Summary
Этот протокол представляет собой полный и подробный порядок применения РНК-след, мощный следующего поколения секвенирования ДНК технологии, профиль transcriptomes в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток с лечением или без тромбина. Этот протокол является обобщением различных клеток или тканей под влиянием различных реагентов или болезненных состояний.
Protocol
Блок-схема изложением этот протокол отображается на рисунке 1.
1. Обработка клеток тромбина, РНК изоляции, оценке качества и количественной оценки РНК
- Культура легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HMVEC-LBL) до 90-100% слияния в 6-луночные планшеты в EGM-2 среды с 5% FBS, факторы роста и антибиотиков (Lonza, кошки # CC-3202).
- Изменение средств массовой информации к голоду СМИ (0% FBS) 30 мин до начала лечения с тромбином.
- Относитесь к клеткам с 0,05 ЕД / мл тромбина или оставить необработанными в качестве контроля в течение 6 часов при температуре 37 ° C и 5% CO 2.
- Изолировать общей РНК из обработанных и контрольных клеток с использованием Ambion мир Vana комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
- Оценить качество РНК эукариот Experion чип StdSense РНК в соответствии со стандартным протоколом на Experion Автоматизированная станция электрофореза (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Количественная РНК с использованием стандартного спектрофотометрического метода.
2. Строительство библиотеки и последовательности
- Используйте 1 мкг высокого качества общей РНК в образце исходного материала.
- Чтобы построить библиотеку, выполните стандартную процедуру от Illumina (протокол № 15008136 Rev. A). В этом протоколе двух раундов поли (А), содержащий выборы мРНК выполняется для удаления рРНК, чтобы свести к минимуму последовательности рРНК.
- Оценить качество библиотек с использованием ДНК-чипов Experion 1K в соответствии со стандартом протокола о электрофореза Experion Автоматизированная станция ( www.bio-rad.com ).
- Количественная библиотеки с помощью КПЦР: Используйте библиотеку, которая ранее была последовательной в качестве стандартной кривой и праймеров, специфичных для лигированную адаптеров. Использование диапазона разведений неизвестные библиотеки (1:100, т.е., 1:500 и 1:1000). Запустите КПЦР АККОrding к протоколу SyberGreen ММ и расчета исходной концентрации запасов каждой библиотеке.
- Развести библиотечных фондов до 10 нм и хранят при температуре -20 ° C до готовности кластера потоке клеток.
- Когда все будет готово к кластеру проточной ячейки, растопить CBOT пластины реагента на водяной бане. CBOT является Illumina инструмент, используемый для упорядочения процесса генерации кластеров.
- Вымойте CBOT инструмента.
- Денатурации библиотеках: Объединить 13 мкл 1x TE и 6 мкл 10 мкМ библиотеки и, на стороне трубки, добавить 1 мкл 1 N NaOH (при условии, Illumina). Vortex, спин вниз, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и поместить денатурированный библиотеки на льду.
- Развести библиотеках: Развести денатурированный библиотек с предварительно охлажденным гибридизации буфер (HT1, предусмотренных Illumina), объединяя 996 мкл HT1 и 4 мкл денатурированный библиотека для конечной концентрации 12 вечера. Поместите денатурированный и разводненной библиотеки на льду.
- Обратить каждого ряда труб пластины CBOT,обеспечение того, чтобы все реагенты оттаивают. Спином вниз пластину, снять / прокол фольги уплотнения и загрузить на CBOT.
- Алиготе 120 мкл разбавленного, денатурированный библиотеки полосу трубки, с номерами 1-8. Добавить 1,2 мкл разведенного, денатурированный управления PhiX библиотеке (от Illumina) в каждую пробирку как шип-контроль. Vortex и спином вниз трубы и загружать их на CBOT в правильной ориентации (труба № 1 справа).
- Загрузите ячейку потока и многообразия на CBOT.
- Выполните проверку расхода и начать кластеризации перспективе.
- После запуска завершена, проверьте реагента Доставка по всей полосы. Обратите внимание на любые отклонения от нормы. Либо начать последовательность выполнения сразу или хранить проточной ячейки в предоставленной трубки при 4 ° C.
- Оттепель последовательности через синтез (SBS, Illumina) реагентов.
- Загрузка реагентов в соответствующие места на реагентов лотков, стараясь не прикасаться к другим реагентам после прикосновения к расщеплению смеси.
- Использование неп-последовательности потока ячейки (т.е. тот, который был секвенирован ранее), премьер-линии реагента в два раза.
- Тщательно очистите последовательности проточной ячейки с 70% этанола и Kimwipes, а затем 70% этанола и линзы бумаги. Осмотрите проточной ячейки для любой полосы. Повторно очистить его в случае необходимости.
- Загрузите проточной ячейки на секвенсор и выполнять потока убедитесь, что уплотнение между многообразия и проточной ячейки плотно.
- Начало последовательности запуска.
- Оценка показателей качества (например, кластер плотность кластеров проходящего фильтр, Q30, интенсивность) по мере их появления во время бега.
- Мониторинг интенсивности по всему перспективе.
- После 101 циклов завершен, выполнить поворот химии для завершения второй следующего содержания: Оттепель парных конце реагентов и второго буфера регистрации чтения (ICB, компоненты SBS реагентов, Illumina) и загружать реагенты.
- Продолжите последовательность выполнения, оценка 2-й читать интенсивности, Q30й другие показатели качества выполнения прогрессирует.
3. Анализ данных
- Используйте последние версии CASAVA (Illumina, в настоящее время 1.8.2), чтобы преобразовать базу вызова файлов (. BCL) файлы. Fastq файлов, установка fastq-кластера счетом 0, чтобы создание единого файла fastq для каждого образца . Распакуйте fastq файлы для последующего анализа.
- Выполните парный конце трассы с использованием последних версий TopHat (1.4.1) 5, который присоединяется РНК-след читает млекопитающего размером генома использованием сверхвысокой пропускной короткие выравниватель для чтения (Bowtie, 0.12.7) 6 и SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools реализует различные утилиты для пост-обработки рядов в формате SAM. Ссылка человека транскриптом могут быть скачаны с iGenomes ( www.illumina.com ). В беге TopHat, мы использовали все стандартные параметры настройки, включая выбор типа библиотеки, как FR-unstranded (по умолчанию).
- НамING программы CuffDiff, часть запонки (1.3.0) 8 пакет программного обеспечения, сравнить тромбин-обработанных клеток с контролем клетки, чтобы отсеивать разному экспрессируются генов транскрипты в бывшем основана на человека транскриптом ссылки. Это сравнение определяет дифференциальное выражение известно стенограммы. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в виде таблицы. В беге запонки программы, мы использовали все настройки параметров по умолчанию. Те, ген стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются.
- Для обнаружения новых изоформ, запустить запонки без ссылки транскриптом. Сравните примеры файлов стенограмму, чтобы референсного генома использованием Cuffcompare и проверить дифференциальные выражения с Cuffdiff с использованием комбинированного файла стенограмме тромбина в качестве опорного генома для одного анализа и комбинированный контроль расшифровка файлов в качестве опорного генома для второго анализа. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в табличной форме. Опять же, тыс.электронной гена стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются. После этого шага, следователи могут выбрать, чтобы загрузить список вновь зарегистрированных стенограммы на сайте УСК браузера генома ( http://genome.ucsc.edu/ ) для проверки их достоверности по ручного досмотра.
- Представьте списки разному экспрессируются гены изобретательность анализа путей (IPA, www.ingenuity.com ) для характеристики гены и пути, пострадавших от лечения тромбина. На данном этапе следователи могут решить использовать пояс ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), пакет R, который разработан, чтобы помочь и упростить задачи анализа запонки РНК-след выходных, чтобы помочь управлять, визуализировать и интегрировать все данные, полученные с помощью анализа Cuffdiff.
4. Проверка РНК-последующие результаты по Количественные в режиме реального времени-Polymerase цепной реакции (QRT-PCR)
- Выполните полной изоляции РНК из управления и тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток, РНК оценки качества и РНК количественного описано в шагах от 1,4 до 1,6.
- Создание комплементарной ДНК от 1 мкг суммарной РНК каждого образца с индексом III Первый Strand Синтез системы Комплекты РТ, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, 18080-051).
- Выполните QRT-PCR анализа Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System использованием Taqman анализа по требованию предназначен олигонуклеотидов для выявления CUGBP, ELAV-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor связанных фактор 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) и β-актин (ACTB, Hs99999903_m1). Каждый образец был шаблон эквивалентно 5 нг общей РНК. Измерьте количественного использования DDCT метод и нормализовать β-актина. Каждый тест проводился по крайней мере, три биологических повторностях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для Шаг 1: 28s: 18 лет соотношение традиционно используется как показатель деградации РНК. В идеале, 28s пика должны быть примерно в два раза площадь 18 лет группе (соотношение 2), однако это идеальное соотношение часто не видел на практике. Кроме того, 28s: 18 лет соотношение получается из спектрофотометрический методы могут недооценивать количество деградации РНК. Для более точной количественной деградации, и, следовательно, качества образцов РНК, система Experion рассчитывает показатель качества РНК (RQI) номер. Алгоритм RQI сравнивает electropherogram образцов РНК данным ряда стандартизированных, деградированных образцов РНК и автоматически возвращает число от 10 (нетронутым РНК) и 1 (деградировали РНК). Качество РНК должна иметь RQI по крайней мере 7, в идеале больше 8. Рисунке 2 показан Experion результатов с помощью высококачественной РНК образца с RQI 8,4.
ДляШаг 2: библиотеки должны иметь широкую полосу примерно в 250-300 б.п. На рисунке 3 показана Experion результаты высокого качества библиотеке Рисунок 4 показывает КПЦР результатам стандартных образцов кривой и одного неизвестного образца (показан в темно-синий)... Ход и качество выполнения последовательности должны постоянно наблюдаться по всему выполнения На рисунке 5 показано соответствующее плотности кластера на первом этапе визуализации цикла;., Это первый признак перспективе качества. Кластеры должны быть яркими и целенаправленной. Рисунке 6 показан первый доклад базы, созданные после первого цикла завершена. Это важно для оценки предполагаемой плотности кластера, уровни интенсивности, качества и фокус в этой точке. Следующий контрольно-пропускном пункте качества, после цикла 4, показано на рисунке 7. Это показывает абсолютную плотность кластеров для каждой полосы. Кластере плотность не должна быть выше 850 К / мм 2. После цикла 13,фазировка (когда база не добавляется в ходе цикла) и prephasing (когда две базы добавляется в течение цикла) Статистика рассчитывается, как показано на рисунке 8. Типичные числа между 0,1 и 0,25. Основные оценки качества возможно после цикла 24, когда несколько показателей качества рассчитывается. Процентов читает выше Q30, как показано на рисунке 9, является мерой доверия к базе призвание. Чтение со счетом Q от 30 означает, что 1 из 1000 шансов, что база вызов неправильно. Q баллов будет уменьшаться по мере выполнения прогрессирует, но должны начать с более чем 95% читает соответствуют или превосходят Q30. Кластеров прохождение фильтра (ПФ), как показано на рисунке 10, являются кластеры, из которых фактические данные последовательности будут приняты. В идеале это должна быть выше 85%. Кластеров PF зависит от многих факторов, включая постепенный, prephasing, интенсивность и Q30. Он не будет меняться по мере выполнения прогрессирует. Процентов выровнены ( Для Шаг 3: В таблице 1 представлены выразил генов и изоформ в контрольной группе и тромбин обращение человека легочных капилляров эндотелиальных клеток. Примечательно, что около 26000 новых изоформ обнаружено, что свидетельствует о силе РНК-след-это может идентифицировать неизвестные РНК, альтернативного сплайсинга транскриптов и использования альтернативных промоутер, которые не обнаруживаются микрочипов методы 3. РНК-след может также измерять менее обильными стенограмм, которые неточно количественно или не обнаруживается микрочипов. Рисунке 12 и в таблице 2 дисплея differentiallУ выразили генов в сигнальный путь тромбина. Это пример третьего поколения база знаний управляемые пути анализа 9: путь топологии подходы, используя изобретательность анализа путей распространения программного обеспечения. Это показывает, что шесть часов тромбина лечения значительно выше регулирует тромбина Par рецептор 4 и вниз регулирует тромбина Par рецептора 3 пока нет изменений в экспрессии рецептора тромбина Номинал 1. Выражение NFKB1, NF kb2 и Src также значительно выше, регулируется. Некоторые из генов Rho семьи (Rho B, C, F и G) являются до-регулируется в то время как другие (Rho J, Q, T1, U и V) упали на регулируемые (табл. 4). Миозин ген легкой цепи 9 (MYL9) является до-регулируется в то время как MYL12B подавляется. Экспрессии других генов либо вниз регулируемых или не влияет. Для Шаг 4: Для проверки РНК-последующие результаты с помощью альтернативного подхода, мы провели QRT-PCR эксперимента для анализа три Diff #Аренда генов (рис. 13). В РНК-последующие данные, TRAF1 был до-регулируется 7,96 раза; CELF1 было вниз регулируется на 1,16 раза, а FANCD2 подавлялась на 1,70 раза. В QRT-PCR данным, эти соответствующего числа 7,25 раза, -1,15 -2,07 раза и раза соответственно. Результаты этих трех генов анализировали с помощью РНК-след и QRT-PCR находятся в хорошем согласии, что подтверждает РНК-последующие результаты. Таблица 1. Gene / изоформы Выражение Резюме *. Этой таблице перечислены генов, известных изоформ и новые изоформы выражается в контроле и тромбин обращение HMVEC-LBL клеток. Раз изменение соотношения тромбина FragmentsPerKilobase стенограммы perMillion фрагменты отображаются (FPKM) для управления FPKM. Эти гены, известные изоформы и новые изоформы с 2-кратным или больше разница между двумя группами статистически имеют различные уровни экспрессии (как определено после Benjamini-Hochberg коррекции). * В данной таблице приводится из таблицы 2 в ссылке 4. Таблица 2. Дифференциально экспрессируются гены и изоформ в Pathway Тромбин сигнализации *. * В данной таблице приводится таблица из S4 в номер 4 с незначительными изменениями. **, Q-значение, ложных открытий регулировать значение р. 93/4393fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/> Гены Управление Тромбин Всего генов, 16636 16357 Контроль только 783 Тромбин только 504 Up-регулируемые (2-раза или больше разница) 152 Down-регулируется (2-кратное или гreater разница) 2190 Известные Изоформы Управление Тромбин Всего известно изоформ Выразил 26807 26300 Контроль только 1492 Тромбин только 985 Up-регулируемые (2-раза или больше разница) 480 Down-регулируется (2-раза или больше разница) 3574 Роман Изоформы Управление Тромбин Всего изоформ Роман выраженные 25880 25886 Контроль только 418 Тромбин только 424 Up-регулируемые (2-раза или больше разница) 1775 Down-регулируется (2-раза или больше разница) 12202 Down-регулируемых генов Обозначение гена Общая кратное изменение Пользователи Индивидуальные кратное изменение q_value ** FPKM управления FPKM Тромбин PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Гай -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-белок альфа- -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Рас- -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 AKT3 -1,77 0 15,8228 8,94223 МЛКП -2,38 PPP1CB -2,10 0 39,585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCK -3,68 ROCK1 -3,54 0 19,5921 5,53112 ROCK2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CAMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10,296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Up-регулируемых генов Символ Общая кратное изменение Пользователи Индивидуальные кратное изменение q_value ** FPKM управления FPKM Тромбин PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-Кб 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Частичное Up-/Partial Down-регулируемых генов Символ Общая кратное изменение Пользователи Индивидуальные кратное изменение q_value ** FPKM управления FPKM Тромбин G-белком гамМассачусетс 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27,192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770,922 1011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112,397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-белка бета- 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137,786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho ГЭФ -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36,758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Банкомат -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RhoB 1,31 9.48429E-06 232,232 304,587 RHOC 1,38 458,267 630,235 RHOF 1,65 0 8,29676 13,7268 RhoG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127,446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872,075 608,472 MYL9 1,48 0 202,636 299,559
Рисунок 1. Блок-схема протокола для РНК-след профилирования тромбин-опосредованной транскриптом в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток. Во-первых, лечить и изолировать клетки и количественно РНК. Подготовка библиотеки из высококачественной РНК и оценить их концентрацию (через КПЦР) и качество (через bioanalyzer), то кластер на потоке клеток. Начало последовательности запуска и анализа качества выполнения на всей территории. Основные контрольно-пропускных пунктов качества циклов 1, 4, 13 и 24. Использование CASAVA, конвертировать файлы в BCL fastq файлы, а затем выровнять тех генома с TopHat. Обнаружение известных и неизвестных изоформ использованием запонки и определить дифференциальные выражения с CuffDiff. Просмотр выходных файлов в Excel и отфильтровать генов, которые есть выражение уровне менее 0,05 FPKM или р-значение большее, чем 0,05. Добавить остальные гены изобретательность Анализ Путь для получения дополнительной информации о функциях генов и путейffected по лечению тромбина. Как правило, подобранный набор разному экспрессируются гены подтверждено альтернативного подхода, таких как QRT-PCR.
Рисунок 2. Репрезентативной выборке РНК с RQI на 8,4, как проанализированы Experion Автоматизированная станция электрофорез) отдельных следов высокого качества РНК -.. Оси х показывает время и оси у изображает флуоресцентный сигнал B) виртуальное изображение геля из высококачественных образцов РНК. Интенсивность 28S пик больше, чем пик 18S и никакого загрязнения не наблюдается. Обе группы имеют острые края и определены. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Высокое качество библиотеку получали из РНК в качестве проанализированы Experion Автоматизированная станция электрофореза широкого пика между 250 и 300 б.п. обнаружено и никаких высокого молекулярного веса ДНК (ДНК загрязняющих) наблюдается) отдельных следов высококачественная библиотека.. - оси х показывает время и оси у изображает флуоресцентный сигнал B) виртуальная картинка гель высокого качества библиотеке. Широкого пика между 250 и 300 б.п. обнаружено и никаких высоким молекулярным весом ДНК (ДНК загрязняющих) не наблюдается. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
<сильная> Рисунок 4. КПЦР результатов с помощью SyberGreen и праймеров, специфичных для Illumina лигированную адаптеров. ранее кластеризованных библиотека используется в качестве стандартной кривой для определения оптимальной концентрации кластеризации для вновь подготовленных библиотекой. Разбавления неизвестные библиотека входит в стандартную концентрацию кривой. Стандартные образцы кривой предъявлено обвинение стрелки и неизвестного образца темно-синего цвета, а также указано стрелкой.
Рисунок 5. . Соответствующие плотности кластера на первом этапе визуализации цикл кластеров ясно, целенаправленной и яркие) базы;. B) Base C, C) База G, D) Base T.
Метрика | Lane 1 | Переулок, дом 3 | Lane 4 | Lane 5 | Переулок, 6 | Переулок 7 | Lane 8 | |
Плотность кластера (к / мм 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
Интенсивность | 25870,5 | 23886 | 23891,38 | 23735,83 | 23949,38 | 24933,08 | 24305,79 | 23950,29 |
C интенсивность | 21559,62 | 19822,33 | 19759,33 | 19472 | 19954,21 | 20611,75 | <TD> 1989219438,29 | |
G Intensity | 13619,46 | 11756,67 | 11486,44 | 10498,38 | 12186,62 | 12195,5 | 11826,88 | 11010,5 |
T Intensity | 19402,67 | 17663,79 | 17854,42 | 17353,75 | 17545,54 | 18060,67 | 18457,92 | 17397,12 |
Фокус Оценка | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
C Фокус Оценка | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
G Фокус Оценка | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
T Фокус Оценка | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Рисунок 6. Первый доклад базы, созданные после первого цикла завершена. Кластера плотность (хотя и недооценивать на данном этапе) является целесообразным. Интенсивность хорошо выглядеть (10,000-26,000, с G с наименьшим интенсивности). В центре внимания оценки также необходимо, падение около 65-70, хотя более высокие значения также необходимо.
g7.jpg "ALT =" Рисунок 7 "/>
Рисунок 7. Кластере плотность рассчитывается после цикла 4 кластера плотность ниже, чем 850 к / мм 2 и даже во всех переулках) табличной форме;... B) График форму Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 8. Постепенный (не добавляя базу в течение цикла) и предварительного постепенного (с добавлением двух баз в течение цикла). Оба значения в 0,25 или ниже, с указанием соответствующих постепенно / предварительный постепенный уровней.) Постепенно и предварительно постепенно численные значения . B) постепенно значений в графической форме. C) предварительно постепенно значений в графической форме. Clic К здесь, чтобы просмотреть большую фигуру.
Рисунок 9. Различные представления Q30 баллов после цикла 24. Счетом 30 или выше указывает 1 в 1000 вероятность того, что база вызов неправильно. Около 90% из десятков Q выше 30 А) табличной форме (Q30 оценкам здесь от полноты перспективе, через цикл 24);. B) Q30 баллов по циклу. Каждая панель представляет собой распределение читает, приходящихся на Q30 или выше для данного цикла. C) Q30 оценка распределения по циклу 24. Распределение баллов Q на кумулятивной основе через цикл 24. Q балл по оси Х и миллионы прочтений находится на оси ординат. Читает с Q30 выше 30 представлены в зеленый цвет.oad/4393/4393fig9large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 10. Различные представления кластеров прохождение фильтра. Кластеры проходящего фильтр на основе нескольких параметров, включая Q30, интенсивности и постепенно / предварительной фазы. По крайней мере, 85% от кластеров проходят фильтр в каждой полосе) табличной форме;. B) График форме, синие прямоугольники представляют общее количество кластеров, зеленые ящики представляют собой кластеры проходящих фильтры. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 11. . Процентов кластеров приведены в соответствие с геномом PhiX примерно 0,5% от кластеров привести к геному PhiX, соответствующие на сумму PhiX шипами в образцах) табличной форме;.. B) График форму Нажмите, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 12. Гены-разному экспрессируются в тромбин лечения HMVEC-LBL в тромбин сигнального пути. Пути Тромбин Сигнализация была построена изобретательность. В пути, красный цвет указывает вверх-регулируемых генов (3 в 1,3 раза) и зеленый вниз-регулируемых генов ( таблице 2. Эта цифра приводится на рисунке 4 в справочном 4. Нажмите, чтобы увеличить рисунок
Рисунок 13. QRT-PCR проверки трех разному экспрессируются гены от тромбина обращение HMVEC-LBL РНК-последующие данные. QRT-PCR проводили, как описано в протоколе. Fold изменений определяется из относительных значений Ct Выражения анализа генов TaqMan для CUGBP, ELAV-как член семьи 1 (CELF1), анемия Фанкони, D2 дополнения группа (FANCD2) и TNF рецептора соответствующий коэффициент 1 (TRAF1)Были сравнению с теми обнаружены РНК-след. Репликация (п = 4) для каждого образца проводились и Ct значения усредняются. Все Ct значения нормированы на β-актина. Погрешности представляют диапазон изменения как раз определяется по данным Assist программного обеспечения. р <0,05 считали статистически значимыми в относительной раза изменениях между тромбином удовольствием группе и контрольной группе как РНК-след и QRT-PCR анализа. Уровня мРНК в контрольных группах по каждой пробе был произвольно установлен как один, который не показан. * Р <0,05; **, р <0,01. Эта цифра приводится на рисунке 6 в номер 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевые шаги
РНК-разгрузочные работы: РНКаз будет деградировать даже самого высокого качества РНК, поэтому необходимо соблюдать осторожность во время выделения, хранения и использования РНК-10. Перчатки всегда носили, чтобы предотвратить загрязнение РНКазы найдены на человеческих рук. Перчатки следует менять часто, особенно после контакта с кожей, дверные ручки или другие общие поверхности. Набор из пипетки должна быть посвящена исключительно РНК работы и все советы и трубы должны быть РНКазы. Выделение РНК и вниз по течению заявка должна быть выполнена в низких местах движения, которые обычно обеззаражены продуктов, таких как РНК-Зап. Деградация может происходить и при повторных циклов замораживания-оттаивания. Они могут быть сведены к минимуму аликвоты и РНК для последующего применения сразу же после изоляции. Кроме того, ДНК может быть сделано для последующих приложений, таких как QRT-PCR непосредственно после изоляции. РНК должна храниться при температуре -80 ° С и держится на льду во время использования. Кроме того, импortant тщательно оттаивать и вихревой РНК образцов до и во время использования.
Исходное качество РНК имеет важное значение для успеха этого протокола. Использование унизил или иным низкого качества РНК может привести к библиотеке подготовки к сбою или привести к низкой доходности, что будет недостаточно для секвенирования. Даже если достаточно библиотеке могут быть сделаны из деградированных или низкого качества РНК, она не будет точно представлять транскрипты присутствуют в образце, в результате неточного количественное выражение. Кроме того, любой неудаленных геномной ДНК в РНК изоляции может привести к переоценке количества РНК, используемых в протоколе, но если суммы (например, 1-2 мкг) в середине предложенного диапазона (0,1-4 мкг) Используется, фактическое количество РНК будет достаточно для протокола. Кроме того, любой геномной ДНК, скорее всего, не будет подхвачен олиго (DT) грунтовка на основе строительства библиотеки в стандартный протокол Illumina и, следовательно, это не вызовет вниз по течению МКСЕЭС с выраженными уровнями мРНК. Количественной оценки, начиная РНК с использованием регулярных спектрофотометрического показания должны быть достаточными, и нет необходимости использовать очень точные количественные методы, такие как RiboGreen с библиотеками будет точно количественно после подготовки КПЦР и уровня экспрессии гена нормированы по отношению к общему числу читает во время шага анализа данных.
Библиотека Количественное. Точный количественный библиотек является жизненно важным для соответствующего поколения кластеров. Только молекул ДНК с успехом лигировали адаптеры образуют кластеры. Спектрофотометрическое показаний не будет различий между ДНК с ДНК адаптеры и без него, что приведет к завышению концентрации в библиотеке и в конечном счете привести под кластеризации потоков клетки. Количество ДНК без лигированную адаптеры будут отличаться от библиотеки к библиотеке, даже если тот же РНК используется как начатьния материала, поэтому никто не может точно предположить, что стандартный процент от спектрофотометрического чтения ДНК с перевязанной адаптеров. Выполнение КПЦР с праймерами, специфичными к адаптерам будет обнаруживать только те молекулы ДНК с адаптерами успешно лигируют с обоих концов молекулы. Это позволяет абсолютного количественного библиотек и, в свою очередь точной плотности кластера. Оценка библиотек с инструментом Experion или bioanalyzer также важно. Это позволяет визуализировать диапазон размеров библиотеки, которая является важным шагом в анализе данных и гарантирует, что нет никаких загрязнений, которые могут помешать кластера поколения.
Анализ данных. Кроме этого протокола, мы применили TopHat для выравнивания РНК-след читает человека транскриптом ведения и запонки собрать стенограммы, оценить их содержания, а также тест для дифференциального выражения в тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток. TopHat и запонки тгоре популярных инструментов, и они свободно, с открытыми исходными кодами 11. Недавнее исследование показало, что запонки обладает высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении ранее аннотированный интронов 12. Тем не менее, TopHat и запонки не решают всех приложений РНК-след они не являются единственными инструментами для РНК-анализ последующих 11. TopHat и запонки требуют транскриптом последовательный ссылку или геном. Они особенно подходят для анализа РНК-последующие данные, полученные либо из Illumina или твердого секвенирования, но не 454 или классический капиллярного электрофореза последовательности платформы. Пользователи, работающие без генома ссылкой последовательными может рассмотреть выполнение De Novo транскриптом сборки с помощью одного из нескольких инструментов, таких как Троица ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) или оазисы ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Зербино / оазисы / ). Многие альтернативные программы транскриптом анализа в настоящее время существуют. Для обследования различных программ, читатели могут прочитать исследование Гарбер и соавт. 13 и обзор Мартин Ван и 14, которые описывают сравнительные преимущества и недостатки, и теоретическими соображениями и в настоящее время наиболее часто используемых программ. Выбор стратегии транскриптом анализа (ссылка основе стратегии, De Novo стратегии и комбинированной стратегии) и программы зависит от многих факторов, включая наличие или полноты ссылкой генома, наличие последовательности и вычислительные ресурсы, типа набора данных генерируется и, самое главное, главная цель проекта секвенирования 14.
Еще один момент, должно быть: сотрудничествоmputer программ для транскриптом анализ не может дать 100% точность всех стенограммы докладов. Секвенирование ошибки является другой проблемой. Это всегда целесообразно, что любая дифференциально экспрессируются расшифровка определенных РНК-след быть подтверждено ПЦР в реальном времени. TaqMan зондов на основе химии считается золотым стандартом для ПЦР в реальном времени. Кроме того, вновь выявленные стенограммы должно быть подтверждено методом Sanger секвенирования ДНК до дальнейших экспериментов.
Поиск и устранение неисправностей
Библиотека Приготовление: мазок с высоким молекулярным весом геномной ДНК после действия библиотеке подготовки может быть вызвано перенос из конечного борта стадии очистки в библиотеке подготовки. Возвращаясь библиотек в магнитном стенде в течение полных пяти минут может решить эту проблему. Если нет, то вопрос может быть связано с неполным фрагментации РНК во время первых шагов в библиотеке подготовки. Это может произойти при низкойКачество РНК используется или если протокол не выполняется в точности. Например, изменение времени инкубации или температуры, добавления реагентов в неправильном порядке или паузы между фрагментацией и синтеза первой нити кДНК. При возвращении библиотеки в магнитном стенде не снимает высокую ДНК МВт, желательно повторить библиотеке подготовки свежих образцов РНК.
Низкая интенсивность: Если первый цикл интенсивность ниже, чем ожидалось, вполне возможно, что праймеры не гибридизуются с кластерами правильно на последнем этапе генерации кластеров или проточной ячейке хранится слишком долго между кластеризации и начала секвенирования бежать. В этом случае грунтовка rehybridization должны быть выполнены с использованием набора праймеров rehyb от Illumina. Чаще всего, это rehyb решает интенсивность вопросов и выполнения может быть запущена без всяких проблем. Если после rehyb, интенсивности прежнему остаются низкими, проблема может бытьс библиотеками или последовательности путем синтеза (SBS) реагентов и Illumina технического обслуживания следует обращаться для дальнейшего поиска неисправностей. Если интенсивность первого чтения являются хорошими, но низкой интенсивности после поворота вокруг, грунтовки rehyb второй праймер для чтения может быть необходимым. Это выполняется на последовательности инструмент и Illumina технического обслуживания следует обращаться за процедуру.
Высокая постепенно / prephasing: Если выше, чем обычно постепенно или prephasing наблюдается, возможной причиной является загрязнение другими реагентами SBS с декольте буфера. Во время действия SBS подготовки, важно, чтобы справиться с расщеплением последнего буфера и менять перчатки при обращении с расщеплением буфера и любых других реагентов. Если загрязнение расщепления буфера подозревают, грунтовки rehyb потока ячейки должны быть выполнены и новых реагентов SBS должны быть подготовлены. Кроме того, не может быть загрязнение в линиях инст rument. Если есть подозрения, прибор должен пройти техническое обслуживание стирки (промывной воды следует мыть NaOH, после последней промывки водой), грунтовки rehyb должны быть выполнены на поток клеток и новых реагентов SBS должны быть подготовлены. Если постепенном / prephasing значения умеренно высоких (~ 0,5), перспективе может быть продолжен до Q30 оценки и кластеров прохождение фильтра рассчитываются. Эти уровни могут по-прежнему находиться в допустимых пределах даже при высоких этапов и / или prephasing.
Обобщаемость этот протокол
В то время как специфичные для Illumina HiScanSQ, этот протокол применяется к любой семьи HiSeq или Genome Analyzer II из Illumina инструментов ( www.illumina.com ) с незначительными изменениями кластера поколения шаги и последовательность реагентов. Другие следующего поколения секвенирования ДНК платформ, таких как твердый серии ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), GS систем ( www.454.com ), а также некоторые страны с формирующимся новых системах также используются для РНК-след 11. Хотя их строительство библиотеки и последовательности процедур может немного отличаться, советы РНК обработки, анализа данных частей (на выходе из шагов CASAVA) и проверка ОТ-ПЦР, представленные в этом протоколе может быть эталонное значение их след РНК-приложений .
Следует также отметить, что данный протокол является специфическим для РНК-след в одной временной точке тромбина обращение HMVEC LBL-клеток, но она может быть легко адаптирована к многопартийной время исследования точке или исследованиях в других клетках, тканях, обработанных различные стимулы или ингибиторы, или сравнение transcriptomes в клетки или ткани между здоровым состоянием и болезненного состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Стивен Kingsmore и детской Центра медицины генома в Детской милосердия Больницы и клиники для использования их вычислительных кластеров для анализа данных, поле Illumina служба команды (Elizabeth Бойер, Скотт Кук и Марк Кук) и технические Консультант команды для их быстрого реагирования и полезные советы на функционирование нового поколения секвенирования ДНК инструмент, HiScanSQ, а также данные анализа качества. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья Грант HL080042 (для SQY) и пуско-наладочные фонд и фонд детского милосердия Больницы и клиники Университета Миссури в Канзас-Сити (в SQY).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
Thrombin | Sigma | T4393 | |
Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H.
Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008). - Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H.
Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011). - Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z.
Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).