Summary
I detta protokoll w e identifierat en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi utlöser hos möss.
Abstract
Vi identifierade en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi triggers i möss. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från mus hjärtan som vi kommer från sådana som är konstruerade för att isolera neonatal murina cardiomyocytes. För att få hälsosammare hjärt melanocyter lämpliga för mer omfattande patch klämma eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad förfarande för isolering och plätering hjärt melanocyter baserade på dem ursprungligen för att isolera kutan melanocyter. Den raffinerade förfarande demonstreras i denna översyn och ger större antal friska melanocytstimulerande liknande celler som kan pläterade som en ren population eller med hjärtmuskelceller.
Introduction
Vi identifierade nyligen en ny cellpopulation i hjärtat av möss och människor som uttrycker melanin-syntesenzymer och morfologiskt liknar kutan melanocyter. Vi kallade dessa cellers hjärt melanocyter "och hittade de ingår i anatomiska platser från vilka förmaksarytmi utlöser ofta sitt ursprung i människor. Vi fann också hjärt melanocyter bidrar till förmaksarytmier i möss med könsceller radering av Dct. Hjärt melanocyter är glest fördelade i musen atrium där de utgör mindre än 0,1% av alla förmaksceller. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från musen hjärtat med hjälp av Cre-inducerbart melanocytstimulerande specifika markörer. Vår inledande förfarandet utvecklades från dem som används för att isolera neonatal murina cardiomyocytes och gav ett mycket litet antal celler lämpliga för patch clamp inspelningar eller PCR-analys. Emellertid, för att förbättra läkae och livskraft hjärt melanocyter, för mer djupgående elektrofysiologiska analyser eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad proceduren från sådana som är konstruerade för att isolera kutan melanocyter. Det förfarande som beskrivs och demonstreras i denna genomgång har fördelen att producera friskare hjärt melanocyter som kan pläterade som en ren population eller med kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Förbereda nödvändiga lösningar och utrustning
- Först sterilisera kirurgiska instrument (rak form tänger, krökt form tänger, rak form sax och krökt form saxar) genom autoklavering av dem under 15 min. vid 121 ° C. Förbered två uppsättningar instrument, där en uppsättning används för att dissekera ut hjärtan och den andra uppsättningen kommer att användas för malning upp vävnaden.
- Lös 1 paket MCDB153 odlingsmedier i 900 ml steriliserat, filtrerat vatten och rör om långsamt tills pulvret har lösts upp. Lägg 1,2 g natriumbikarbonat, eller 15,7 ml natriumvätekarbonatlösning [7,5% vikt / volym], för varje liter slutlig volym medium förbereds och rör om tills upplöst. Justera pH till 7,2 genom tillsats av antingen 1 N HCl eller 1 N NaOH, häll sedan medierna genom ett 0,2 | im flaska topp filtrering under sterila betingelser i en vävnadskulturkåpa (biosäkerhet skåp). Samlar sedan media och förvara den vid 4 ° C.
- Förbered de tillägg tilllägg till odlingsmedia (Materiallista). Tilläggen bör läggas till media precis innan medierna behövs för plätering av cellerna.
- Förbered DPBS med 10% FBS plus antibiotika (penicillin och streptomycin).
- Nästa, förbereda en 0,25% trypsin-lösning genom att tillsätta 0,25 g av trypsin (bovin pankreas, aktivitet> 2500 USP enheter / mg, ultrarent, USB) till 100 ml DPBS plus antibiotika (penicillin och streptomycin).
- Övrig erforderlig utrustning som behövs för att slutföra den här proceduren inkluderar ett stereomikroskop, Petri-skålar (10 cm), 50 ml koniska rör 40-ìm cell silar, DPBS plus antibiotika, 60-mm odlingsplattor och 35 mm odlingsskålar.
2. Isolera Hearts från Neonatal Mus Pups
- Först få P0 till P2 neonatal mus valpar (n = 6 till 8). Det rekommenderas att använda valpar som genereras av avel Dct-Cre homozygota honor med hanar som är heterozygota för antingen R26R: EYFP allel eller Z / EG-allelen att märkamelanocytstimulerande liknande celler. Både R26R: EYFP och Z / t ex möss är tillgängliga från Jackson Laboratories (lagernummer 006.148 och 003.920, respektive).
- Därefter avliva de nyfödda musungar, torka bröstet med en alkoholservett och sedan placera valparna i en 10-cm petriskål med DPBS.
- Skär huden över bröstet och bröstbenet med steriliserade pincett och sax och sedan öppna kistan försiktigt under ett stereomikroskop. Hjärtan neonatal mus valpar är mycket små, så var noga med att se till att ta bort hela hjärtat med förmaken bifogade.
- Tvätta hjärtan i DPBS och överföra dem till en ny 10-cm petriskål.
3. Enzymatic Digestion
- Ta med Petri-skålen med utskurna hjärtan till en vävnadsodling huva (biosäkerhet skåp) och följ stegen nedan med sterila tekniker i huven.
- Först, tvätta hjärtan tre gånger i sterila DPBS plus antibiotika.
- Placera hjärtan (n = 6-8) i en60-mm odlingsskål och tillsätt 6-8 ml 0,5% trypsin lösning på skålen.
- Därefter skär hjärtan i små bitar (mindre än 1 mm i storlek) och inkubera dem vid 37 ° C under 30 min i en 5% CO 2 atmosfär.
- Efter inkubationsperioden är fullständig, häll den resulterande lösningen av hjärtvävnad och trypsin från skålen in i en steril 50-ml koniska rör.
- Sedan, med hjälp av en 10-ml steril pipett, snabbt men varsamt, mal sönder lösningen i 50 ml koniskt rör 30-50 gånger.
- Filtrera den resulterande lösningen genom ett 40 ^ m cellfilter ovanpå en ny, ren 50 ml koniskt rör för uppsamling av filtratet.
- Därefter centrifugera 50-ml rör vid 240 x g i en bordscentrifug under 5 min vid rumstemperatur. Sedan försiktigt aspirera bort supernatanten och suspendera den återstående pelleten i 6-8 ml sterila DPBS. Upprepa detta steg 2 gånger. Detta steg pellets förmaks myocyterna och hjärt melanocyter men inte få ner fibroblasts sedan fibroblasterna är mindre och blir kvar i supernatanten.
4 Plating Cardiac Melanocyte-liknande celler
- Efter den tredje sköljningen efter centrifugering, försiktigt rinna eller aspirera bort tvättlösning (DPBS) och suspendera pelleten i 6 ml MCDB odlingsmedia på vilka kosttillskott har lagts till.
- Nu drar den återsuspenderade lösningen i en steril överföringspipett och placera cellerna i en 35-mm skål eller i en brunn i en 6-brunnars platta, och förena de isolerade hjärtceller från tre neonatala möss i en 35-mm skål eller väl.
- Inkubera skålarna över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär, aspirera bort odlingsmedia tillsammans med eventuella obundna celler och skölj sedan plattorna en gång med DPBS. Lägg sedan till färskt medium till plattorna och ersätta media varje 2 dagar. Celler isolerade från neonatala eller embryonala hjärtan kan bibehållas i odling under upp till 3 veckor, medan celler som isolerats från vuxen hörts kan upprätthållas i kultur i upp till 10 dagar.
5. Isolering Cardiac Melanocyte-liknande celler från vuxen mus hjärta
- Ta först bort hjärtan från mogna möss (3-4 veckor gamla, n = 3) genom en mittlinjen sternotomi efter administrering av heparin 100 U intraperitoneal till mössen och sedan euthanizing dem. Det rekommenderas att använda pentobarbital att avliva möss för detta förfarande, men detta läkemedel är inte tillgängliga på alla platser.
- Därefter tvätta utskurna hjärtan i sterila DPBS innehållande antibiotika i en vävnadsodling huva (biosäkerhet skåp). Kläm hjärtan något med böjda dissekera pincett för att avlägsna eventuell kvarvarande blod från dem och skölj hjärtan i DPBS en gång till.
- Ta förmaken och atrioventrikulärt ring från hjärtan (dessa strukturer innehåller melanocyten liknande celler) och placera de utskurna vävnadsprover i en 35-mm maträtt.
- Skär hjärtan i små bitar med hjälp av böjda sax och kraftps och sedan lägga 6-8 ml 0,5% trypsin lösning på skålen. Inkubera sedan skålarna vid 37 ° C i 45-60 min.
- Nu följer du anvisningarna från proceduren ovan från steg 3.6 och framåt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs i denna artikel är en förbättrad teknik i jämförelse med den som vi tidigare publicerat för att isolera hjärt melanocyter från murina hjärtat. Detta förfarande sysselsätter användningen av fluorescerande markörer som drivs av melaninsyntes enzymspecifika Cre-rekombinas att märka hjärt melanocytstimulerande liknande celler. Det är viktigt att använda en markör för att märka hjärt melanocyter vid arbete med nyligen isolerade embryonala eller neonatala celler, eftersom de morfologiska skillnader som skiljer hjärt melanocyter från förmaks myocyter ännu inte har utvecklats (Figur 1A). Som visas i figur 1 A när isoleringssteg har gått bra kommer ett ganska stort antal förmaks myocyter och hjärt melanocyter hålla sig till laminin belagda skålen med några icke-vidhäftande celler. I detta fall är de vidhäftande cellerna visas platt på botten av skålen (gul pilspetsar Figur 1A, pilspets). Å andra sidan, när det förfarande inte fungerar väl de flesta av cellerna kommer att vara icke-vidhäftande och ofta ser sfäriska och avrundas uppåt (ljusblå pilspetsar, Figur 1A).
När de isolerade cellerna visualiseras med grön fluorescens avbildning, är det tydligt vilka celler är hjärt melanocyter och vilka celler är förmaks myocyter (Figur 1). Som nämnts ovan i protokollet (steg 3,9), är fibroblaster bort från poolen av isolerade förmaks celler med hjälp av låg-force centrifuge som pellets större förmaks myocyterna och hjärt melanocyter, men inte få ner de mindre hjärt fibroblaster. De nyligen isolerade cellerna kan nu användas för enstaka cell elektrofysiologiska inspelningar (Figur 2), enda cell RNA-analys eller biokemiska analyser.
Vi har också odlas och underhålls enstaka neonatala eller embryonala förmaksceller med hjälp av detta protokoll i upp till 21 dagar. Använda de odlingsbetingelser som beskrivs i dettaprotokoll kommer hjärt melanocytstimulerande liknande celler ytterligare differentiera och föröka, medan förmaks myocyterna tenderar att lossna från skålen och dör inom 2-3 dagar efter att de är isolerade. Visas i figur 3A är friska hjärt melanocyter 5 dagar efter att de isolerade från en neonatal mus hjärta. Notera avsaknaden av förmaks myocyter kring dessa celler (i motsats till de nyligen isolerade cellerna som visas i figur 1). Dessutom har dessa hjärt melanocyter utvecklat omfattande dendritiska processer och liknar kutana melanocyter som också har varit i kultur för samma antal dagar (Figur 3B).
Figur 1 Representant (A) DIC och (B) GFP bilder av nyligen isolated förmaks celler från en embryonal (E19.5) Dct-Z / EG-mus valp. Den vita pilen identifierar hjärt melanocyt i båda panelerna. Observera att utan hjälp av den fluorescerande markör, är svåra att identifiera och särskilja från förmaks myocyter (gula pilspetsar) bifogas skålen hjärt melanocyt. De ljusblå pilspetsar pekar på förmaks celler som inte är väl kopplade till skålen.
Figur 2 Dct - / - hjärt melanocyter visar förlängd verkan duration. Tång inspelningar från (A) hjärt Dct +/- och (B) hjärt Dct - / - celler som uppvisar ökad durationen av aktionspotentialen i frånvaro av Dct. Vilande potential Dct +/- cellen är -62 mV, medan DCT - / - cell har en vilande potential-60 MV. Reproducerad med tillstånd från Levin et al. J. Glin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Figur 3. Representativa bilder av isolerade (A) hjärt melanocytstimulerande liknande celler och (B) kutan melanocyter. Melanocyter isolerades från hjärtan och huden på neonatal möss (P1), respektive, och sedan odlades i 5 dagar.
Figur 4. Dct-uttryckande celler befolka hjärta. (A) Hybridisering in situ av en E13.5 mus hjärta visar Dct uttryck(fyllda pilar) runt lungven os (öppen pilspets). (B) Immunofluorescens-färgning med DCT-positiva celler (pilspetsar) inom de pulmonella vener. (C) X-gal färgning av Dct-positiva celler i den bakre atrium en E16.5 mus Dct-LacZ heart (pilar). (D) X-gal färgning i en E17.5 Dct-LacZ mushjärta längs RA septum i regionerna foramen ovale, sinus coronarius os och nedre hålvenen; infälld skala = 500 nm. (E) Vuxen mus (p60) till följd av att korsa en DctCre +/- och R26R mus visar LacZ positiva celler (pilar) i lungvenerna och vänster förmak. (F) Dct-positiva celler detekterade genom immunofluorescerande färgning (pilar) på endotelet i en kirurgiskt avlägsnades humant lungvenen. Scale = 500 mikrometer i alla paneler utom paneler (B och D; skala = 100 nm) och panelen (F; skalan = 50 pm). Förkortningar: PV, lungvenen; LA, vänster förmak; Ao, aorta; PA, pulmonary artär; RA, höger förmak; IVC, nedre hålvenen; FO, foramen ovale; CS, sinus coronarius. Reproducerad med tillstånd från Levin et al. J. Glin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärtat melanocyter finns i anatomiska platser i hjärtat som vanligtvis ger upphov till förmaksarytmi triggers. Dessa områden innefattar lungvenerna, det atrioventrikulärt ringen, den bakre vänster förmak och foramen ovale (Figur 4). För att förstå vilken roll dessa celler spelar i arrhythmogenesis utvecklar vi metoder för att isolera dem och studera deras fysiologi. Dock erkände vi att förbättra denna teknik för att ge friskare och större mängder av hjärt melanocyter skulle tillåta ytterligare studier för att undersöka svaret av hjärt melanocyter till exogena stimuli. Dessutom kan förbättrade isoleringstekniker även tillåta studier för att undersöka interaktionen av hjärt melanocyter med förmaks myocyter under normal fysiologi och sjukdomar.
Detta dokument beskriver ett förfarande för isolering av livskraftiga melanocytstimulerande liknande celler från mus hjärta att vi utvecklats från protokoll som syftar till att Isolåt melanocyter från huden. Det kritiska steget i detta protokoll extrahera melanocyten liknande celler från hjärtat. Medan isolera hjärt melanocyter från neonatala hjärtan är relativt enkelt, utvinna hjärt melanocyter från mogna hjärta är mycket svårare på grund av den ökade mängden interstitiell fibros. I detta protokoll använde vi trypsindigerering att extrahera melanocytstimulerande liknande celler från mogna hjärta. För att utveckla detta protokoll vi testade flera olika enzymatiska kombinationer som bestod av olika koncentrationer av trypsin, kollagenas och dispas.
Vi fann att behandling av neonatala förmak med en kombination av kollagenas (för första 30 min) följt av trypsin (för nästa 15 min) till en början producerade högre utbyten av melanocytstimulerande liknande celler, men de isolerade cellerna var mindre friska med minskad lönsamhet. Å andra sidan, digerering med trypsin ensamt gav en moderat antal friska melanocytstimulerande liknande celler från mature mus hjärtan. Därför rekommenderar vi att bara använda trypsin för att isolera melanocytstimulerande liknande celler från mogna murina hjärtan. Dessutom fann vi att kraftfullt finfördelning slammet som produceras efter trypsindigerering av mogna mus hjärtan förbättrat utbytet av livskraftiga melanocytstimulerande liknande celler. Vi bör nämna att trypsin har potential att delvis smälta membrankanaler eller laddningsbärare, vilket kan påverka kanaltäthet när du utför patchklämstudier. Även om vi inte har gjort en noggrann analys för att avgöra om trypsindigerering påverkar strömtäthet av isolerade, mogna melanocytstimulerande liknande celler som vi inte har märkt några betydande effekter på strömmar eller aktionspotentialer i de studier vi har utförts med hjälp av detta protokoll.
Hjärtat melanocytstimulerande liknande celler är en mycket gles cellpopulation i hjärtat (mindre än 0,1% av alla atriella celler) som morfologiskt liknar kutana melanocyter (Figur 1 och Figur 3 </ Strong>). Eftersom det finns relativt få hjärt melanocyter som finns i hjärtat; tills nyligen har vi bara kunnat använda dem för encelliga analyser (dvs patch kläm inspelning eller encelliga PCR). Dock har vi fått större mängder av hjärt melanocyter genom att samla 20-30 neonatal, eller 5-8 mogna hjärtan och fann detta tillvägagångssätt ger en tillräcklig mängd vävnad för att utföra immunoblot eller biokemiska analyser. Med tanke på det låga antalet melanocytstimulerande liknande celler i murina hjärtat, för att förbättra avkastningen från dessa celler efter att de har isolerats vi sätter ofta 15-20 mm rund, Teflon infogar på 35 mm rätter med steriliserade vakuum fett . Cellerna kan sedan placeras inom skären att minska plätering område och ökar deras densitet. Använda Teflon infogar också förbättrar lönsamheten för melanocytstimulerande liknande celler efter deras isolering och under pläteringen perioden också.
Vissa hjärt melanoCyte liknande celler har en bipolär morfologi efter isolering, som vi tror utgör en mindre differentierade tillståndet hos dessa celler. Dessutom fann vi att odla hjärt melanocyter för tre dagar efter isolering tycks inducera ytterligare differentiering av melanocytstimulerande liknande fenotyp där cellerna börjar bilda dendriter. Vi har också funnit detta protokoll ger melanocytstimulerande liknande celler från mogna hjärtan som kan upprätthållas i upp till 10 dagar i odling. Men mer än 10 dagar i kultur melanocytstimulerande liknande celler som isolerats från mogna hjärtan kommer att sluta sprider och kan bli senescent. Isolerade och pläterade hjärt melanocyter kan användas för cellelektrofysiologiska analys eller annan molekylär / cellulär biologisk analys, såsom RNA-profilering eller studier för att bedöma deras fysiologiska reaktioner på yttre faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health utmärkelse R01 HL105734 till VVPMDL stöds delvis av National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP är ett innovativt forskare på American Heart Association med stöd av bidrag 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
