Et højt indhold screeningsmetode til identifikation af hidtil ukendte signalering kompetente transmembrane receptorer er beskrevet. Denne metode er muligt at foretage en storstilet automatisering og giver mulighed for forudsigelser om<em> In vivo</em> Proteinbinding og den sub-cellulære lokalisering af protein-komplekser i pattedyrceller.
Signaltransduktion ved vækstfaktorreceptorer er afgørende for celler at opretholde proliferation og differentiering og kræver nøje kontrol. Signaltransduktion initieres ved binding af en ekstern ligand til en transmembran-receptor og aktivering af downstream signaleringskaskader. En vigtig regulator af mitogene signaler er Grb2, et modulært protein sammensat af et indre SH2 (Src Homology 2) domæne flankeret af to SH3 domæner, som mangler enzymatisk aktivitet. Grb2 er konstitutivt associeret med GTPase-Son-Of-Sevenless (SOS) via sin N-terminale SH3 domæne. SH2-domænet af Grb2 binder til vækstfaktorreceptorer på phosphorylerede tyrosinrester dermed kobling receptoraktivering til SOS-Ras-MAP-kinase signalering kaskade. Desuden har andre roller for Grb2 som en positiv eller negativ regulator af signalering og receptor endocytose blevet beskrevet. Den modulære sammensætning af Grb2 tyder på, at det kan forankre til en række forskellige receptorer og transduce signalerer langs et væld af forskellige veje 1-3.
Beskrevet her er en simpel mikroskopi assay, der overvåger rekruttering af Grb2 til plasmamembranen. Det er tilpasset fra et assay, der måler ændringer i sub-cellulære lokalisering af grønt-fluorescerende protein (GFP)-mærkede Grb2 som reaktion på en stimulus 4-6. Plasmamembran-receptorer, der binder Grb2 såsom aktiveret epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) rekrutterer GFP-Grb2 til plasmamembranen efter cDNA-ekspression og efterfølgende flytte til endosomale rum i cellen. For at identificere in vivo protein-komplekser af Grb2, kan denne teknik anvendes til at udføre en genomet hele screening med højt indhold baseret på ændringer i Grb2 sub-cellulære lokalisering. Fremstillingen af cDNA-ekspressionsbiblioteker kloner, transfektion og billedoptagelse er beskrevet detaljeret nedenfor. Sammenlignet med andre genomiske metoder til at identificere protein-interaktion partnere, såsom gær-to-hybrid, denne teknik tillader visualisering af protein-komplekser i pattedyrceller ved subcellulære sted for interaktion med simpelt mikroskopi-baseret assay. Derfor både kvalitative egenskaber, såsom mønstre for lokalisering kan vurderes, og den kvantitative styrken af vekselvirkningen.
Ekspressionskloning er et stærkt værktøj, som er blevet anvendt i fortiden for at identificere hidtil ukendte cellulære komponenter, såsom virus-receptorer og blodlegemer antigener 12. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at lette identifikationen af hidtil ukendte putative signal transduktion receptorer, der binder til Grb2.
Der er nogle få kritiske trin i protokollen.
Grb2 translokation assay er blevet anvendt af andre grupper til at identificere inhibitorer med små molekyler af EGFR-kinase aktivering 6. I så fald er EGFR aktiveres specifikt med ligand forårsager rekruttering af Grb2 til plasmamembranen. Forstyrrelse af denne interaktion kan derefter undersøgt under anvendelse af små molekyler. Ligeledes kan det tænkes, at siRNA skærme kan anvendes til at identificere endogene gener involveret i EGFR-Grb2 signalering eller andre Grb2-bindende vækstfaktor-receptorer, såsom c-Kit eller erythropoietin-receptoren. Der er således flere potentielle anvendelsesmuligheder for denne teknik. En analog fremgangsmåde kan anvendes på GFP-mærkede reportersystemer for andre adaptormolekyler såsom Shc, Gab eller IRS.
En væsentlig fordel ved anvendelse af denne celle-baseret assay i pattedyrceller er, at den muliggør identifikation af fysiologisk relvante interaktioner. Analysen er en udlæsning for protein kompleks formation, men endnu vigtigere er de relevante interaktioner overvåges ved den korrekte sub-cellulær site. I denne forbindelse overvinder denne teknik artefakter fra andre protein-protein-interaktion metoder såsom gær-to-hybrid-eller in vitro-assays. Det skal dog bemærkes, at indirekte interaktioner også kan resultere i Grb2 rekruttering. Tilsvarende kan det transkriptionelle opregulering af bindingspartnere induceres af cDNA-ekspression. At skelne mellem disse muligheder, er det nødvendigt at foretage den nødvendige sekundære assays til at skelne mellem direkte og indirekte bindende virkning.
Som konklusion, lover GFP-adapter molekyle translokation assay stort potentiale for genom-dækkende screening og drug discovery applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Medical Research Council og Marie-Curie International reintegrationsstipendium ordning (til JKV).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |