Summary
In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.
Abstract
We identificeerden een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie triggers in muizen. Om de elektrische en biologische eigenschappen van cardiale melanocyten onderzoeken we een procedure om ze te isoleren van de muis hart dat we afgeleid van de producten ontworpen voor neonatale muizen hartspiercellen isoleren ontwikkeld. Om gezonder hart melanocyten geschikt voor uitgebreidere patch clamp of biochemische studies te verkrijgen, ontwikkelden we een verfijnde procedure voor het isoleren en plating cardiale melanocyten op basis van die oorspronkelijk ontworpen om de huid melanocyten isoleren. De verfijnde procedure wordt gedemonstreerd in deze review en produceert grotere aantallen gezonde melanocyten-achtige cellen die kunnen worden verzilverd als een zuivere populatie of met hartspiercellen.
Introduction
We identificeerden recent een nieuwe cel populatie in het hart van muizen en mensen die melanine-synthese enzymen uiten en morfologisch lijken cutane melanocyten. We noemden 'cardiale melanocyten' deze cellen en vond ze aanwezig in anatomische locaties van waaruit atriumaritmie triggers vinden vaak hun oorsprong in de mens zijn. We vonden ook cardiale melanocyten bijdragen aan atriale ritmestoornissen bij muizen met kiembaan verwijdering van Dct. Cardiale melanocyten dun verspreid muis atrium waar ze bevatten minder dan 0,1% van alle atriale cellen. Om de elektrische en biologische eigenschappen van cardiale melanocyten onderzoeken we een procedure te isoleren van het muizenhart met Cre-induceerbare melanocyt-specifieke merkers ontwikkeld. Onze eerste procedure werd ontwikkeld van die welke voor neonatale muizen hartspiercellen en leverde zeer kleine aantallen cellen die geschikt zijn voor patch clamp opnamen of PCR-analyse te isoleren. Echter, aan het verbeteren van het genezenste en de levensvatbaarheid van cardiale melanocyten, voor meer diepgaande elektrofysiologische analyse of biochemische studies, we een verfijnde procedure uit die bedoeld zijn om de huid melanocyten isoleren ontwikkeld. De beschreven en gedemonstreerd, beoordeling procedure heeft het voordeel van het produceren gezondere cardiale melanocyten die kunnen worden uitgeplaat als een zuivere populatie of cardiomyocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiden van de nodige oplossingen en apparatuur
- Eerst steriliseren de chirurgische instrumenten (rechte vorm tang, gebogen vorm tang, recht model scharen en scharen gebogen vorm) door ze te autoclaveren gedurende 15 minuten. bij 121 ° C. Bereid 2 sets van instrumenten, waarbij een set wordt gebruikt voor het ontleden van de harten en de andere set wordt gebruikt voor hakken het weefsel.
- Los 1 pakje MCDB153 voedingsbodems in 900 ml gesteriliseerd, gefilterd water en roer langzaam tot het poeder is opgelost. Voeg 1,2 g natriumbicarbonaat of 15.7 ml natriumwaterstofcarbonaat-oplossing [7,5% w / v], per liter eindvolume drager voorbereid en roer tot opgelost. Breng de pH op 7,2 door toevoeging van ofwel 1 N HCl of 1 N NaOH, en giet dan de media door een 0,2 micrometer fles top filter onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap (bioveiligheid kast). Verzamelen dan de media en het op 4 ° C.
- Bereid de aanvullingen opIn de kweekmedia (Materials List). De supplementen worden toegevoegd aan de media vlak voor het materiaal nodig voor het plateren van de cellen.
- Bereid DPBS met 10% FBS plus antibiotica (penicilline en streptomycine).
- Bereid vervolgens een 0,25% trypsine-oplossing door toevoeging van 0,25 g trypsine (bovine pancreas, activiteit> 2500 USP eenheden / mg, ultrapuur, USB) 100 ml van DPBS plus antibiotica (penicilline en streptomycine).
- Andere benodigde apparatuur die nodig is om deze procedure te voltooien onder een stereomicroscoop, Petri-schalen (10-cm), 50 ml conische buizen, 40-micrometer cel filters, DPBS plus antibiotica, 60-mm cultuur gerechten en 35-mm cultuur gerechten.
2 Isoleren van Harten van Neonatale Mouse Pups
- Eerst verkrijgen P0 P2 neonatale muis pups (n = 6 tot 8). Het wordt aanbevolen om pups die door het fokken Dct-Cre homozygote vrouwen met mannen die heterozygoot zijn voor ofwel de R26R zijn te gebruiken: EYFP allel of de Z / EG-allel op het etiketmelanocyt-achtige cellen. Beide R26R: EYFP en Z / EG muizen zijn verkrijgbaar bij Jackson Laboratories (voorraad nummers 006148 en 003920, respectievelijk).
- Vervolgens euthanaseren de neonatale muis pups, vegen hun borst met een alcoholdoekje en leg dan de pups in een 10-cm petrischaal met DPBS.
- Snijd de huid over de borst en het borstbeen met gesteriliseerde tang en schaar en open de borst voorzichtig onder een stereomicroscoop. De harten van de neonatale muis pups zijn erg klein dus wees voorzichtig om ervoor te zorgen om het hele hart te verwijderen met de atria verbonden.
- Was de harten in DPBS en overbrengen naar een nieuwe 10-cm petrischaal.
3 enzymatische afbraak
- Breng de Petri-schaal met de gesneden harten een weefselkweek kap (bioveiligheid kast) en volg dan de onderstaande behulp van steriele technieken in de kap stappen.
- Was eerst de harten drie keer in een steriele DPBS plus antibiotica.
- Plaats de harten (n = 6-8) in een60-mm kweekschaal en voeg 6-8 ml 0,5% trypsine oplossing van de schotel.
- Vervolgens stuurde de harten in kleine stukjes (minder dan 1 mm in grootte) en incubeer ze op 37 ° C gedurende 30 min in een 5% CO2 atmosfeer.
- Na de incubatietijd is voltooid, giet de verkregen oplossing van hartweefsel en trypsine van de schaal in een steriele 50 ml conische buis.
- Dan, met een 10 ml steriele pipet snel maar voorzichtig vermaal de oplossing in de 50 ml conische buis 30-50 keer.
- Filtreer de verkregen oplossing door een 40-um cel zeef op een nieuwe, schone 50 ml conische buis met het filtraat te verzamelen.
- Vervolgens centrifugeren de 50 ml buis bij 240 x g in een tafelmodel centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Dan, Zuig voorzichtig af en resuspendeer de resterende pellet in 6-8 ml steriele DPBS. Herhaal deze stap nog 2 keer. Deze stap pellets de atriale myocyten en cardiale melanocyten, maar niet omlaag brengen van de fibroblasts aangezien de fibroblasten kleiner en in de supernatant blijven.
4 Plating Cardiac Melanocyte-achtige cellen
- Wanneer driemaal spoelen na centrifugatie zorgvuldig afvoer of aspireren van de wasoplossing (DPBS) en resuspendeer de pellet in 6 ml MCDB kweekmedium waarin de supplementen toegevoegd.
- Nu, trek de geresuspendeerde oplossing in een steriele pipet overdracht en plaats de cellen in een 35-mm schaal, of in een putje van een 6-well plaat, en het zwembad de geïsoleerde cardiale cellen van 3 neonatale muizen in een 35-mm schaal of goed.
- Incubeer de schotels een nacht bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer, zuigen uit het kweekmedium samen met eventuele losse cellen en spoel de platen eenmaal met DPBS. Voeg dan vers medium aan de platen en de media vervangen elke 2 dagen. Cellen geïsoleerd uit neonatale of embryonale harten kunnen in cultuur worden gehouden voor maximaal 3 weken, terwijl cellen geïsoleerd uit volwassen horents kan in cultuur worden gehouden voor maximaal 10 dagen.
5. Isolating Cardiac Melanocyte-achtige cellen uit volwassen muis Hart
- Verwijder eerst de harten van volwassen muizen (3-4 weken oud, n = 3) via een middellijn sternotomie na toediening van heparine 100 U intraperitoneaal aan de muizen vervolgens euthanasie hen. Het wordt aanbevolen om pentobarbital te gebruiken om muizen te euthanaseren voor deze procedure, maar dit geneesmiddel is niet beschikbaar op alle locaties.
- Vervolgens was de weggesneden harten in steriele DPBS met antibiotica in een weefselkweek kap (bioveiligheid kast). Knijp de harten iets met gebogen ontleden tang om alle resterende bloed van ze te verwijderen en spoel dan de harten in DPBS nog een keer.
- Verwijder de atria en atrioventriculaire ring van de harten (deze structuren bevatten de melanocyten-achtige cellen) en plaats de weggesneden weefselmonsters in een 35 mm schaal.
- Snij de harten in kleine stukjes met behulp van gebogen schaar en krachtps en voeg 6-8 ml 0,5% trypsine oplossing van de schotel. Incubeer dan de gerechten bij 37 ° C gedurende 45-60 minuten.
- Nu, volg de stappen van de bovenstaande procedure vanaf stap 3.6 en later.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in dit artikel beschreven protocol is een verbeterde techniek in vergelijking met degene die we eerder gepubliceerd voor het isoleren van cardiale melanocyten uit de muizen hart. Deze procedure maakt gebruik van het gebruik van fluorescente merkers gevolg van melanine synthese enzym-specifieke Cre-recombinase cardiale melanocyt-achtige cellen te labelen. Het is belangrijk om een marker cardiale melanocyten label bij het werken met vers geïsoleerde embryonale of neonatale cellen, omdat de morfologische verschillen cardiale melanocyten onderscheiden van atriale myocyten nog niet ontwikkeld (figuur 1A). Zoals getoond in figuur 1A als de isolatiestap goed is gegaan, wordt een vrij groot aantal atriale myocyten en cardiale melanocyten zich aan de laminine beklede schotel met een paar niet-hechtende cellen. In dit geval zal de hechtende cellen blijken plat op de bodem van de schaal (gele pijlpunten figuur 1A, pijlpunt). Anderzijds, wanneer de procedure niet goed meeste cellen niet hechtende en vaak kijken sferische en afgerond (lichtblauw pijlpunten figuur 1A).
Wanneer de geïsoleerde cellen worden gevisualiseerd met behulp van groene fluorescentie beeldvorming blijkt dat cardiale cellen melanocyten en die cellen atriale myocyten (figuur 1). Zoals hierboven vermeld in het protocol (stap 3.9), worden de fibroblasten uit de pool van geïsoleerde atriale cellen met behulp van low-force centrifugeren dat de grotere atriale myocyten en cardiale melanocyten pellets, maar niet omlaag brengen van de kleinere cardiale fibroblasten. De vers geïsoleerde cellen kunnen nu gebruikt worden voor enkele cel elektrofysiologische opnames (figuur 2), enkele cel RNA analyse of biochemische assays.
We hebben ook gekweekt en onderhouden geïsoleerde neonatale of embryonale atrium stamcellen met dit protocol tot 21 dagen. De kweekomstandigheden beschreven in dezeprotocol, de cardiale melanocyt-achtige cellen verder te differentiëren en prolifereren, terwijl de atriale myocyten vaak los van de schaal en sterven binnen 2-3 dagen nadat ze zijn geïsoleerd. In figuur 3A gezond hart melanocyten 5 dagen nadat ze werden geïsoleerd uit een neonatale muis hart. Merk het gebrek aan atriale myocyten rond deze cellen (in tegenstelling tot de vers geïsoleerde cellen figuur 1). Bovendien hebben deze cardiale melanocyten uitgebreide dendritische processen ontwikkeld en lijken cutane melanocyten die ook in kweek zijn voor hetzelfde aantal dagen (Figuur 3B).
Figuur 1 Representatieve (A) en DIC (B) GFP beelden van vers iSolated atriale cellen van een embryonale (E19.5) Dct-Z / EG muis pup. De witte pijl geeft de cardiale melanocyt in beide panels. Merk op dat zonder de steun van de fluorescente merker, de cardiale melanocyt moeilijk te identificeren en te onderscheiden van de atriale myocyten (gele pijlpunten) aan de schotel. De lichtblauwe pijlpunten wijzen op atriale cellen die niet goed zijn bevestigd aan de schotel.
Figuur 2 Dct - / - cardiale melanocyten tonen verlengde duur van de actiepotentiaal. Voor clamp opnamen van (A) cardiale Dct +/- en (B) cardiale Dct - / - cellen die een verhoogde duur van de actiepotentiaal in afwezigheid van Dct. Rustpotentiaal van de Dct +/- cel -62 mV, terwijl de Dct - / - cel een rustpotentiaal van-60 MV. Gereproduceerd, met toestemming, van Levin et al. J. Clin. Investeren. 119, 2920-2936 (2009).
Figuur 3 Representatieve beelden van geïsoleerde (A) cardiale melanocyt-achtige cellen en (B) cutane melanocyten. Melanocyten werden geïsoleerd van het hart en de huid van neonatale muizen (P1), respectievelijk, en vervolgens gedurende 5 dagen gekweekt.
Figuur 4 Dct expressie brengende cellen bevolken het hart. (A) In situ hybridisatie van een E13.5 muis hart toont Dct uitdrukking(Gevuld pijlen) rondom de longader os (open pijlpunt). (B) Immunofluorescente kleuring van Dct-positieve cellen (pijlen) in de longaders. (C) X-gal kleuring DCT-positieve cellen in het achterste atrium van een E16.5 muis Dct-LacZ heart (pijlen). (D) X-gal kleuring in een E17.5 Dct-LacZ muizenhart langs de RA septum in de regio van het foramen ovale, coronaire sinus os en inferior vena cava; bijvoegsel schaal = 500 pm. (E) volwassen muis (p60) als gevolg van het oversteken van een DctCre +/- en R26R muis toont LacZ- positieve cellen (pijlen) in de longaders en de linkerboezem. (F) Dct-positieve cellen gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring (pijlen) op het endotheel van een chirurgisch verwijderd human longader. Schaal = 500 micrometer in alle panelen behalve panelen (B en D; schaal = 100 micrometer) en paneel (F; schaal = 50 micrometer). Afkortingen: PV, longader; LA, linker atrium; Ao, aorta; PA, pulmonaire slagader; RA, rechter atrium; IVC, onderste vena cava; FO, foramen ovale; CS, coronaire sinus. Gereproduceerd, met toestemming, van Levin et al. J. Clin. Investeren. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiale melanocyten aanwezig in anatomische locaties binnen het hart dat gewoonlijk tot atriale aritmie triggers geven. Deze gebieden omvatten de longaders, de atrioventriculaire annulus, het achterste linker atrium en het foramen ovale (figuur 4). Naar de rol die deze cellen spelen in aritmieën begrijpen, ontwikkelen we technieken om ze te isoleren en bestuderen hun fysiologie. Maar we erkend dat verbetering van deze techniek ter verkrijging gezonder en grotere hoeveelheden cardiale melanocyten zou toelaten verdere studies om de reactie van cardiale melanocyten op exogene stimuli onderzoeken. Bovendien kan verbeterde isolatietechnieken ook in staat studies om de interactie van cardiale melanocyten atriale myocyten gedurende normale fysiologie met onderzoeken.
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het isoleren levensvatbare melanocyt-achtige cellen van de muis hart dat we ontwikkeld van protocollen ontworpen isolat melanocyten uit de huid. De cruciale stap in dit protocol is het extraheren van de melanocyten-achtige cellen uit het hart. Hoewel het isoleren van cardiale neonatale melanocyten van hart is erg eenvoudig, extraheren cardiale melanocyten uit de rijpe hart veel moeilijker vanwege de verhoogde hoeveelheid interstitiële fibrose. In dit protocol we trypsine digestie met melanocyt-achtige cellen extraheren van het rijpe hart. Om dit protocol testten we verschillende enzymatische combinaties die bestond uit verschillende concentraties trypsine, collagenase en dispase ontwikkelen.
We vonden dat behandeling van neonatale atria met een combinatie van collagenase (voor de eerste 30 min) gevolgd door trypsine (voor de volgende 15 min) produceerde aanvankelijk hogere opbrengsten van melanocyt-achtige cellen, maar de geïsoleerde cellen waren minder gezond met verminderde levensvatbaarheid. Anderzijds, digestie met trypsine alleen tot een matig aantal gezonde melanocyt-achtige cellen uit mtuur muis harten. Daarom raden we alleen met behulp van trypsine te melanocyten-achtige cellen uit volwassen muizen harten te isoleren. Bovendien vonden we dat krachtig wrijven de suspensie die na trypsinedigestie van rijpe muisharten verbeterde de opbrengst van levensvatbare melanocyt-achtige cellen. We moeten vermelden dat trypsine heeft kunnen gedeeltelijk verteren membraan kanalen of ladingsdragers, en dit kan kanaaldichtheid beïnvloeden bij het uitvoeren van patch clamp studies. Hoewel we hebben niet overgegaan tot een grondige analyse om te bepalen of trypsine spijsvertering beïnvloedt de huidige dichtheid van geïsoleerde, volwassen melanocyten-achtige cellen hebben we niet gezien geen significante effecten op de stromen of actiepotentialen in de studies die we hebben uitgevoerd met behulp van dit protocol.
Cardiac melanocyt-achtige cellen zijn zeer dun celpopulatie in het hart (minder dan 0,1% van alle atriale cellen) die morfologisch lijkt cutane melanocyten (Figuur 1 en Figuur 3 </ Strong>). Omdat er relatief weinig cardiale melanocyten aanwezig in het hart; Tot voor kort hebben we enkel nog in staat geweest om ze te gebruiken voor de single-cell assays (dwz patchklemmen opname of single-cell PCR). Wij hebben echter grotere hoeveelheden cardiale melanocyten verkregen door het samenbrengen 20-30 neonatale of 5-8 volwassen hart, en vonden deze benadering produceert een voldoende hoeveelheid weefsel voor het uitvoeren immunoblot of biochemische assays. Bovendien, gezien het geringe aantal melanocyt-achtige cellen in het muizen hart, de opbrengst van deze cellen after ze geïsoleerd zijn we bepaalt vaak 15-20 mm circulaire, Teflonlaag op 35-mm schaaltjes met een gesteriliseerde vacuüm vet . De cellen kunnen vervolgens binnen de inzetstukken worden geplaatst om de beplating gebied verminderen en verhoogt hun dichtheid. Met behulp van Teflon voegt verbetert ook de leefbaarheid van melanocyten-achtige cellen na hun isolement en tijdens de beplating periode als goed.
Sommige cardiale melanocyte-achtige cellen een bipolaire morfologie na isolatie, waarvan wij geloven vertegenwoordigt een minder gedifferentieerde toestand van deze cellen. Bovendien vonden we dat kweken cardiale melanocyten 3 dagen na isolatie lijkt verdere differentiatie van de melanocyt-fenotype waarbij de cellen beginnen dendrieten vormen induceren. We hebben ook gevonden dit protocol levert melanocyt-achtige cellen uit volwassen hart die kunnen worden behouden gedurende 10 dagen in kweek. Echter, meer dan 10 dagen in de cultuur melanocyten-achtige cellen geïsoleerd uit volwassen harten zal stoppen prolifererende en kunnen senescent geworden. Geïsoleerd en uitgeplaat cardiale melanocyten kan worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische analyse of andere moleculaire / cellulaire biologische analyse, zoals RNA profiling of studies naar de fysiologische responsen na te exogene factoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health award R01 HL105734 om VVPMDL wordt ondersteund, voor een deel, door de National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP is een innovatieve Onderzoeker van de American Heart Association ondersteund door subsidie 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
