マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Summary

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である

Abstract

、消化器泌尿生殖器、及び気道では、このようなウイルスや細菌などの病原体¹のエントリのポータルを提供するなど、粘膜表面。粘膜は、腸管内Peyersのパッチや気道における鼻関連のリンパ網内系組織などの病原体に対する免疫を生成するために、ホストの誘導サイトです。このユニークな機能は、生体防御システムの重要なプレーヤーとしての粘膜免疫をもたらします。多くの研究は、消化器、呼吸器の粘膜部位に焦点を当てている。しかし、生殖粘膜部位の少し調査があった。生殖器の粘膜は、細菌やウイルス感染などの性感染症（STD）のための一次感染のサイトです。性感染症は、今日の世界が直面する最も重要な健康課題の一つです。疾病管理予防センターは、米国で19万人が新たに感染毎年があると推定している。 STDsは毎年²米国の医療システムを170億ドルを費用、および即時、生涯健康への影響のコスト個人一層。この課題に立ち向かうためには、生殖粘膜免疫のより深い理解が必要とされ、リンパ球を分離し、これらの研究の重要なコンポーネントです。ここでは、再現性、他の種への適応のために変更することができる免疫学的研究のためのマウス雌の生殖器官からのリンパ球を単離するための方法を提示する。以下に説明する方法は、1つのマウスに基づいています。

Protocol

1。生殖器の除去

1. 承認されたガイドラインを使用してマウスを安楽死させる。低正中切開を行い、皮膚を撤回。
2. 卵管から膣口に、全体の生殖管を分離し、削除します。
3. ハサミで縦管全体を開きます。
4. 完全RPMI-10/EDTAとペトリ皿の中で細かい部分（<約1mm）（下式参照）に微細手術用のハサミを持つ生殖器を切り取り、に設定マグネチックスターラー上で室温で125mlのフラスコ内の組織をかき混ぜる15分。この操作を2回繰り返し、その後上皮および他の残骸を含む上清は、破棄されます。
5. セルストレーナー（40μmの）を通してフラスコの内容物を注ぐ。完全培地でのEDTAの残留物を洗い流してください。
   熱不活化したRPMI 500ミリリットル（Gibco）を、10％ウシ胎児血清（FBS）、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5mlの1M HEPES：完全RPMI/10。
   完全RPMI-10/EDTA：10％5μMEとしたRPMI（同上）DTA

2。生殖器の組織を消化

1. 20ミリリットル新鮮RPMI-10/collagenase持つ新しいフラスコ（下のレシピを参照してください）​​に組織片を移し、精力的に組織をかき混ぜるように設定マグネチックスターラーで1時間37℃で組織を消化。
   完全RPMI-10/collagenase：使用前右、再構成するコラゲナーゼタイプVIII（σ; -20℃で保存するか、製造元の指示に従って）、450-500U/mlの最終濃度に完全RPMI/10に追加します。
2. 第一消化した後、氷上で細胞を維持し、100μmのセルストレイナーで上清を収集します。
3. 新しいフラスコに未消化の組織を移し、3つの別々の消化の合計のため新鮮な完全RPMI-10/collagenaseを使用して、ステップ2.1をさらに2回繰り返す。この時点で、目に見える組織片は、溶液中でないこと。
4. プールのすべてのサンプルから一緒に清と100μm細胞ストレーナーを通して収集しています。 cをスピンダウンells。細胞ペレットをパーコール勾配を用いて分離されます。

3。パーコール勾配を用いて生殖管細胞の分離

1. 使用前パーコールの各濃度を準備します。
   • 100パーセントアイソトニックパーコール：ミックス9時01株式パーコール（ファルマシアBiotch）対10倍のPBS。 HClを用いてpHを7.4にそれを。
   • 40パーセントPercol液：100％等張パーコールと完全RPMI 60mlの混合40ミリリットル。
   • 70％パーコール液：完全RPMI 30mlでミックス100パーセントアイソトニックパーコールを70ml。
2. 40％パーコールソリューションのステップ6から各細胞ペレットを再懸濁します。 70％パーコール等量の勾配を作るために使用されます。勾配管の設定には2通りの方法があります。
   1. 層の下で：慎重に下地層70％パーコールその後、最初の勾配管に40％パーコールと細胞懸濁液を追加します。
   2. 上層：最初のチューブに70％パーコールを追加して、慎重にゆっくりと上のセルを含む40％パーコールを読み込むトップ。
3. グラデーションのサンプルは、ブレーキをオフにして20分間、@ 900×gで、室温で遠心分離されます。
4. リンパ球は40％と70％パーコール層の間の界面層になります。慎重に、界面層を採取したRPMI午前1時03分で洗い、740 xgでスピンダウンします。リンパ球は、細胞ペレットにされ、さらに使用するために準備ができているでしょう。

4。代表的な結果

マウス生殖管及びフローサイトメトリー（FACS）分析からのリンパ球の分離の例を図1に示します。生殖器は7日、感染後膣内感染マウスクラミジアmuridarumから削除されました。二つの生殖器管をFACSによって、機能と表現型検査のための十分なリンパ球を持たせるために、一緒にプールした。上記で概説したように解剖した組織は、消化や離工程で処理された。単一細胞懸濁液は、様々な蛍光標識染色したマウスCD3、CD4およびCD8に対するモノクローナル抗体。図1は、CD3陽性Tリンパ球にゲートをCD8陽性T細胞に対するCD4陽性T細胞のドットプロットの表示を示しています。私たちの手順は、マウスモデルで異なる疾患で様々な免疫細胞の機能と表現型の特徴を評価するために、異なった疾患モデルの生殖器官から単離したリンパ球を調べることができます。これらには、樹状細胞などの多様な免疫細胞は、好中球、マクロファージ、NK細胞、NKT細胞、T細胞（抗原特異的T細胞）、B細胞等^3月10日が含まれ^ています。

図1：リンパ球はここに示す方法を用いて、 クラミジアmuridarumに感染したマウスの生殖器官から単離した。完全分離手順の後、リンパ球を蛍光標識、CD3、CD4およびCD8で染色した。象限データは、CD3 +リンパ球にゲートをかけたCD4陽性を示す+とCD8 +とし、ゲート細胞の割合。

Discussion

このプロトコルでは、マウスの生殖器管からのリンパ球を準備する方法を示されており、容易に習得されています。このプロセスの最も重要な点は、氷の上に細胞を保持することによって、細胞の生存率を維持することです。このメソッドから細胞収率は、スキル、マウスの感染状況（ナイーブまたは感染翌日）、病原体（細菌、ウイルス、真菌）及びマウス生殖器官検討のセクション（卵管、子宮を取り扱う、技術に依存膣のセグメントや全体の生殖管）。私たちのグループとその他のユーザーは^5月7日マウス生殖管異なるリンパ球集団で様々な研究を発表しました。我々の手で、1ナイーブBALB / cマウスから、全体の生殖器は90％の生存率で2×10 ^6個の細胞を生成することができます。多くの場面では、リンパ球をさらに機能的および/ ​​またはフローサイトメトリー解析^3月10日に使用されます。本手法により、一般的に使用される単離法^11、CEとの比較でllの収率は10倍に増加しています。この手順では、比較的長いですが、それは孤立したリンパ球のさらなる用途に応じて簡略化することができます。細胞は、フローサイトメトリー分析などの非機能アッセイのために使用された場合、このメソッドはパーコール勾配ステップを省略して短絡することができます。この方法は、粘膜リンパ球を研究し、感染症研究への洞察を提供し、その後のワクチン開発を容易にするための、強力で効率的なツールを提供しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Sigma Life Sciences	C2139-1G
Percoll	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0891-01
RPMI1640	Gibco by Life Technologies	11875