有能な膜貫通型受容体のシグナリング小説を同定するためのハイコンテンツスクリーニング方法が記載されている。この方法は、大規模な自動化に適しているとの予測を可能にする<em生体内で></em>タンパク質の結合および哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の細胞内局在。
成長因子受容体によるシグナル伝達は、細胞が増殖と分化を維持するために不可欠であり、厳格な管理を必要とします。シグナル伝達は、膜貫通型受容体と下流シグナル伝達カスケードの活性化に外部リガンドの結合によって開始される。分裂促進シグナル伝達の重要な調節因子はGrb2は、酵素活性を欠いている2 SH3ドメインが隣接内部SH2(Src相同2)ドメインから成るモジュラー蛋白質である。 Grb2のは構成的にそのN末端SH3ドメインを介して、GTPアーゼソン·オブ·Sevenless(SOS)に関連付けられています。 Grb2のSH2ドメインは、このように、SOS-RAS-MAPキナーゼシグナル伝達カスケードに受容体の活性化を結合するリン酸化チロシン残基における成長因子受容体に結合する。また、シグナリングおよび受容体のエンドサイトーシスの正または負の調節因子としてGrb2のための他の役割が記載されている。 Grb2のモジュラー組成物は、受容体とtransducの様にドッキングできることを示唆している1月3日の異なる経路に沿って多数の電子信号。
ここで説明するには、形質膜へのGrb2の募集を監視する簡単な顕微鏡検査アッセイである。それが刺激に応答して、4月6日 、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きGrb2の細胞内局在の変化を測定するアッセイから適合させられます。 cDNA発現により細胞膜に、例えば活性化上皮成長因子受容体(EGFR)リクルート、GFP-Grb2のGrb2のように結合し、続いて細胞内のエンドソーム区画に再配置することを原形質膜受容体。 Grb2のin vivoでのタンパク質複合体で識別するために、この技術はGrb2の細胞内局在の変化に基づいてゲノムワイドな高コンテンツ画面を実行するために使用することができます。 cDNA発現クローンを、トランスフェクションおよび画像取得の調製は、以下に詳細に説明されています。このような酵母2-HYなどのタンパク質相互作用パートナーを識別するために使用される他のゲノム手法と比較して、BRIDは、この手法は単純な顕微鏡ベースアッセイによる相互作用のサブ携帯サイトで哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の可視化を可能にします。したがって、そのような局在化のパターンとして質的特徴は、同様に相互作用の定量的な強さとして、評価することができる。
発現クローニングは、このようなウイルス受容体および血液細胞抗原12のような斬新な細胞成分を同定するために、過去に使用されている強力なツールです。ここでは、Grb2のに結合する新規な推定シグナル伝達受容体の同定を容易にする方法を説明します。
プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。
Grb2の転座検定は、EGFRキナーゼ活性化6の小分子阻害剤を識別するために、他のグループによって使用されています。その場合には、EGFRは、具体的にリガンドが細胞膜にGrb2の動員を引き起こすで有効になります。この相互作用の崩壊は、その後、小分子化合物を用いて検討することができます。同様に、それは、siRNAスクリーンは、c-KITまたはエリスロポエチン受容体などのEGFR-Grb2のシグナリングまたは他のGrb2結合成長因子受容体に関与する内因性遺伝子を同定するために用いることができることを想定することができる。従って、この技術のために複数の潜在的用途がある。類似したアプローチは、Shcを、GABまたはIRSなどの他のアダプター分子のためのGFPタグレポーターシステムに適用することができる。
哺乳動物細胞で、この細胞ベースのアッセイを使用する大きな利点の1つは、それが生理的にrelの識別を可能にするということですevant相互作用。アッセイは、タンパク質複合体形成のために読み出していますが、より重要なのは、関連する相互作用が正しいサブ携帯サイトで監視されます。この点では、この技術は、酵母ツーハイブリッドまたはin vitroアッセイのような他のタンパク質-タンパク質相互作用の方法から成果物を克服しています。それは間接的な相互作用はまたGrb2の募集をもたらす可能性があること、しかし注意すべきである。同様に、結合パートナーの転写アップレギュレーションは、cDNA発現によって誘導することができる。これらの可能性を区別するためには、直接的および間接的な結合の効果を区別するために、適切な二次アッセイを行うことが必要である。
結論としては、GFP-アダプター分子転アッセイは、ゲノムワイドなスクリーニングや創薬アプリケーションのための高いポテンシャルをお約束します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、医学研究評議会とマリー·キュリー国際社会復帰グラント方式(JKVへ)によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |