Summary

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Published: October 16, 2012
doi:

Summary

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl gösterilmektedir<em> Ovo</emSpatiotemporally kontrollü bir RNA girişim ortaya microRNA tabanlı bir plazmid> elektroporasyon gelişen nöral tüp içinde commissural akson kılavuz araştırmak için kullanılabilir.

Abstract

Commissural DI1 nöronlar yoğun gelişim 1,2 sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları aydınlatmak çalışılmıştır. Bu nöronlar dorsal omurilikte bulunan ve basmakalıp yörüngeleri boyunca aksonları gönderebilirsiniz. Commissural akson başlangıçta yönünde ve daha sonra zemin plakası üzerinde ventral proje. Midline geçtikten sonra, bu aksonlar uzunlamasına beyin doğru keskin bir dönüş rostral ve proje yapmak. Bu adımların her biri çekici ve itici rehberlik ipuçlarının koordineli faaliyetler düzenlenir. Bu ipuçlarının doğru yorumlanmasını kendi sınırları çizilmiş yol boyunca akson rehberlik için çok önemlidir. Böylece, kılavuz commissural akson için belirli bir molekülün fizyolojik katkı ideal olarak canlı embriyo bağlamında incelenmiştir. Buna göre, in vivo gen demonte hassas dikkatle birden oynayabilir genlerin akson rehberlik faaliyetleri ayırt etmek için kontrol edilmelidirgelişimi sırasında rolleri.

Burada, bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde tavuk nöral tüp knockdown gen ekspresyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz 3 hücre tipine özgü yararlanıcı / Bir floresan protein marker ekspresyonu sürücü arttırıcılar, barındıran bir miR30-RNAi transkript 4 (cDNA floresan protein 3'-UTR içinde bulunan) (tarafından doğrudan takip roman plazmid vektörler kullanın Şekil 1). Gelişmekte olan nöral tüp içine electroporated, bu vektörlerin gen ifadesinin verimli baskılanması ortaya çıkarmak ve demonte 3 karşılaştığınız hücrelerin izleme doğrudan etkinleştirmek için parlak floresan işaretleyici proteinleri ifade. Elektroporasyon önce farklı RNAi vektörler Karıştırma omurilik bağımsız bölgelerinde iki ya da daha fazla genin eşzamanlı devirme izin verir. Bu hızlı bir şekilde, s, geliştirme aşamasında ele alınacak kompleks hücresel ve moleküler etkileşimler izin, uygu hassas ve ucuz. Açık kitap hazırlıkları 5 commissural akson yörünge Dii izleme ile birlikte, bu yöntem commissural akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vivo çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ilke olarak, herhangi bir hızlandıncı / kuvvetlendirici potansiyel olarak geliştirme 6 sırasında gen fonksiyonu in vivo çalışmaları için yöntem daha geniş çapta uygulanabilir hale kullanılabilir.

Bu video ilk nasıl işleneceğini gösterir ve pencere yumurta, nöral tüp içine DNA plazmid enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürü. Commissural akson rehberlik araştırmak için, spinal kord, açık-kitap hazırlanması gibi embriyo kaldırılır sabit ve akson yollar izlenebilir sağlamak için Dii ile enjekte edilir. Omurilik lamelleri arasına monte ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlandırılmaya çalışılır.

Protocol

1. Hücre tipine özgü gen susturma için RNAi Plazmit DNA'nın hazırlanması Plazmidler (Şekil 1), daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı 3,4 standart moleküler klonlama teknikleri kullanılarak sentez edilir. Vektörlere 1.1 Klon: oligonucelotide tasarım Aynı evrensel oligonükleotidler ve pRFPRNAiC vektör 4 (ARK-Genomik) ile sağlanan ürün bilgileri de tarif edilmiştir klonlama protokoller k…

Discussion

Bu basit, vektör tabanlı bir yapay stratejinin miRNA ifade tavuk nöral tüp içinde devirme endojen gen ekspresyonu için kullanılabilir. Bu fonksiyonel araçlar karmaşık bir gelişimsel yolların aydınlatılmasında kolaylaştırmak için, birden fazla gen susturulması, zamansal kontrolü ve hücre tipi özgüllük sunuyoruz. Plazmitler commissural nöronlar ya da kendi ara hedef, zemin plakası 3 devirme gen için kullanılır dolayısıyla ayrıntılı olarak,, commissural akson yönlendirme, bu pl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ES laboratuarında Çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından destekleniyor. Biz filme yardım için Dr bitirin Kunz teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
0.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B120F-4
Glass needle puller Narishige PC-10
Electroporator BTX ECM 830
Sylgard silicone elastomer World Precision Instruments SYLG184
Tungsten wire, 0.075 mm World Precision Instruments TGW0325
Insect pins, 0.20 mm Fine Science Tools 26002-20
Insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast DiI Molecular Probes D-7756
Fluorescent microscopes Olympus SZX12, BX51

References

  1. Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
  2. Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
  3. Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
  4. Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
  5. Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
  6. Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
  7. Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  9. Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
  10. Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
  11. Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
  14. Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
  15. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
  16. Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).

Play Video

Cite This Article
Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations. J. Vis. Exp. (68), e4384, doi:10.3791/4384 (2012).

View Video