Summary
Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de outros
Abstract
Superfícies mucosas, inclusive no trato gastrointestinal, urogenital e respiratória, fornecer portas de entrada para patógenos, como vírus e bactérias 1. Mucosas são também locais indutivos no hospedeiro para gerar a imunidade contra os agentes patogénicos, tais como as manchas Peyers no tracto intestinal e do tecido nasal associada linforreticular no trato respiratório. Esta característica única traz a imunidade da mucosa como um jogador crucial do sistema de defesa do hospedeiro. Muitos estudos têm sido focados na gastrointestinais e respiratórias mucosas. No entanto, tem havido pouca investigação de reprodução mucosas. A mucosa do trato genital é o local da infecção primária de doenças sexualmente transmissíveis (DST), incluindo infecções bacterianas e virais. DSTs são um dos maiores desafios de saúde mais críticos que o mundo enfrenta hoje. Centros para Controle e Prevenção de Doenças estima que existem 19 milhões de novos a cada ano infecciosas nos Estados Unidos. STDs custar os EUA sistema de saúde 17000000000 dólares a cada ano 2, e indivíduos de custos ainda mais em conseqüências imediatas e de saúde ao longo da vida. Para enfrentar este desafio, uma maior compreensão da imunidade da mucosa reprodutiva é necessária e isolar linfócitos é um componente essencial destes estudos. Aqui, apresentamos um método para isolar reproduzível linfócitos de murinos trato genital feminino para estudos imunológicos que podem ser modificados para adaptação a outras espécies. O método descrito a seguir é baseado em um rato.
Protocol
1. A remoção do tracto genital
- Euthanize o mouse utilizando as diretrizes aprovadas. Fazer incisão na linha baixa e retrair a pele.
- Isolar e remover trato genital todo, do oviduto da abertura vaginal.
- Abrir todo o trato longitudinalmente com uma tesoura.
- Cortar o tracto genital com finas tesouras cirúrgicas em pequenos pedaços (cerca de <1 mm) numa placa de Petri com RPMI-10/EDTA completo (ver a fórmula seguinte) e agita-se o frasco de tecido em 125 ml à temperatura ambiente num agitador magnético definido para 15 min. Este procedimento é repetido duas vezes e, em seguida, o sobrenadante, que contém o epitélio e outros detritos, é descartada.
- Despeje conteúdo do balão através de um filtro celular (40μm). Lavar resíduo EDTA com meio completo.
RPMI/10 completo: RPMI 500 ml (Gibco), 10% de soro fetal bovino (FBS), inactivado pelo calor, 5 ml penicilina / estreptomicina, a 5 ml de HEPES 1M.
RPMI-10/EDTA completo: RPMI a 10% (como acima) com E 5mMDTA
2. Digerir tecidos do trato genital
- Transferir pedaços de tecido para um frasco novo, com 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (ver receita abaixo) e digerir o tecido, a 37 ° C durante 1 hora num agitador magnético definido para agitar vigorosamente o tecido.
RPMI-10/collagenase completo: Pouco antes de utilização, reconstituir colagenase tipo VIII (Sigma; armazenar a -20 ° C, ou de acordo com as instruções do fabricante.), Adicionar em RPMI/10 completo até uma concentração final de 450-500U/ml. - Após a digestão em primeiro lugar, recolher os sobrenadantes através de 100 células coador um, manter as células em gelo.
- Transferir o tecido não digerido para um novo frasco e repetir a etapa 2.1 por mais duas vezes, utilizando RPMI-10/collagenase completo fresco para um total de três digestões separadas. Neste ponto, há pedaços de tecido visível deve estar em solução.
- Piscina os sobrenadantes todos juntos a partir de uma amostra e recolher a 100 filtro célula iM. Gire a cElls para baixo. Os sedimentos celulares irão ser separados usando gradientes de Percoll.
3. Separação de células do tracto genital, utilizando gradientes de Percoll
- Preparar cada concentração de Percoll antes do uso:
- 100% de Percoll isotônica: mix 09:01 estoque Percoll (Pharmacia Biotch) vs PBS 10x. pH a 7,4 com HCL.
- Solução de Percoll a 40%: misturar 40 mL de Percoll isotónico 100% e 60 ml de meio RPMI completo.
- Solução de Percoll a 70%: misturar 70 mL de Percoll isotónico 100%, com 30 ml de meio RPMI completo.
- Ressuspender cada pelete de células a partir do passo 6 em soluções de Percoll 40%. Um volume igual de Percoll a 70% irá ser utilizado para fazer os gradientes. Há duas maneiras de configurar tubos de gradiente:
- Sob-camada: adicionar a suspensão de células com 40% de Percoll em um tubo de gradiente em primeiro lugar, em seguida, cuidadosamente sob-camada de Percoll 70%.
- Ao longo da camada de: adicionar Percoll a 70% num tubo de um lado, em seguida lenta e cuidadosamente carregar Percoll a 40%, contendo as células nasuperior.
- Amostras de gradiente vai ser centrifugadas a 900 xg à temperatura ambiente, durante 20 minutos com o freio.
- Os linfócitos será na camada de interface entre 40% e 70% de camadas Percoll. Cuidadosamente colher a camada de interface, lave com RPMI 1:3 e girar a 740 xg. Os linfócitos será no sedimento de células e estão prontos para utilização posterior.
4. Resultados representativos
Um exemplo de isolamento de linfócitos a partir do tracto genital rato e análise de citometria de fluxo (FACS) é mostrado na Figura 1. Tracto genital foi removido de Chlamydia muridarum intravaginalmente rato infectado 7 dias após a infecção. Duas vias genitais foram agrupados em conjunto de modo a ter um número suficiente de linfócitos exame funcional e fenotípica por FACS. Tecidos dissecados foram processados pela digestão e passos de isolamento como descrito acima. A suspensão de células isoladas foram corados com vários conjugados com fluorocromosOs anticorpos monoclonais contra CD3 de ratinho, células T CD4 e CD8. A Figura 1 mostra uma apresentação dot-plot de CD4 células T positivas contra as células T CD8 positivas gated em linfócitos T CD3 positivas. Nosso procedimento pode examinar linfócitos isolados do trato genital de modelos de doenças diferentes para avaliar várias características de células imunes funcionais e fenotípica em diferentes doenças no modelo do rato. Estes incluem diversas células imunes, tais como células dendríticas, neutrófilos, macrófagos NK, NKT, células T (células T específicas Ag), células B, etc 3-10.
Linfócitos Figura 1. Foram isolados a partir de trato genital de camundongos infectados com Chlamydia muridarum, utilizando o método aqui apresentado. Após o processo de separação completa, os linfócitos foram coradas com fluorocromo-conjugados CD3, CD4 e CD8. Os dados foram quadrante fechado em linfócitos CD3 +,mostrando CD4 + versus CD8 + com e porcentagem de células fechadas.
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Discussion
Neste protocolo, é mostrado como preparar linfócitos no trato genital de mouse e é facilmente dominado. O ponto mais crítico deste processo é o de manter a viabilidade das células, mantendo as células em gelo. O rendimento de células a partir deste método depende da técnica, a manipulação de habilidade, o estado infeccioso do rato (ou ingénuo dia após a infecção), o agente patogénico (bacterianas, virais, fúngicas) e da secção do tracto reprodutivo murino examinados (oviduto, útero, segmento vaginal ou do trato genital inteira). Nosso grupo e outros têm publicado vários estudos em diferentes populações de linfócitos do trato genital rato 5-7. Em nossas mãos, a partir de um ingênuo rato BALB / c, o tracto genital inteiro pode gerar 2 × 10 6 células com viabilidade de 90%. Em muitas ocasiões, os linfócitos serão utilizados para mais funcional e / ou a análise de citometria de fluxo de 3-10. Em comparação com o método de isolamento de uso geral 11, por o nosso método, a cerendimento ll é aumentada 10 vezes. Este procedimento é relativamente longo, mas pode ser simplificado de acordo com a posterior utilização dos linfócitos isolados. Quando as células são utilizadas para ensaios não funcionais, tais como a análise de citometria de fluxo, o método pode ser curto saltando passo do gradiente de Percoll. Este método fornece uma poderosa e uma ferramenta eficiente para estudar linfócitos da mucosa e fornecer informações sobre pesquisa de doenças infecciosas, facilitar o desenvolvimento da vacina subseqüente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer NIH para bolsas de financiamento R01-AI026328 (KAK) e R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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