연구하는 기술을 개발한다. 그러나, 우리는이 기술을 개선하는 것은 심장 멜라닌 세포의 건강하고 더 많은 양의 외생 적 자극에 대한 심장 멜라닌 세포의 반응을 조사하기 위해 추가 연구를 허용 할 얻을 것을 인정했다. 또한, 개선 된 분리 기술은 정상적인 생리 질환 중 심방 심장 근육 세포와 멜라노 사이트의 상호 작용을 조사하는 연구를 허용 할 수있다.
이 논문은 우리가 ISOL하기위한 프로토콜에서 개발 된 마우스 마음에서 가능한 멜라닌 세포 유사 세포를 분리하는 절차를 설명합니다피부에서 멜라닌 세포를 먹었다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 마음에서 멜라닌 세포 유사 세포를 추출한다. 신생아 마음에서 심장 멜라닌 세포를 분리하는 동안 인해 간질 섬유화의 증가 된 양의 성숙한 마음에서 심장 멜라닌 세포를 추출, 상대적으로 곧장 앞으로 훨씬 더 큰 어려움이다. 이 프로토콜에서 우리는 성숙한 마음에서 멜라닌 세포 유사 세포를 추출하는 트립신 소화를 사용했다. 우리는 트립신, 콜라게나 제와 디스 파제의 다양한 농도로 구성되어 여러 가지 효소의 조합을 시험이 프로토콜을 개발한다.
우리는 트립신 (다음 15 분 동안) 하였다 (제 30 분간) 콜라게나 제의 조합으로 신생아 심방 처리하면 초기 멜라닌 세포 - 유사 세포의 높은 수율을 생산 것을 발견하지만, 절연 세포 생존율을 감소 덜 건강한이었다. 한편, 트립신으로 소화 단독 m에서 건강한 멜라닌 세포 - 유사 세포의 적당한 수를 생산아져 마우스 마음입니다. 따라서, 우리는 성숙한 쥐의 마음에서 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리하는 트립신을 사용하는 것이 좋습니다. 또, 적극적으로 성숙한 마우스 하트 트립신 분해 후에 생성 된 슬러리를 triturating 것이 가능한 멜라닌 유사 세포의 수율을 향상하였습니다. 우리는 트립신 부분적 멤브레인 채널 또는 전하 캐리어를 소화하는 잠재력을 가지고 언급해야 및 패치 클램프 실험을 수행 할 때 채널 밀도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 트립신 소화 고립 성숙한 멜라닌 세포와 같은 세포의 전류 밀도에 영향을 미치는지 확인하기 위해 엄격한 분석을 실시하지 않은 동안 우리는 우리가이 프로토콜을 사용하여 수행 한 연구에서 전류 또는 활동 전위에 상당한 효과를 발견하지 않았습니다.
심장 멜라닌 세포와 같은 세포는 형태 학적으로 피부 멜라닌 세포 (그림 1 및 그림 3을 <유사한 중심부에있는 매우 드문 드문 세포 인구 (심방 세포의 0.1 % 미만)이다/ strong>에서). 사실로 인해 심장에 존재하는 상대적으로 적은 심장 멜라닌 세포가있다; 최근까지 우리는 단일 세포 분석 (즉, 패치 클램핑 기록 또는 단일 셀 PCR)에 사용할 수있게되었습니다. 그러나 20-30 신생아, 또는 5-8 성숙한 마음을 풀링하여 심장 멜라닌 세포의 큰 수량을 수득하고,이 방법은 면역 또는 생화학 분석을 수행하기위한 조직의 충분한 양을 생산 발견 하였다. 이들은 우리가 흔히 15~20mm 원형 배치 할 격리 된 후에 또, 쥐 심장의 멜라닌 세포 - 유사 세포의 수가 적은 소정 테프론 멸균 진공 그리스를 사용하는 35-mm 접시에 삽입하고, 이들 세포의 수율을 향상시키기 . 세포는 그 다음 도금 면적을 줄이기 위해 인서트 내에 배치하고 그들의 밀도를 증가 할 수있다. 사용 테플론 또한 삽입 분리 그들의 다음뿐만 아니라 도금 기간 동안 멜라닌 세포 - 유사 세포의 생존 능력을 향상시킨다.
일부 심장 멜라노cyte 같은 세포는 우리가이 세포의 덜 분화 된 상태를 나타냅니다 생각 바이폴라 형태 다음 격리를 보유하고 있습니다. 또한, 우리는 다음의 분리 3 일간 심장 멜라노 배양하는 세포는 수상 돌기를 형성하기 시작 멜라노 같은 표현형의 추가 분화를 유도하는 것으로 보인다. 우리는 또한이 프로토콜 문화에서 최대 10 일 동안 유지 될 수 성숙한 마음에서 멜라닌 세포 유사 세포를 얻을 수 발견했다. 그러나, 증식 정지되고 노화 될 수 있습니다 성숙한 마음에서 고립 된 문화 멜라닌 세포와 같은 세포에서 십일 이상. 격리 및 도금 심장 멜라노 외인성 요인 그들의 생리적 반응을 평가하기 위해 이러한 RNA 또는 프로파일 링 연구로서, 셀룰러 전기 생리 학적 분석 또는 다른 분자 / 세포 생물학적 분석에 이용 될 수있다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 VVPMDL에 건강 상 R01 HL105734의 국립 연구소에 의해 지원되었다 건강 연구 경력 상 K08 HL094748의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다. VVP 교부 11IRG900384 지원하는 미국 심장 협회 (American Heart Association)의 혁신 연구원이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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