Summary
Un modo efficace per isolare i linfociti di topo tratto genitale è descritto. Questo metodo si avvale di digestione enzimatica e la separazione gradiente Percoll per consentire l'isolamento efficiente. Questa tecnica è anche adattabile a per l'uso in altre specie
Abstract
Superfici mucose, anche nel tratto gastrointestinale, urogenitale e respiratorio, fornire portali di ingresso per i patogeni, come virus e batteri 1. Mucose sono anche siti induttivi nell'ospite per generare immunità contro patogeni, come i cerotti Peyers nel tratto intestinale e nasale associata tessuto linforeticolare nel tratto respiratorio. Questa caratteristica unica porta immunità mucosale come un giocatore fondamentale del sistema difesa ospite. Molti studi si sono concentrati sui siti della mucosa gastrointestinale e respiratorio. Tuttavia, vi è stata piccola indagine riproduttivi siti mucosali. La mucosa del tratto genitale è il sito di infezione primaria per le malattie sessualmente trasmissibili (MST), comprese le infezioni batteriche e virali. Malattie a trasmissione sessuale sono una delle sfide più critiche per la salute di fronte al mondo di oggi. Centri per il Controllo e la Prevenzione stima che ci sono 19 milioni di nuovi infetti ogni anno negli Stati Uniti. STDs costato il sistema sanitario degli Stati Uniti 17 miliardi dollari ogni anno 2, e gli individui dei costi ancora di più in immediate conseguenze per la salute e per tutta la vita. Per far fronte a questa sfida, una maggiore comprensione di riproduzione immunità mucosale è necessario e isolare i linfociti è una componente essenziale di questi studi. Qui, vi presentiamo un metodo per isolare in modo riproducibile da linfociti murini vie genitali femminili per gli studi immunologici che possono essere modificati per adattarsi ad altre specie. Il metodo descritto di seguito è basato su un mouse.
Protocol
1. Rimozione del tratto genitale
- Eutanasia il mouse secondo le linee guida approvate. Fai incisione bassa linea mediana e ritrarre la pelle.
- Isolare e rimuovere tutto tratto genitale, da ovidotto all'apertura vaginale.
- Aprire l'intero tratto longitudinale con le forbici.
- Tagliare il tratto genitale con belle forbici chirurgiche in pezzi sottili (circa <1 mm) in una capsula di Petri con RPMI-10/EDTA completa (vedere la formula di seguito) e mescolare il tessuto in 125 ml matraccio a temperatura ambiente su un agitatore magnetico fissato per 15 min. Questa procedura viene ripetuta due volte e poi il surnatante, che contiene epitelio e altri detriti, viene scartato.
- Versare il contenuto del matraccio attraverso un colino cellula (40μm). Lavare i residui EDTA con terreno completo.
Completa RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% di siero fetale bovino (FBS), inattivato al calore, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml 1M HEPES.
Completa RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (come sopra) con E 5 micronDTA
2. La digestione dei tessuti del tratto genitale
- Trasferire pezzi di tessuto in un pallone nuovo con 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (vedi ricetta sotto) e digerire il tessuto a 37 ° C per 1 ora su un agitatore magnetico impostato agitare energicamente il tessuto.
Completa RPMI-10/collagenase: Giusto prima dell'uso, ricostituire collagenasi di tipo VIII (Sigma; conservare a -20 ° C, o secondo le istruzioni del produttore.), Aggiungere nel RPMI/10 completa ad una concentrazione finale di 450-500U/ml. - Dopo la prima digestione, raccogliere surnatanti con filtro da 100 micron delle cellule, mantenere le cellule in ghiaccio.
- Trasferire il tessuto non digerito in un pallone nuovo e ripetere il punto 2,1 per altre due volte utilizzando fresco RPMI-10/collagenase completo per un totale di 3 digestioni separate. A questo punto, non visibili pezzi di tessuto devono essere in soluzione.
- Piscina tutti i surnatanti insieme da un campione e raccogliere con filtro da 100 micron cella. Gira la cElls verso il basso. Pellet cellulari saranno separati utilizzando gradienti Percoll.
3. Separare le cellule del tratto genitale con gradienti Percoll
- Preparare ciascuna concentrazione di Percoll prima dell'uso:
- 100% isotonica Percoll: mix 9:01 magazzino Percoll (Pharmacia BiOTCH) vs 10x PBS. pH a 7,4 utilizzando HCl.
- Percoll soluzione al 40%: miscelare 40 ml di Percoll isotonico 100% e 60 ml di RPMI completo.
- Percoll soluzione al 70%: miscelare 70 ml del 100% Percoll isotonico con 30 ml di RPMI completo.
- Risospendere ogni pellet di cellule dal punto 6 in soluzioni Percoll 40%. Un volume uguale di Percoll 70% sarà utilizzato per fare i gradienti. Ci sono due modi per impostare i tubi di gradiente:
- Under-strato: aggiungi sospensione cellulare con il 40% in un tubo Percoll primo gradiente, poi accuratamente sotto-strato Percoll 70%.
- Over-strato: aggiungere 70% Percoll nel tubo, poi lentamente e con cautela carico massimo di 40% Percoll contenente le celle deltop.
- Gradiente campioni saranno centrifugati @ 900 xg, temperatura ambiente, per 20 minuti con il freno.
- I linfociti saranno al livello di interfaccia tra il 40% e strati di Percoll 70%. Cautela raccogliere il livello di interfaccia, lavare con RPMI 1:3 e spin down a 740 xg. I linfociti saranno nel pellet cellulare e sono pronti per un ulteriore uso.
4. Risultati rappresentativi
Un esempio di isolamento dei linfociti di topo tratto genitale e citometria a flusso (FACS) analisi è illustrato nella figura 1. Tratto genitale è stato rimosso da Chlamydia muridarum intravaginale del mouse infettato 7 giorni dopo l'infezione. Due vie genitali sono stati raggruppati insieme in modo da avere linfociti sufficienti per esame funzionale e fenotipo mediante FACS. Tessuti sezionati sono stati trattati con la digestione e passaggi di isolamento come descritto sopra. La sospensione singola cellula è stato colorato per vari fluorocromo coniugatoanticorpi monoclonali contro CD3 del mouse, CD4 e CD8. La figura 1 mostra una dot-plot presentazione di cellule CD4 positive T contro le cellule T CD8 positivi gate sui linfociti T CD3 positivi. La nostra procedura in grado di esaminare i linfociti isolati da vie genitali di modelli di malattia diversi per valutare diverse caratteristiche funzionali delle cellule immunitarie e fenotipica in malattie diverse in modello murino. Questi includono diverse cellule immunitarie, come le cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili NK, NKT, cellule T (Ag-specifiche cellule T), cellule B ecc 3-10.
Linfociti Figura 1. Sono stati isolati dal tratto genitale di topi infettati con Chlamydia muridarum, utilizzando il metodo qui presentato. Dopo la procedura di separazione completa, i linfociti sono stati colorati con fluorocromi coniugati CD3, CD4 e CD8. I dati erano quadrante gate sui linfociti CD3 +,mostrando CD4 + CD8 + con rispetto e la percentuale di cellule chiuse.
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Discussion
In questo protocollo, si mostra come preparare i linfociti da vie genitali del mouse ed è facilmente padronanza. Il punto più critico di questo processo è di mantenere la vitalità cellulare, mantenendo le cellule in ghiaccio. La quantità di cellule da questo metodo dipende dalla tecnica, manipolazione abilità, lo stato infettivo del mouse (ingenua o giorni dopo l'infezione), il patogeno (batterica, virale, fungina) e la sezione del tratto riproduttivo murino esaminati (ovidotto, utero, segmento vaginale o l'intero tratto genitale). Il nostro gruppo e altri hanno pubblicato vari studi su diverse popolazioni di linfociti di topo del tratto genitale 5-7. Sulle nostre mani, da un ingenuo topo BALB / c, l'intero tratto genitale in grado di generare 2 × 10 6 cellule con il 90% vitalità. In molte occasioni, i linfociti saranno utilizzati per ulteriori funzionale e / o analisi citometrica 3-10. In confronto con il metodo comunemente usato isolamento 11, il nostro metodo, il cell rendimento è aumentato 10 volte. Questa procedura è relativamente lungo, ma può essere semplificata secondo l'uso ulteriore dei linfociti isolati. Quando le cellule vengono usate per saggi non funzionali come l'analisi di citometria a flusso, il metodo può essere cortocircuitata saltando passo gradiente Percoll. Questo metodo fornisce un potente ed efficace strumento per studiare i linfociti della mucosa e permettono di percepire la ricerca sulle malattie infettive, facilitare lo sviluppo successivo vaccino.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ci piace ringraziare NIH per le sovvenzioni di finanziamento R01-AI026328 (KAK) e R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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