Summary
Мы покажем, что биомедицинские устройства разработаны с участием непрерывным или импульсным лазер видимого диапазона на основе лечения, которое в сочетании с лечения антибиотиками (гентамицин), приводит к статистически значимому синергетический эффект приводит к снижению жизнеспособности
Abstract
В последнее время появились ряд публикаций по бактерицидным действием видимого света, большинство из них утверждают, что синяя часть спектра (400 нм-500 нм) несет ответственность за убийство различных патогенов 1-5. Фототоксическая эффект синего света было предложено быть результатом светоиндуцированная активных форм кислорода (АФК), образование эндогенного бактериального фотосенсибилизаторами которые в основном поглощают свет в синей области 4,6,7. Есть также сообщения биоцидного действия красного и ближнего инфракрасного 8, а также зеленый свет 9.
В настоящем исследовании мы разработали метод, который позволил нам охарактеризовать действие зеленого цвета наивысшей мощности (длина волны 532 нм) непрерывный (CW) и импульсной модуляцией добротности (QS) свет на синегнойной палочкой. Используя этот метод, мы также изучали влияние зеленого света в сочетании с лечения антибиотиками (гентамицин) на бактерии жизнеспособность. P. палочка является ACommon noscomial оппортунистических возбудителем различных заболеваний. Штамм довольно устойчивы к различным антибиотикам и содержит многие предсказывали ACRB / Mex типа RND лекарственной отток систем 10.
Метод использовали свободно живущие стационарной фазы грамотрицательных бактерий (штамм P. палочки PAO1), выращенных в бульоне Лурия (LB) среде подвергается добротности и / или непрерывные лазеры с добавлением и без добавления антибиотика гентамицина. Жизнеспособность клеток определяли в различные моменты времени. Полученные результаты показали, что лазерное лечение только не снижает жизнеспособность клеток по сравнению с необработанным контролем и что гентамицин только в лечении только привели в 0,5 журнал снижение количества жизнеспособных для P. палочки. Комбинированный лазер и гентамицина лечение, однако, в результате синергический эффект и жизнеспособность P. палочка была снижена на 8 бревна.
Предлагаемый способ может дополнительно быть реалиmented через развитие катетер как устройство, способное инъекционным раствором антибиотика в инфицированные органа одновременно освещающего область света.
Protocol
1. Бактериальной культуры
- Грамотрицательные P. палочки штамма PAO1 выращивали в бульоне Лурия (LB) при 37 ° С в течение 18 час.
- Культуре клеток затем центрифугировали при 7500 оборотов в минуту (оборотов в минуту) в течение 5 мин и надосадочную жидкость удаляли.
- Бактерий ресуспендировали в 10% LB и повторно выращивают в течение еще 2 часа, чтобы позволить культуры повторно ввести стационарной фазы.
- Бактерии суспензию затем разделить на две группы: в первой группе (2 пробирки) не антибиотик не были добавлены во второй группе мы добавили антибиотик гентамицин (50 мкг / мл).
2. Определение колониеобразующих единиц (КОЕ)
- Для определения жизнеспособности клеток 20 мкл образцы были взяты из эксперимента примерно каждые 2 часа в сроки от 24 часов. Серийные разведения образцов были сделаны и высевали на чашки с LB-агаром и инкубировали в течение ночи при 37 ° С.
- Для каждого лечения, КОЕ на платформеэлектронной была определена и было проведено сравнение между периоды времени и различные процедуры. Логарифмическое уменьшение КОЕ был рассчитан, как описано в уравнении. (1):
Вход сокращение = Logu-LogC [КОЕ / мл]
Где U является колониеобразующих единиц значение в каждый момент времени; КОЕ является колониеобразующих устройством, пока единиц КОЕ / мл равна:
КОЕ / мл = (количество колоний фактор разведения X) / (объем привиты)
И С КОЕ найдена в контрольном образце при времени начала. Заметим, что и обозначает колониеобразующих фактором при измерении мгновенно. - Коэффициент разбавления это число разведений в то время как каждый из них концентрацию бактерий была уменьшена на коэффициент 10. Инокулированную объем был всегда микро 200 литров, и это связано с размерами нашей пробирке.
Поэтому суммировать концентрации точки зрения, гентамицин антибиотик был в концентрации 50 мкг / мл. не касается бактерий, до концаПроцесс у нас была общая 8 разведения. Каждое разведение было в два раза 10 и это было сделано в трубах 200 мкл. Отправной точкой был 20 мкл образца добавляли в 200 мкл трубку (и, следовательно, начальная концентрация была 20/200C 0 = 0.1C0 с C 0 является исходной концентрации в 20 мкл образцов), и конечная концентрация была снижена на восемь порядков из-за 8 разведений.
3. Освещение
- CW Nd: YAG лазера (длина волны 532 нм и средней оптической мощностью 200 мВт) был разделен на две оптических путей с использованием оптических 50% / 50% светоделителе. Диаметр пучка была около 10 мм. Продолжительность воздействия составляет 24 часов.
- Добротности импульсного Nd: YAG лазер (длина волны 532 нм, средней мощностью 300 мВт и оптические пиковой мощностью 2,5 МВт) также был разделен на два пути, используя оптический 50% / 50% светоделитель. Диаметр пятна был 6 мм. Длительность импульса лазера с модуляцией добротности было 6 нс и частотой повторения 15 Гц было.средняя плотность мощности 106 мВт / см 2 и пиковой плотности мощности 8,83 кВт / мм 2. Продолжительность воздействия составляет 24 часов.
Следует отметить, что бактериальную суспензию перемешивают при облучении и это было сохранено при соответствующих условиях культивирования для роста бактерий (во всех пробирках был бульона Луриа среду, которая позволяет бактерии расти).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лазерной установки на основе схематически представлены на рисунке 1. Первое экспериментальное условие использованы CW Nd: YAG лазера с длиной волны 532 нм (вторая гармоника Nd: YAG) и средней оптической мощностью 200 мВт. Этот луч был разделен на две оптических путей с использованием оптических 50% / 50% светоделителе так, что каждый раскол пучок имел мощность 100 мВт. Диаметр пучка была около 10 мм и, следовательно, плотность энергии составляла около 100 мВт / см 2. Продолжительность воздействия составляет 24 часов. Хотя освещение власть является относительно высоким, это не достаточно высока, чтобы вызвать нагрев образца.
Вторая экспериментальная состоянии использовать добротности импульсный Nd: YAG лазер с длиной волны 532 нм (вторая гармоника) и диаметр пятна 6 мм. При средней мощности 300 МВт и оптические пиковой мощностью 2,5 МВт. Длительность импульса лазера с модуляцией добротности было 6 нс и частотой повторения 15 Гц было. Этот луч был разделен на два пути, используя оптические50% / 50% светоделитель. Средняя плотность мощности составляла около 100 мВт / см 2 и пиковой плотности мощности 8,83 кВт / мм 2. Это пиковая плотность мощности эквивалентна энергии плавность 88,3 мДж / мм 2 на импульс, поскольку каждый импульса 10 нсек во временной области. Продолжительность воздействия составляет 24 часов. Оба эксперименты проводили в аналогичных условиях роста с не-освещенности (то есть с учетом и без гентамицин), который служил в качестве контроля.
На фигурах 2 (а) и 2 (б) эффект, получаемый за счет освещения образца светом непрерывного лазера и лазера с модуляцией добротности соответственно с антибиотиком и без на P. палочки представлена.
В образцах, которые не подвергались воздействию света (т.е. контроль) нет снижение жизнеспособности клеток с или без гентамицина лечения. Этот результат позволяет предположить, что бактерии, устойчивые к гентамицину лечение, имитируяситуация часто встречается в клинике.
Лазерный свет в одиночку и не побуждать какое-либо убийство либо. Однако комбинация лазерного света и гентамицин уменьшена бактериями жизнеспособности на несколько порядков величины. Наиболее известный эффект был измерен после 24 ч в котором комбинация либо по часовой или лазера с модуляцией добротности уменьшена жизнеспособность 8 порядков по сравнению с измерениями, полученными в контрольной группе (антибиотик отдельно или только свет).
Это очень важный результат, который может предложить решение лечения для этого типа устойчивых к антибиотикам бактерий. Тот факт, что несколько часов необходимы для того, чтобы получить эффективное уничтожение бактерий не снижает клинический потенциал этого подхода, поскольку предлагаемый лечение может быть включена в катетеров и других устройств, используемых в больнице. Например на рисунке 3 мы приводим пример разработан катетер, в коции в жидкости инжекционный канал существует множество отверстий, позволяющие одновременно диффундировать правильного освещения в инфицированные органа.
Количество выборок, используемых для статистики было 6 (был один или два случая некоторые из труб, которые были случайно загрязненные, а затем они были взяты из статистики). Значение р было ниже 0,05.
Обратите внимание, что мы не повторяли наших экспериментов для различных уровней концентрации антибиотиков. Во всех наших экспериментах концентрация была очень высокой. Причиной тому было лучше продемонстрировать силу нашего подхода, как будто в самой высокой концентрации бактерий все еще не было пострадавших от антибиотиков без подсветки и был уничтожен с подсветкой, она, очевидно, будет происходить на более низких концентрациях.
Один из обоснования для выбора длины волны освещения было выбрать длину волны, для которой bacteriи антибиотики являются прозрачными. Это показано на рисунке 4. Дополнительная мотивация для использования 532 нм лазера из-за его доступности в нашей лаборатории, и в связи с тем, что позволило также получить более высокие мощности освещения (по сравнению с обычным источником белого света со спектральными фильтрами), а также возможности настройки для питания и для временного поведения освещенности.
Рисунок 1. . Бактерии освещения настройки лазера в режиме непрерывной генерации Nd: YAG лазера или добротности импульсный Nd: YAG лазера. Слева можно увидеть изображение экспериментальной установки, в которой лазера разделяется между двумя трубами, одна с антибиотиками и без нее, для того, чтобы осветить оба в одинаковых условиях. Обе трубы позиции изд на мешалке. Схематическое изображение экспериментальной установки увидеть в правой части рисунка.
Рисунок 2. (А). Эффект непрерывного лазерного и гентамицина на P. палочки. Образцы освещенного светом непрерывного лазера (мощностью 100 МВт) с и без гентамицин (50 мкг / мл). Среднее из 3 экспериментов представлены. (Б). Влияние лазера с модуляцией добротности и гентамицина на синегнойной. Образцы освещались с модуляцией добротности лазерного излучения (1,65 МВт) с и без гентамицин (50 мкг / мл) на П. палочки жизнеспособность. Среднее из 3 экспериментов представлены.
4370/4370fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Предлагаемое устройство на базе катетер для биомедицинского лечения в отношении P. палочки. Точками на рисунке представляют светлые точки рассеяния света в результате чего к диффузии в обработанную ткань.
Рисунок 4 спектре поглощения (в а.е.) вокруг длине волны 532 нм для:. (А). Бактерии, (б). Гентамицин. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фототерапии области передовых междисциплинарных исследований в последние годы становится одним из перспективных подходов для лечения многочисленных заболеваний. В связи с этим использование света в видимом диапазоне была тщательно изучена. Например, было установлено, что инфицированные раны могут быть излечены более эффективно при воздействии на них интенсивный видимый свет для целей стерилизации. Механизм действия этого подхода было доказано, что посредством индукции светоиндуцированная радикалов кислорода (АФК), которые убивают бактерии 11.
Предыдущие исследования показали, 6 значительно выше количества АФК в бактерии освещении синим светом, чем те, индуцированных красного и ближнего инфракрасного света. Это объясняет, почему большинство свидетельств в литературе концентрируется на бактерицидный эффект синего света.
Другим недавним примером использования лазерного света для борьбы устойчивых бактерий было продемонстрировано KrespЯ и соавт. 12. В этом исследовании лазерной возникающей ударной волны технология была использована для искоренения биопленки. При использовании миниатюрного Q-Switched Nd: YAG лазера и тонкие волокна, специальные зонды генерируется плазма образование, которое производится Shockwave эффект. Авторы показали, что этот метод был в состоянии эффективно нарушить P. палочки биопленки в пробирке.
Подход, который мы представили в данном исследовании, была несколько иной 13, как мы попытались повысить эффективность не-фотосенсибилизатора антимикробного агента с помощью лазерного света. Наши результаты показывают, что при сочетании антибиотиков с подсветкой, антимикробную активность может быть существенно увеличена.
В самом деле, из полностью устойчивым фенотипом, наблюдаемые в один антибиотик бактерии стали чувствительны в присутствии антибиотика и легкой обработки. Механизм действия этого эффекта не ясна и требует дальнейшего ИССЛЕДОВАНИЕиона. Тем не менее, в электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) измерения, которые мы провели, чтобы изучить вопрос АФК генерируются во время лечения, никаких существенных различий между различными лечения не было получено 13. Эти результаты показывают, что эффект комбинированного лечения не требует АФК и различные механизмы должны быть рассмотрены. Можно предположить, что лечение светом изменяет проницаемость мембраны и в конечном итоге позволяет антибиотиков проникать в клетки бактерий, уступив свое убийство.
Хотя механизм действия полностью не изучены, наш подход выделить потенциал комбинированной терапии света с коммерческой антибиотиков, которые могут быть отброшены из-за противомикробное сопротивление в то время как при применении этой комбинации теперь могут быть повторно использованы эффективно в клиниках.
Очевидно, как отмечается в рукописи, освещенность в несколько часов нужно для того, чтобы EN Hance эффективность антибиотиков. Это действительно недостатком предложенного подхода. Реализация такого освещения могут быть получены, например, путем установки источника освещения внутри катетеров (как предлагает рис. 3). В дополнение к этому, если рана внешних специальные полосы, как штукатурка с источником освещения можно поставить на верхней части раны и осветить его в течение нескольких часов, например, в то время как пациент спит ночью. Если инфекция внутренних и пациент госпитализирован и он / она подключена к вливания в течение нескольких часов, в некоторых органах освещения канал, такой как эндоскоп или специального волокна можно подойти к органу и постоянно освещать его (с применяется лечение антибиотиками), когда пациент находится в больнице (так же, как вливание мешок соединен с пациентом в течение многих часов). Мы полностью согласны, что такой подход не является хорошим для лечения инфицированных органов в целом.
NT "> Обратите внимание, что в этой рукописи мы покажем преимущества предлагаемой методики для быстрой и практического применения, но для того, чтобы достичь этого другие исследования необходимы такие, как в естественных условиях эксперименты. исследования токсичности на фибробласты или эпителиальных клеток будет полезно, а Как показали исследования, которые продемонстрируют механизма функционирования предлагаемой терапии в бактериальных клетках не требуется. Кроме того в данной работе мы предположили, что под действием света изменений бактериальной мембраны, которая сделала его более проницаемым для антибиотика. Очевидно, все будет иначе в . клинических условиях, где бактериальные инфекции из-за биопленки Тогда есть две основные проблемы:. биопленки бактерий будут более устойчивы по сравнению с их коллегами планктонных и проникновения препаратов в биопленки масса будет ограничена Поэтому, исследуя эффекты света и гентамицина на П. палочки биопленки модели является целью нашего будущего исследования.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L.
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
