Summary
Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras especies
Abstract
Las superficies mucosas, incluso en los tractos gastrointestinales, urogenitales y respiratorias, ofrecen puertas de entrada para los patógenos, como los virus y las bacterias 1. Mucosas también son sitios inductivos en el huésped para generar inmunidad contra los agentes patógenos, tales como las placas de Peyer en el tracto intestinal y el tejido linforreticular nasal asociada en el tracto respiratorio. Esta característica única hace inmunidad de la mucosa como actor fundamental del sistema de defensa del huésped. Muchos estudios se han centrado en los sitios de la mucosa gastrointestinal y respiratorio. Sin embargo, ha habido muy poca investigación de la reproducción sitios de la mucosa. La mucosa del tracto genital es el sitio de la infección primaria de las enfermedades de transmisión sexual (ETS), incluyendo infecciones bacterianas y virales. Las ETS son uno de los retos de salud más críticos que enfrenta el mundo hoy en día. Centros para el Control y Prevención de Enfermedades estima que hay 19 millones de nuevos infecciosas cada año en los Estados Unidos. STDs costar la salud de los EE.UU. sistema de atención de 17 mil millones dólares cada año 2, y los individuos de costes aún más en las consecuencias inmediatas de salud y larga vida. Para hacer frente a este reto, una mayor comprensión de la inmunidad de la mucosa reproductiva es necesaria y aislar linfocitos es un componente esencial de estos estudios. Aquí, se presenta un método para aislar reproducible linfocitos murinos de tractos genitales femeninos por estudios inmunológicos que pueden ser modificadas para la adaptación a otras especies. El método se describe a continuación se basa en un ratón.
Protocol
1. La eliminación del tracto genital
- Sacrificar al ratón con las directrices aprobadas. Hacer incisión media baja y retraer la piel.
- Aislar y retirar tracto genital completa, desde el oviducto de la apertura vaginal.
- Abrir todo el tracto longitudinalmente con unas tijeras.
- Cortar el tracto genital con tijeras quirúrgicas finas en piezas finas (aproximadamente <1 mm) en una placa de Petri con RPMI-10/EDTA completa (véase la fórmula a continuación) y se agita el tejido en un matraz de 125 ml a temperatura ambiente en un agitador magnético ajustado para 15 min. Este procedimiento se repite dos veces y luego el sobrenadante, que contiene epitelio y otros residuos, se descarta.
- Verter el contenido del frasco a través de un filtro de células (40μm). Limpie el residuo con EDTA medio completo.
Completa RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% suero bovino fetal (FBS), inactivado por calor, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de HEPES 1M.
RPMI-10/EDTA completa: 10% de RPMI (como anteriormente) con E 5μMDTA
2. La digestión de los tejidos del tracto genital
- Transferir las piezas de tejido a un nuevo matraz con 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (véase la receta a continuación) y digerir el tejido a 37 º C durante 1 hora en un agitador magnético ajustado a agitar vigorosamente el tejido.
Completa RPMI-10/collagenase: Justo antes de usar, reconstituir colagenasa tipo VIII (Sigma; almacenar a -20 ° C, o de acuerdo con las instrucciones del fabricante.), Añadir en RPMI/10 completa a una concentración final de 450-500U/ml. - Después de la primera digestión, recoger los sobrenadantes a través de filtro de células 100 micras, mantener las células en hielo.
- Transferir el tejido no digerido a un nuevo matraz y repetir el paso 2,1 dos veces más utilizando RPMI-10/collagenase completo fresco para un total de 3 digestiones separadas. En este punto, no visibles trozos de tejido debe estar en solución.
- Reunir los sobrenadantes todos juntos de una muestra y recoger a través de filtro de células 100 micras. Haga girar la cElls abajo. Los sedimentos celulares se separaron usando gradientes de Percoll.
3. La separación de las células del tracto genital utilizando gradientes de Percoll
- Preparar cada concentración de Percoll antes de su uso:
- 100% Percoll isotónico: mix 09:01 existencias Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH a 7,4 con HCl.
- 40% de Percoll solución: mezcla de 40 ml de Percoll isotónico 100% y 60 ml de RPMI completo.
- 70% de Percoll solución: mezcla de 70 ml de 100% de Percoll isotónico con 30 ml de RPMI completo.
- Resuspender cada sedimento de células de la etapa 6 en soluciones de Percoll 40%. Un volumen igual de 70% Percoll se usa para hacer los gradientes. Hay dos formas de configurar los tubos de gradiente:
- Bajo la capa de: añadir la suspensión celular con 40% de Percoll en un tubo de gradiente de primera, a continuación, cuidadosamente bajo la capa de Percoll 70%.
- El exceso de capa: añadir 70% de Percoll en un tubo primero, entonces lentamente y con cuidado cargar 40% de Percoll que contiene las células en laparte superior.
- Las muestras se centrifugaron gradiente @ 900 xg, a temperatura ambiente, durante 20 minutos con el freno desconectado.
- Los linfocitos será en la capa de interfase entre 40% y 70% de Percoll capas. Con cuidado, cosecha de la capa de interfaz, lavar con RPMI 1:3 y centrifugar a 740 xg. Los linfocitos estará en el sedimento celular y están listos para su uso posterior.
4. Los resultados representativos
Un ejemplo de aislamiento de linfocitos de ratón tracto genital y el análisis de citometría de flujo (FACS) se muestra en la figura 1. Tracto genital fue retirado de Chlamydia muridarum intravaginal ratón infectado 7 días después de la infección. Dos vías genitales se agruparon para tener suficientes linfocitos para el examen funcional y fenotipo por FACS. Tejidos disecados fueron procesados por la digestión y etapas de aislamiento como se indica anteriormente. La suspensión de células individuales se tiñeron para diversos conjugado a un fluorocromoanticuerpos monoclonales contra CD3 de ratón, CD4 y CD8. La Figura 1 muestra una presentación punto de parcelas de células T CD4 positivas frente a células T CD8 positivas CD3 cerrada en linfocitos T positivos. Nuestro procedimiento puede examinar los linfocitos aislados de los tractos genitales de los diferentes modelos de la enfermedad para evaluar diversas características de las células inmunes funcionales y fenotípicas en diferentes enfermedades en modelo de ratón. Estos incluyen diversas células del sistema inmune, tales como células dendríticas, neutrófilos, macrófagos NK, NKT, células T (Ag específico de células T), células B 3-10 etc.
Los linfocitos Figura 1. Fueron aisladas de las vías genitales de ratones infectados con Chlamydia muridarum, utilizando el método presentado aquí. Después de que el procedimiento de separación completa, los linfocitos se tiñeron con conjugados con fluorocromo CD3, CD4 y CD8. Los datos fueron cuadrante seleccionado para linfocitos CD3 +,mostrando CD4 + CD8 + frente y con el porcentaje de células cerradas.
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Discussion
En este protocolo, se muestra cómo preparar los linfocitos de ratón tractos genitales y se domina con facilidad. El punto más crítico de este proceso es la de mantener la viabilidad celular, manteniendo las células en hielo. El rendimiento celular de este método depende de la técnica, el manejo de la habilidad, el estado infeccioso del ratón (ingenua o días después de la infección), el patógeno (bacteria, virus hongos,) y la sección de la murina examinados tracto reproductivo (oviducto, útero, segmento vaginal o tracto genital completa). Nuestro grupo y otros han publicado diversos estudios en diferentes poblaciones de linfocitos de ratón tracto genital 5-7. En nuestras manos, de una ingenua ratón BALB / c, tracto genital completa puede generar 2 x 10 6 células con 90% de viabilidad. En muchas ocasiones, los linfocitos se utilizan para análisis de citometría funcional adicional y / o el flujo de 3-10. En comparación con el método de aislamiento de uso común 11, por nuestro método, el cell rendimiento se aumenta 10 veces. Este procedimiento es relativamente largo, pero puede simplificarse en función de la utilización posterior de los linfocitos aislados. Cuando las células se usan para no funcionales tales como ensayos de análisis de citometría de flujo, el método puede ser cortocircuitada por omitiendo el paso gradiente de Percoll. Este método proporciona un gran alcance y una herramienta eficaz para estudiar la mucosa linfocitos y proporcionar información sobre la investigación de enfermedades infecciosas, facilitar el desarrollo de vacunas posterior.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a las subvenciones del NIH para la financiación R01-AI026328 (KAK) y R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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