Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

Published: February 13, 2013 doi: 10.3791/4393
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Summary

ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة المتضررة من الكواشف المختلفة أو الحالات المرضية.

Abstract

توصيف التعبير الجيني في الخلايا عن طريق قياس مستويات مرنا هو أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر الجهاز النسخي للخلية بواسطة إشارات خارجية (على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات)، أو كيف تختلف الخلايا بين حالة صحية ودولة مريضة. مع ظهور والتحسين المتواصل لتكنولوجيا DNA الجيل القادم التسلسل، أصبح RNA-التسلسل (RNA-يليها) وسيلة شعبية متزايدة لتحليل transcriptome الى الدليل كافة أنواع النصوص، لتحديد هيكل الترانسكربتي من جميع الجينات التي أعرب عنها وتحديد ل مستويات التعبير المتغيرة للمجموعة مجموع النصوص في الخلية 1،2، أو الأنسجة كائن معين. RNA-يليها إلى تغييره بالتدريج ميكروأرس DNA كأسلوب مفضل للتحليل transcriptome لأنه يحتوي على مزايا أنشأ حسابا باسم transcriptome كاملة، وتوفير نوع مسند الرقمية (عدد نسخة من أي نص) وليس الاعتماد على أي sequen الجيني المعروفةم 3.

هنا، نقدم بروتوكول كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. ويستند هذا البروتوكول على دراسة حديثة نشرت لدينا بعنوان "RNA-يليها يكشف Transcriptome الرواية الجينات والأشكال الإسوية خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الإنسان الرئوي غشائي المعالجة مع الثرومبين،" 4 التي نفذنا بنجاح أول تحليل transcriptome كاملة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية تعامل مع الثرومبين باستخدام RNA-يليها. أسفرت موارد تكنولوجيا المعلومات لم يسبق لها مثيل لمزيد من التجارب للحصول على أفكار في الآليات الجزيئية الكامنة ثرومبين بوساطة ضعف البطانية في التسبب في حالات الالتهابات، والسرطان، والسكري، وأمراض القلب التاجية، ويوفر إمكانية خيوط جديدة الأهداف العلاجية لتلك الأمراض.

النص الوصفي من هذا البروتوكولوينقسم إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول يصف العلاج للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع الثرومبين والعزلة RNA، والتحليل الكمي والجودة. الجزء الثاني يصف بناء مكتبة والتسلسل. الجزء الثالث ويصف تحليل البيانات. الجزء الرابع يصف مقايسة التحقق من صحة RT-PCR. يتم عرض نتائج ممثلة من الخطوات الرئيسية عدة. وتقدم نصائح مفيدة لتعزيز الاحتياطات أو النجاح في الخطوات الرئيسية في قسم المناقشات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية تعامل مع الثرومبين، يمكن أن يكون تعميمها على transcriptomes الشخصي في كل من خلايا الثدييات وغير الثدييات والأنسجة في التعامل مع محفزات مختلفة أو مثبطات، أو لمقارنة transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

Protocol

يتم عرض مخطط يحدد هذا البروتوكول في الشكل 1.

1. علاج الخلايا مع الثرومبين، RNA العزلة، وتقييم جودة الكمي لRNA

  1. ثقافة الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الخلايا البطانية الإنسان (HMVEC-LBL) لالتقاء 90-100٪ في 6 وحات جيدة في EGM-2 مع المتوسط ​​5٪ FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية (Lonza، القط # CC-3202).
  2. تغيير وسائل الاعلام الى وسائل الاعلام المجاعة (0٪ FBS) 30 دقيقة قبل العلاج مع ثرومبين.
  3. علاج الخلايا مع 0.05 U / مل الثرومبين أو ترك دون علاج كعنصر تحكم لمدة 6 ساعة عند 37 ° C و 5٪ CO 2.
  4. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة والتحكم باستخدام مير Ambion فانا عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. تقييم نوعية RNA مع رقاقة StdSense Experion RNA حقيقية النواة وفقا للبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي (= "_blank"> www.bio-rad.com).
  6. قياس الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب قياسي الطيفي.

2. مكتبة البناء وتسلسل

  1. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع ذات جودة عالية لكل عينة عن بدء المادية.
  2. لبناء المكتبة، اتبع الإجراء القياسي من البورشيد (البروتوكول # 15008136 القس A). في هذا البروتوكول، جولتين من بولي (A) يتم إجراء التحديدات التي تحتوي مرنا لإزالة الرنا الريباسي للحد من تسلسل الرنا الريباسي.
  3. تقييم جودة المكتبات باستخدام رقاقة الحمض النووي Experion 1K وفقا لبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي ( www.bio-rad.com ).
  4. قياس مكتبة باستخدام qPCR: استخدام المكتبة التي سبق التسلسل كما منحنى القياسية والاشعال محددة لمحولات ligated. استخدام مجموعة من التخفيفات من مكتبات غير معروف (أي 1:100، 1:500 و1:1،000). تشغيل ACCO qPCRrding في البروتوكول MM SyberGreen وحساب تركيز المخزون الأصلي من كل مكتبة.
  5. تمييع الأسهم مكتبة إلى 10 نانومتر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للكتلة خلية تدفق.
  6. عندما تصبح مستعدة لخلية تدفق الكتلة، ذوبان الجليد لوحة كاشف CBOT في حمام مائي. CBOT أداة تستخدم البورشيد لتبسيط عملية توليد الكتلة.
  7. غسل الصك CBOT.
  8. تفسد المكتبات: الجمع بين ميكرولتر 1X 13 TE ميكرولتر و 6 10 و مكتبة ميكرومتر، إلى جانب الأنبوب، إضافة 1 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم (التي قدمها البورشيد). دوامة، وتدور إلى أسفل، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ووضع المكتبات التشويه والتحريف على الجليد.
  9. يخفف من المكتبات: مكتبات تمييع مع العازلة التهجين التشويه والتحريف ما قبل المبردة (HT1، التي تقدمها البورشيد) من خلال الجمع بين 996 و 4 ميكرولتر HT1 ميكرولتر مكتبة التشويه والتحريف لتركيز النهائي من 12 مساء. وضع المكتبات التشويه والتحريف والمخفف على الجليد.
  10. عكس كل صف من الأنابيب لوحة CBOT،ضمان إذابة كل الكواشف. تدور أسفل لوحة، إزالة / ثقب الأختام احباط وتحميله إلى CBOT.
  11. قسامة 120 ميكرولتر من المكتبات، والمخفف التشويه والتحريف لأنبوب قطاع، وصفت 1-8. تضيف 1.2 ميكرولتر المخفف، ومراقبة PhiX التشويه والتحريف مكتبة (من البورشيد) في كل أنبوب وتصاعد في السيطرة. وتدور دوامة أسفل أنابيب وتحميلها على CBOT في الاتجاه الصحيح (أنبوب # 1 إلى اليمين).
  12. تحميل خلية تدفق ومتعددة على وCBOT.
  13. استكمال فحص وتدفق على المدى تبدأ المجموعات.
  14. بعد اكتمال التشغيل، تحقق التسليم في جميع الممرات كاشف. دون أي تشوهات. بدء إما على المدى التسلسل مباشرة أو تخزين الخلية في أنبوب تدفق المقدمة في C. ° 4
  15. ذوبان الجليد في تسلسل على حدة التوليف (SBS، البورشيد) الكواشف.
  16. تحميل الكواشف إلى المناطق المناسبة على الصواني كاشف، والتأكد من عدم لمس الكواشف الأخرى بعد لمس مزيج الانقسام.
  17. باستخدام أيN-التسلسل خلية تدفق (أي تلك التي كانت في السابق التسلسل)، رئيس وخطوط كاشف مرتين.
  18. تنظيف شامل لخلية تدفق التسلسل مع EtOH 70٪ وKimwipes، تليها EtOH 70٪ ورقة العدسة. تفقد الخلية التدفق لأي الشرائط. إعادة تنظيفه إذا لزم الأمر.
  19. تحميل خلية تدفق على التسلسل وإجراء فحص تدفق للتأكد من أن الختم بين الفتحات وخلية تدفق ضيق.
  20. بدء تشغيل التسلسل.
  21. تقييم مقاييس الجودة (مثل كثافة الكتلة، مجموعات تمرير مرشح، Q30، وكثافة) عندما تصبح متاحة خلال الفترة السابقة.
  22. رصد كثافة في جميع أنحاء المدى.
  23. بعد الانتهاء من 101 دورات، نفذ الكيمياء تحول لإكمال الثانية كما يلي: ذوبان الجليد في نهاية الاقتران الكواشف وإدماج الاحتياطي قراءة الثاني (ICB، وهو مكون من الكواشف SBS، البورشيد) وتحميل الكواشف.
  24. تواصل على المدى التسلسل، وتقييم شدة 2 الثانية قراءة، وQ30مقاييس الجودة الثانية الأخرى ومع تقدم التشغيل.

3. تحليل البيانات

  1. استخدام أحدث إصدار من CASAVA (البورشيد، حاليا 1.8.2) لتحويل الملفات مكالمة قاعدة (. BCL) الملفات إلى ملفات fastq.، ووضع fastq للمجموعة العد إلى 0 لضمان إنشاء ملف واحد لfastq كل عينة . بفك الملفات fastq لتحليل المصب.
  2. أداء المقترنة باستخدام المحاذاة نهاية الإصدارات الأحدث من TopHat (1.4.1) 5، والتي تؤيد RNA-يليها يقرأ لالثدييات بحجم الجينوم باستخدام فائقة الإنتاجية العالية اليجنر قراءة قصيرة (بووتي، 0.12.7) 6 و SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools تنفذ المرافق المختلفة لمرحلة ما بعد المعالجة التحالفات في شكل SAM. يمكن تحميل transcriptome مرجعية الإنسان من iGenomes ( www.illumina.com ). في إدارة TopHat، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة بما في ذلك مكتبة نوع الخيار كما FR-unstranded (افتراضي).
  3. لناجي في برنامج CuffDiff، وهي جزء من أزرار أكمام (1.3.0) 8 حزمة البرامج، قارن الخلايا ثرومبين المعالجة إلى الخلايا ضوابط لحجب النصوص الجينات أعرب تفاضلي في السابق على أساس مرجعية transcriptome الإنسان. هذه المقارنة بالكشف عن التعبير الفرق النصوص المعروفة. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جدول. في تشغيل أزرار أكمام البرنامج، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة. هذه النصوص الجينات مع FPKM <0.05 و p> يتم تصفيتها من 0،05.
  4. للكشف عن الأشكال الإسوية الرواية، تشغيل بدون أزرار أكمام transcriptome المرجعية. مقارنة الملفات نص عينة إلى إشارة الجينوم باستخدام Cuffcompare واختبار التعبير الفرق مع Cuffdiff باستخدام نسخة ثرومبين مجتمعة الملفات كما الجينوم مرجعية واحدة وتحليل نص السيطرة المشتركة الملفات كما الجينوم مرجعية للتحليل الثاني. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جداول. مرة أخرى، THOSمحاضر الجين ه مع FPKM <0.05 و p> يتم تصفيتها من 0،05. بعد هذه الخطوة، قد تختار المحققين لتحميل قائمة النصوص التي أبلغ عنها حديثا إلى موقع الجينوم UCSC متصفح ( http://genome.ucsc.edu/ ) للتحقق من صحتها من قبل التفتيش اليدوي.
  5. تقديم قوائم الجينات أعرب تفاضلي لتحليل المسارات الإبداع (IPA، www.ingenuity.com ) لتوصيف الجينات والمسارات المتضررة من العلاج ثرومبين. في هذه الخطوة، قد تختار لاستخدام المحققين CummeRbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ )، حزمة R التي تم تصميمها لمساعدة وتسهيل مهمة تحليل RNA-أزرار أكمام يليها الإخراج، للمساعدة في إدارة والتخيل ودمج جميع البيانات التي تنتجها تحليل Cuffdiff.

4. المصادقة على النتائج RNA-يليها من الكمية بو في الوقت الحقيقيlymerase سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR)

  1. أداء مجموع RNA بمعزل عن السيطرة والمعالجة ثرومبين HMVEC-LBL الخلايا، RNA RNA نوعية التقييم والقياس الكمي موضح في الخطوات 1،4 حتي 1،6.
  2. توليد DNA مكملة من الحمض النووي الريبي ميكروغرام 1 المجموع من كل عينة III مع أطقم مرتفع التجميعي الأول حبلا RT النظام، باتباع إرشادات الشركة المصنعة (إينفيتروجن، 18080-051).
  3. أداء QRT-PCR تحليل النظم البيولوجية التطبيقية على ViiA 7 نظام PCR في الوقت الحقيقي باستخدام Taqman الفحص عند الطلب أليغنوكليوتيد] مصممة للكشف عن، CUGBP Elav-likefamilymember1 (CELF1، Hs00198069_m1)، Fanconianemia، complementationgroupD2 (FANDCD2، Hs00276992_m1)، TNFreceptor المرتبطة عامل 1 (TRAF1، Hs01090170_m1)، وβ أكتين-(ACTB، Hs99999903_m1). كان كل عينة قالب يعادل 5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. قياس الكميات باستخدام طريقة DDCt وتطبيع للأكتين-β. تم إجراء الفحص عبر كل ثلاثة على الأقل البيولوجية مكررات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لخطوة 1: 28S: يستخدم تقليديا 18S نسبة كمؤشر على تدهور RNA. ومن الناحية المثالية، ذروة 28S يجب أن يكون حوالي ضعف مساحة الفرقة 18S (نسبة 2)، ولكن هذا في كثير من الأحيان لا ينظر النسبة المثالية من الناحية العملية. وعلاوة على ذلك، 28S: يمكن الحصول عليها من نسب 18S طرق طيفية نقلل من كمية تدهور RNA. على نحو أكثر دقة قياس التدهور، وبالتالي نوعية العينة RNA، ونظام Experion بحساب مؤشر جودة RNA (RQI) عدد. الخوارزمية RQI يقارن مخطط رحلاني من عينات الحمض النووي الريبي لبيانات من مجموعة موحدة، وعينات الحمض النووي الريبي المتدهورة وإرجاع تلقائيا رقما بين 10 (RNA سليمة) و 1 (RNA المتدهورة). ينبغي أن يكون لها نوعية RNA RQI ما لا يقل عن 7، أكبر مثالي من 8. ويبين الشكل 2 Experion النتائج باستخدام عينة الحمض النووي الريبي عالية الجودة مع RQI من 8.4.

إلىالخطوة 2: المكتبات يجب أن يكون واسع النطاق في حوالي 250-300 بي بي ويبين الشكل 3 نتائج Experion من مكتبة ذات جودة عالية ويبين الشكل 4 نتائج العينات qPCR منحنى القياسية وعينة واحدة غير معروفة (كما هو موضح باللون الأزرق الداكن).. وينبغي أن تقدم وجودة على المدى التسلسل وحظ باستمرار طوال الفترة السابقة ويبين الشكل 5 المناسبة كثافة الكتلة خلال دورة التصوير الخطوة الأولى؛، وهذا هو أول مؤشر لجودة التشغيل. يجب أن يكون مشرقا مجموعات ومركزة. ويبين الشكل 6 تبليغ أول قاعدة ولدت بعد الدورة الأولى كاملة. من المهم لتقييم كثافة الكتلة المقدرة، ومستويات الشدة، ونوعية التركيز في هذه المرحلة. يظهر نقطة تفتيش جودة المقبل، بعد دورة 4، في الشكل 7. هذا يدل على كثافة الكتلة المطلقة لكل حارة. ينبغي أن كثافة الكتلة لا يكون فوق 850 ك / مم 2. بعد دورة 13،وتحسب احصائيات الإلغاء (عندما لا يتم إضافة قاعدة خلال دورة) وprephasing (عند إضافة قاعدتين خلال دورة)، كما هو موضح في الشكل 8. أرقام النموذجية هي ما بين 0.1 و 0.25. تقييم نوعية كبرى من الممكن بعد دورة 24، عندما يتم حساب مقاييس الجودة عدة. في المئة من يقرأ فوق Q30، كما هو موضح في الشكل 9، هو مقياس لثقة في قاعدة الدعوة. A قراءة برصيد Q من 30 يعني أن هناك فرصة 1 في 1000 التي تدعو قاعدة خاطئة. سوف تنخفض درجات Q ومع تقدم المدى، ولكن يجب أن تبدأ مع أكبر من 95٪ من يقرأ تلبية أو تجاوز Q30. المجموعات تمرير مرشح (PF)، كما هو موضح في الشكل 10، هي مجموعات من التي سوف تتخذ تسلسل البيانات الفعلية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا أعلى من 85٪. يستند PF العنقودية على عوامل كثيرة، بما في ذلك التخلص، وكثافة، وprephasing Q30. لن تتغير مع تقدم عملية التشغيل. الانحياز في المئة (

لخطوة 3: يعرض الجدول 1 الجينات وأعرب في كل من الأشكال الإسوية السيطرة وثرومبين المعاملة الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية. والجدير بالذكر أن هناك حوالي 26،000 الأشكال الإسوية رواية الكشف، الذي يوضح قوة RNA-يليها، فإنه يمكن تحديد الرناوات غير معروف، بدلا من النصوص تقسم والبديلة استخدام المروج التي لا يمكن كشفها بواسطة التقنيات ميكروأري 3. يمكن RNA-يليها أيضا قياس أقل وفرة النصوص التي يتم الكشف عن كمية غير دقيق أو ليس ميكروأرس. الشكل 12 والجدول 2 عرض differentiallوأعرب Y جينات في مسار يشير ثرومبين. هذا هو مثال للمعرفة الجيل الثالث تحليل المسارات قاعدة يحركها 9: النهج القائمة على طوبولوجيا المسار، وذلك باستخدام البرمجيات الإبداع تحليل المسارات. فإنه يدل على أن العلاج لمدة ستة ثرومبين ح بشكل كبير يصل ينظم الاسمية مستقبلات الثرومبين (4) وأسفل ينظم الاسمية مستقبلات الثرومبين 3 ففي حين لا يوجد أي تغيير في التعبير عن مستقبلات الثرومبين الاسمية 1. التعبير عن NFkB1، NF kB2 وSRC أيضا بشكل كبير حتى التنظيم. بعض الجينات الأسرة رو (رو B، C، F و G) ما يصل التنظيم في حين أن آخرين (رو J، Q، T1، U V و) هي أسفل التنظيم (الجدول 4). الميوسين سلسلة الجينات ضوء 9 (MYL9) يعود التنظيم بينما هو أسفل MYL12B التنظيم. التعبير عن الجينات الأخرى هي إما أسفل التنظيم أو المتأثرين لا.

لخطوة 4: للتحقق من صحة النتائج RNA-يليها استخدام نهج بديل، أجرينا تجربة QRT-PCR لفحص diffe 3الجينات إيجار (الشكل 13). في RNA-يليها البيانات، كان TRAF1 يصل ينظم بنسبة 7.96 أضعاف؛ CELF1 انخفض بنسبة 1.16 التنظيم أضعاف، وكان FANCD2 أسفل ينظم بنسبة 1.70 أضعاف. في QRT-PCR البيانات، هذه الأرقام هي المقابلة +7.25 أضعاف، أضعاف -1.15 -2.07 أضعاف على التوالي و. نتائج هذه الجينات الثلاثة من RNA-يعاير يليها وQRT PCR-هي في اتفاق جيد، والذي يعزز نتائج RNA-يليها.

الجينات
السيطرة ثرومبين
تعبير الجينات عن نفسها مجموع 16636 16357
التحكم فقط 783
ثرومبين فقط 504
حتى التنظيم (2-الفرق أضعاف أو أكثر) 152
أسفل التنظيم (2-أضعاف أو زreater الفرق) 2190
المعروفة الأشكال الإسوية
السيطرة ثرومبين
أعربت عن مجموع الأشكال الإسوية معروف 26807 26300
التحكم فقط 1492
ثرومبين فقط 985
حتى التنظيم (2-الفرق أضعاف أو أكثر) 480
أسفل التنظيم (2-الفرق أضعاف أو أكثر) 3574
رواية الأشكال الإسوية
السيطرة ثرومبين
أعربت عن الأشكال الإسوية رواية إجمالي 25880 25886
التحكم فقط 418
ثرومبين فقط 424
حتى التنظيم (2-الفرق أضعاف أو أكثر) 1775
أسفل التنظيم (2-الفرق أضعاف أو أكثر) 12202

الجدول 1. جين / شكل الإسوي * ملخص التعبير. يسرد هذا الجدول الجينات، ويعرف الأشكال الإسوية الأشكال الإسوية الرواية الواردة في السيطرة وثرومبين المعاملة الخلايا HMVEC-LBL. التغيير هو أضعاف نسبة FragmentsPerKilobase ثرومبين من شظايا perMillion نص معين (FPKM) للتحكم FPKM. تلك الجينات، ويعرف الأشكال الإسوية الأشكال الإسوية الرواية مع اختلاف 2-أضعاف أو أكثر بين مجموعتين لديهم مستويات التعبير المختلفة إحصائيا (كما هو محدد بعد Benjamini-Hochberg التصحيح). * ويرد هذا الجدول من الجدول 2 في المرجع 4.

rder = "1">
أسفل الخاضعة للرقابة الجينات
الجينات الرمز طية التغيير الشامل الأعضاء طية تغيير الفردية q_value ** FPKM التحكم FPKM الثرومبين
PLC -2،49
PLCB1 -2،97 0 6،75585 2،27611
PLCB2 -1،32 0.00183634 1،80892 1،36957
PLCB4 -10،04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837
PLCL1 -2،53 5.26728E-09 0.602879 0.238017
Gaq -1،87
GNAQ -1،87 0 24،0907 12،8996
GAI -1،56
GNAI1 -1،86 0 9،88417 5،31795
GNAI3 -1،49 0 35،7592 24،0198
PKC -2،15
PRKCE -1،65 0 9،36364 5،67305
PRKCI -2،14 0 6،63566 3،09818
PRKD3 -2،61 0 16،0215 6،12878
IP3R -2،60
ITPR1 -1،39 0،000018734 1،51592 1،09009
ITPR2 -3،19 0 7،23283 2،26944
CREB -2،36
CREB1 -2،36 0 5،19117 2،2004
غاتا -2،33
GATA3 -2،33 0.0228108 0.716773 0.307131
TBP -1،35
TBP -1،35 2.66E-05 8،48689 6،30476
G-البروتين ألفا -1،64
GNA14 -1،49 0،000122496 2،78076 1،86573
GNAI1 -1،86 0 9،88417 5،31795
GNAI3 -1،49 0 35،7592 24،0198
GNAQ -1،87 0 24،0907 12،8996
PAR3 -1،87
F2RL2 -1،87 1.02474E-06 1،51286 0.810286
SOS1
SOS1 -2،27 0 8،94353 3،94679
رأس -1،69
KRAS -2،03 0 11،2766 5،5659
تلك السلطات -1،61 0 38،0874 23،6491
AKT -1،77
AKT3 -1،77 0 15،8228 8،94223
MLCP -2،38
PPP1CB -2،10 0 39،585 18،8199
PPP1R12A -3،56 0 15،2274 4،27516
PPP1R12B -2،66 5.28466E-13 1،92123 0.722188
FAK -1،31
PTK2 -1،31 4.3856E-10 39،7935 30،3044
P70 S6K
RPS6KB1 -1،99 0 8،46312
ROCK -3،68
ROCK1 -3،54 0 19،5921 5،53112
ROCK2 -3،86 0 16،0054 4،14759
CAMK -1،17
CAMK1 1.30 0،000255587 7،90794 10،296
CAMK2D -1،74 2.22911E-12 11،4497 6،56804
CAMK4 -2،58 0،000619045 0،62714 0.243277
يصل الخاضعة للرقابة الجينات
رمز طية التغيير الشامل الأعضاء طية تغيير الفردية q_value ** FPKM التحكم FPKM الثرومبين
PAR4 1.59
F2RL3 1.59 9.19043E-13 4،99867 7،9253
SRC 1.47
SRC 1.47 0 14،1085 20،675
NF كيلوبايت 1.65
NFKB1 1.66 0 19،5113 32،3457
NFKB2 2.02 0 28،7563 58،1293
سيليانغ 1.45 0 55،3482 80،28
جزئية Up-/Partial اسقاط الخاضعة للرقابة الجينات
رمز طية التغيير الشامل الأعضاء طية تغيير الفردية q_value ** FPKM التحكم FPKM الثرومبين
G-البروتين حركة اتشيه الحرةأماه 1.22
GNG10 -1،34 2.17216E-08 27،192 20،2206
GNG11 1.31 5.66209E-05 770،922 1011،05
GNG12 -1،44 5.11591E-13 112،397 78،3023
GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1،13132
G-البروتين بيتا 1.27
GNB2 1.36 1.91268E-10 137،786 187.43
GNB3 -2،69 4.71259E-11 2،58703 0.962504
GNB4 -1،61 0 15،8275 9،85484
رو مرفق البيئة العالمية -1،16
ARHGEF12 -1،67 0 30،6424 18،3015
ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27،6288 36،758
ARHGEF3 -1،48 0 20،3279 13،7813
ARHGEF6 -2،08 0 2،67944 1،28635
ARHGEF9 -1،54 0.00469498 1،56367 1،0159
PI3K -1،80
ماكينة الصراف الآلي -6،84 0 4،98972 0.729483
PIK3C2A -5،09 0 17،7894 3،49234
PIK3C3 -1،49 4.66294E-15 12،6504 8،50852
PIK3CA -3،14 0 16،8398 5،36228
PIK3CB -1،36 8.4357E-09 9،68516 7،12129
PIK3CD 1.86 0 5،6579 10،5507
PIK3CG -1،76 2.32945E-10 1،86962 1،06419
PIK3R1 -1،79 0 5،48118 3،06256
PIK3R3 -1،59 1.50915E-05 5،24549 3،30763
PIK3R4 -1،40 7.18425E-12 8،34176 5،97942
رو 1.19
RHOB 1.31 9.48429E-06 232،232 304،587
RHOC 1.38 458،267 630،235
RHOF 1.65 0 8،29676 13،7268
RHOG 1.40 1.02141E-14 58،6003 82،0172
RHOJ -1،57 0 127،446 80،9317
RHOQ -1،52 0 16،4802 10،8122
RHOT1 -1،96 3.00071E-12 8،48834 4،33755
RHOU -1،54 0.00184367 0.900141 0.586092
RHOV -3،32 0.0056467 1 0.413912 0.124591
RND3 -1،95 0 58،0564 29،7075
MLC -1،06
MYL12B -1،43 4.87832E-11 872،075 608،472
MYL9 1.48 0 202،636 299،559

الجدول 2. وأعربت عن الجينات بشكل مختلف الأشكال الإسوية في الطريق مما يشير الى الثرومبين *. *، ويرد هذا الجدول من الجدول S4 في مرجع 4 مع تعديل طفيف. **، س القيمة ومعدل اكتشاف كاذبة تعديل قيمة ف.

93/4393fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. مخطط لبروتوكول لRNA-يليها من التنميط transcriptome ثرومبين بوساطة خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الرئة الإنسان البطانية. أولا، علاج الخلايا وعزل وتحديد RNA. إعداد مكتبات من RNA عالية الجودة وتقييم تركيزهم (عن طريق qPCR) وجودة (عن طريق bioanalyzer)، ثم الكتلة على خلية تدفق. بدء تشغيل تسلسل وتحليل نوعية على المدى طوال الوقت. نقاط التفتيش الرئيسية هي نوعية الدورات 1 و 4 و 13 و 24. باستخدام CASAVA، تحويل الملفات إلى ملفات بي سي إل fastq ثم محاذاة إلى تلك الجينوم مع TopHat. كشف الأشكال الإسوية المعروفة وغير المعروفة باستخدام أزرار أكمام وتحديد الفرق مع CuffDiff التعبير. عرض ملفات الإخراج في Excel وتصفية الجينات التي لها مستوى التعبير أقل من 0.05 FPKM أو ف قيمة أكبر من 0.05. تقديم الجينات المتبقية لتحليل المسارات الإبداع لمزيد من المعلومات حول وظائف الجينات والممرات ل ffected من العلاج ثرومبين. عادة، يتم اختيارهم مجموعة من الجينات بشكل مختلف عن والمصادق عليها من قبل نهج بديل مثل QRT-PCR.

الشكل 2
الشكل 2. عينة الحمض النووي الريبي مع ممثل RQI قدرها 8.4 تحليلها على النحو الذي الكهربائي Experion محطة الآلي A) تتبع الفردية عالية الجودة RNA - المحور س الوقت ويصور المحور ص يصور إشارة الفلورسنت B) الصورة هلام الظاهري من عينة الحمض النووي الريبي عالية الجودة. شدة ذروة 28S أكبر من ذروة 18S وينظر أي تلوث. كل من العصابات حادة ومحددة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

. داخل الصفحة = "دائما"> الشكل 3
الشكل 3. عالية الجودة مكتبة المحضرة من RNA وفقا لتحليل الكهربائي Experion محطة الآلي تم الكشف عن ذروة عريض بين 250 و 300 بي ويتم احترام أي DNA عالية الوزن الجزيئي (تلويث DNA) A) والتتبع الفردي للمكتبة ذات جودة عالية. - المحور س الوقت ويصور المحور ص يصور إشارة الفلورسنت B) الصورة هلام الظاهري من مكتبة ذات جودة عالية. تم الكشف عن ذروة عريض بين 250 و 300 بي ويتم احترام أي DNA عالية الوزن الجزيئي (تلويث DNA). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4
<STRONG> الشكل 4. النتائج qPCR باستخدام SyberGreen والاشعال محددة لمحولات ligated البورشيد. يتم استخدام مكتبة عنقودية سابقا باسم منحنى القياسية لتحديد تركيز المجموعات الأمثل للمكتبة أعدت حديثا. التخفيف من المكتبة غير معروف يقع ضمن منحنى تركيزات القياسية. ووجه الاتهام إلى عينات منحنى القياسية بواسطة الأسهم والعينة غير معروف هو الأزرق الداكن وأشار أيضا سهم.

الشكل 5
الشكل 5. . الكثافة المناسبة العنقودية خلال دورة التصوير الخطوة لأول مرة مجموعات واضحة ومركزة ومشرقة قاعدة) A؛ باء) قاعدة C؛ C) قاعدة G؛ D) قاعدة T.

<TD> 19892
متري حارة 1 لين 3 حارة 4 حارة 5 6 حارات لين 7 الممر 8
الكثافة الكتلة (ك / مم 2) 420.94 412.95 410.81 408.54 416.71 416.56 410.02 411.84
A الكثافة 25870،5 23886 23891،38 23735،83 23949،38 24933،08 24305،79 23950،29
C كثافة 21559،62 19822،33 19759،33 19472 19954،21 20611،75 19438،29
G كثافة 13619،46 11756،67 11486،44 10498،38 12186،62 12195،5 11826،88 11010،5
T كثافة 19402،67 17663،79 17854،42 17353،75 17545،54 18060،67 18457،92 17397،12
A التركيز نقاط 68،2 67،46 67،67 67،75 67،41 67،43 67،63 67،05
C التركيز نقاط 67،93 67،33 67،56 67،66 67،33 67،39 67،46 66،9
G التركيز نقاط 65،4 64،14 63،98 63،92 63،29 63،41 63،47 63،74
T التركيز نقاط 66،45 65،57 65،5 65،49 65،03 65،23 65،57 65،59

الشكل 6. تقرير أول قاعدة ولدت بعد الدورة الأولى كاملة. كثافة الكتلة (على الرغم من التقليل في هذه المرحلة) هو المناسب. شدة تبدو جيدة (10،000-26،000، مع وجود G أقل كثافة). درجات التركيز أيضا المناسبة، التي تقع في جميع أنحاء 65-70، على الرغم من ارتفاع قيم هي أيضا المناسبة.

g7.jpg "بديل =" الشكل 7 "/>
الشكل 7. كثافة الكتلة المحتسبة بعد دورة 4 وكثافة الكتلة أقل من 850 ك / مم 2 وحتى في جميع الممرات نموذج) جدولي؛. B) شكل الرسم البياني اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الرقم 8
الشكل 8. مراحل (وليس إضافة قاعدة خلال دورة) وقبل الإلغاء (إضافة قاعدتين خلال دورة). كل القيم عند 0.25 أو أقل، مشيرا إلى التخلص المناسبة / قبل التخلص المستويات. A) والقيم والتخلص التدريجي قبل العددية . B) القيم في شكل مراحل الرسم البياني. C) وقبل التخلص القيم في شكل الرسم البياني. أنقر ك هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 9
الشكل 9. وتمثيلات مختلفة من عشرات Q30 بعد دورة 24. A نقاط من 30 أو أعلى يشير إلى فرصة 1 في 1،000 تلك الدعوة قاعدة خاطئة. حوالي 90٪ من عشرات Q هي فوق 30 نموذج) جداول (Q30 عشرات هنا هي من مجمل المدى، من خلال دورة 24)؛ باء) Q30 عشرات من دورة. كل شريط يمثل توزيع يقرأ الوقوع في Q30 أو أعلى لتلك الدورة بالذات. C) توزيعات نقاط Q30 من خلال دورة 24. توزيع عشرات Q على أساس تراكمي من خلال دورة 24. س النتيجة هي على محور س والملايين من القراء على المحور ص. يقرأ مع Q30 فوق 30 يتم تمثيل باللون الأخضر.oad/4393/4393fig9large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 10
الشكل 10. ويستند تمثيل مجموعات مختلفة من الكتل تمرير التصفية. تمرير تصفية على العديد من المعلمات، بما في ذلك شدة، والتخلص Q30 / قبل الإلغاء. لا يقل عن 85٪ من مجموعات يتم تمرير مرشح في كل حارة نموذج) جدولي؛ B) شكل الرسم البياني، وصناديق زرقاء تمثل العدد الكلي للكتل ومربعات خضراء تمثل مجموعات تمرير مرشحات. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 11 الشكل 11. . في المائة من كتل الانحياز إلى ما يقرب من الجينوم PhiX 0.5٪ من مجموعات محاذاة إلى الجينوم PhiX، مناسبة لكمية PhiX ارتفعت في شكل عينات A) جدولي؛. B) شكل الرسم البياني اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 12
الشكل 12. وأعرب تفاضلي الجينات من العلاج ثرومبين من LBL-HMVEC في مسار الثرومبين الإشارة. شيد الطريق مما يشير الى الثرومبين من الإبداع. في الممر، اللون الأحمر يشير إلى ما يصل التنظيم الجينات (3 أضعاف 1.3) والأخضر أسفل الجينات التنظيم ( الجدول 2. ويرد هذا الرقم من الرقم 4 في المرجع 4. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية

الشكل 13
الشكل 13. QRT-PCR التحقق من ثلاثة جينات أعرب تفاضلي من ثرومبين المعاملة RNA-يليها البيانات HMVEC-LBL. وقد أجريت QRT-PCR من كما هو موضح في البروتوكول. التغييرات طية من تحديد القيم النسبية للط م TaqMan مقايسة التعبير الجيني لCUGBP، Elav مثل أفراد الأسرة 1 (CELF1)، فانكوني فقر الدم، وتكامل مجموعة D2 (FANCD2) وTNF مستقبلات عامل المرتبطة 1 (TRAF1)وبالمقارنة مع تلك الحالات المكتشفة من قبل RNA-يليها. مكررات (ن = 4) تم تشغيلها من كل عينة وبلغ متوسط ​​القيم ط م. وتطبيع كل القيم ط م لأكتين-β. أشرطة الخطأ تمثل مجموعة من التغيير أضعاف وفقا لما يحدده بيانات مساعدة البرنامج. واعتبر ع <0.05 ذات دلالة إحصائية في التغيرات النسبية بين أضعاف ثرومبين-علاج مجموعة والمجموعة الضابطة من قبل كل من RNA-يليها والمقايسات QRT-PCR. تم تعيين تعسفا مستوى مرنا في مجموعات المراقبة من قبل كل فحص واحد، والتي لا تظهر. *، p <0.05؛ **، p <0.01. ويرد هذا الرقم من الرقم 6 في المرجع 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الرئيسية

التعامل مع RNA: RNases سوف تتحلل حتى أكثر عالية الجودة RNA، لذلك يجب توخي الحذر خلال العزلة، تخزين واستخدام RNA 10. يتم ارتداؤها دائما قفازات لمنع التلوث من RNases العثور على الأيدي البشرية. يجب تغيير القفازات في كثير من الأحيان، وخاصة بعد لمس الجلد، مقابض الأبواب أو السطوح المشتركة الأخرى. يجب أن تكون مكرسة مجموعة من ماصات فقط لالحمض النووي الريبي العمل وجميع النصائح والأنابيب يجب أن تكون خالية من ريبونوكلياز. يجب أن يتم تنفيذ RNA العزلة والمصب تطبيق في البلدان المنخفضة المرور تطهير المناطق التي عادة مع منتج مثل ريبونوكلياز-انطلق. يمكن أن يحدث أيضا مع تدهور دورات تجميد ذوبان الجليد المتكررة. يمكن التقليل من هذه aliquoting من RNA للتطبيقات المصب فور العزلة. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء [كدنا] للتطبيق مثل المصب QRT-PCR مباشرة بعد العزلة. يجب أن يتم تخزين RNA في C ° -80 ويحرص على الجليد أثناء الاستخدام. بل هو أيضا عفريتortant إلى ذوبان الجليد بدقة ودوامة عينات الحمض النووي الريبي قبل وأثناء الاستخدام.

نوعية بدءا من الحمض النووي الريبي هو أمر أساسي لنجاح هذا البروتوكول. يمكن استخدام RNA منخفضة الجودة المتدهورة أو التسبب بأي إعداد مكتبة للفشل أو يؤدي إلى انخفاض العائد من شأنها أن تكون كافية لالتسلسل. حتى لو يمكن إجراء ما يكفي من مكتبة RNA المتدهورة أو منخفضة الجودة، فإنه لا يمثل بدقة النصوص موجودة في العينة، مما أدى إلى الكمي غير دقيقة التعبير. أيضا، يمكن لأي الحمض النووي الجيني unremoved خلال العزلة RNA يسبب الإفراط في تقييم كمية RNA المستخدمة في البروتوكول، ولكن إذا كان المبلغ (على سبيل المثال 1-2 ميكروجرام) في منتصف نطاق اقترح (0،1-4 ميكروغرام) ويستخدم، فإن المبلغ الفعلي من RNA تكون كافية للبروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، أي الحمض النووي الجيني ليس من المحتمل أن يتم انتقاؤها من قبل البناء بنسبة ضئيلة التمهيدي (DT) مكتبة مقرها في البروتوكول البورشيد القياسية، وبالتالي فإنه لن يسبب محطة الفضاء الدولية المصبUES مع مستويات النص أعرب مرنا. يجب الكمي لRNA بدءا باستخدام قراءات طيفية العادية تكون كافية وليس هناك حاجة لاستخدام الأساليب الكمية مثل درجة عالية من الدقة RiboGreen منذ سيتم المكتبات كميا بدقة بعد إعداد من qPCR ومستويات التعبير الجيني وتطبيع نسبة إلى العدد الإجمالي لل يقرأ خلال خطوات تحليل البيانات.

مكتبة الكمي. الكمي دقة من المكتبات هو أمر حيوي لتوليد المناسبة من المجموعات. سوف جزيئات الحمض النووي فقط مع محولات ligated بنجاح تشكيل مجموعات. سوف قراءات طيفية لا يفرق بين الحمض النووي DNA مع محولات ودون، والتي سوف تؤدي إلى الإفراط في تقييم تركيز المكتبة وتؤدي في نهاية المطاف تجمع تحت لخلية تدفق. فإن كمية الحمض النووي دون محولات ligated تختلف من مكتبة إلى مكتبة، حتى لو تم استخدام نفس RNA بدءجي المواد، لذلك يمكن للمرء أن يفترض أن نسبة بدقة مستوى القراءة الطيفي هو الحمض النووي مع محولات ligated. سوف يؤدون qPCR مع الاشعال محددة إلى محولات فقط الكشف عن تلك جزيئات الحمض النووي مع محولات ligated بنجاح لكلا طرفي الجزيء. هذا يسمح للالكمي المطلقة للمكتبات وبالتالي في كثافة الكتلة دقيقة. تقييم المكتبات بصك أو Experion bioanalyzer ومهم أيضا. وهذا يسمح لوضع تصور لنطاق حجم المكتبة، وهو أمر مهم خلال خطوات تحليل البيانات، ويضمن عدم وجود تلوث التي قد تتداخل مع الجيل العنقودية.

تحليل البيانات. في هذا البروتوكول، طبقنا TopHat لمواءمة RNA-يليها يقرأ لtranscriptome مرجعية الإنسان وأزرار أكمام لتجميع النصوص، وتقدير الكميات المتوفرة الخاصة بهم، واختبار للتعبير الفرق في الخلايا HMVEC-LBL ثرومبين المعاملة. TopHat وأزرار أكمام رالتعليم الجامعي أدوات شعبية، وأنها مجانية ومفتوحة المصدر البرمجيات 11. أظهرت دراسة حديثة أن أزرار أكمام كان لحساسية مرتفعة ونوعية في الكشف عن الإنترونات المشروح سابقا 12. ومع ذلك، وأزرار أكمام TopHat لا تعالج جميع الطلبات من RNA-يليها كما أنها ليست فقط أدوات لتحليل الحمض النووي الريبي، يليها 11. TopHat وأزرار أكمام تتطلب transcriptome إشارة أو التسلسل الجينوم. وهي مناسبة بشكل خاص لتحليل الحمض النووي الريبي، يليها البيانات الناتجة من آلات البورشيد أو الصلبة إما التسلسل ولكن ليس 454 أو الكهربائي الكلاسيكية الشعرية التسلسل منصة. يمكن للمستخدمين العمل دون الإشارة الجينوم التسلسل النظر أداء دي نوفو الجمعية transcriptome باستخدام أحد العديد من الأدوات مثل الثالوث ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ )، عبر الهاوية ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) أو الواحات ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ zerbino / الواحات / ). العديد من البرامج البديلة تحليل transcriptome موجودة الآن. لمسح لبرامج مختلفة، قد يرغب القراء لقراءة الدراسة التي غاربر وآخرون (13) ومارتن استعراض وانغ 14، التي تصف المزايا النسبية وعيوب والاعتبارات النظرية لمعظم البرامج حاليا واستخداما. اختيار استراتيجيات تحليل transcriptome (مرجع يستند إلى استراتيجية، دي نوفو استراتيجية، والاستراتيجية المشتركة) والبرامج يعتمد على عوامل كثيرة، بما في ذلك وجود أو اكتمال الجينوم المرجعية، وتوافر التسلسل والحوسبة الموارد، ونوع من مجموعة البيانات ولدت، والأهم،. الهدف الأسمى للمشروع تسلسل 14

وينبغي بذل نقطة أخرى: شاركقد mputer برامج لتحليل transcriptome لا تسفر عن دقة 100٪ من جميع التقارير نص. التسلسل الخطأ هو مصدر آخر للقلق. فمن المستحسن دائما أن يتم التحقق من صحة أي نص أعرب تفاضلي التي حددها RNA-يليها من الوقت الحقيقي PCR. ويعتبر التحقيق TaqMan الكيمياء القائمة على المعيار الذهبي لPCR الوقت الحقيقي. أيضا، ينبغي التحقق من صحة النصوص التي تم تشخيصها حديثا من خلال طريقة سانجر من تسلسل الحمض النووي قبل أي مزيد من التجارب.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

إعداد المكتبة: مسحة عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني قد يكون السبب بعد خطوات تحضير مكتبة من قبل المرحل من الخطوة النهائية تنقية حبة أثناء إعداد المكتبة. قد يرجع إلى المكتبات موقف المغناطيسي لخمس دقائق كاملة حل المشكلة. إذا لم يكن كذلك، قد تنبع من قضية تجزئة غير مكتملة من الحمض النووي الريبي خلال الخطوات الأولى للإعداد المكتبة. وهذا يمكن أن يحدث إذا المنخفضةيتم استخدام نوعية RNA أو إذا لم يتبع البروتوكول بالضبط. على سبيل المثال، تغيير درجة الحرارة أو أوقات الحضانة، مضيفا الكواشف في الترتيب غير صحيح أو التوقف بين التجزئة وتركيب حبلا الأول من [كدنا]. إذا إعادة المكتبات إلى موقف المغناطيسي لا يزيل DNA MW عالية، فإنه من المستحسن لتكرار إعداد مكتبة مع عينات الحمض النووي الريبي الطازجة.

إذا تم تخزين شدة الجولة الأولى أقل مما كان متوقعا، فمن الممكن أن الاشعال لم هجن إلى مجموعات بشكل صحيح أثناء الخطوة الأخيرة من الجيل كتلة أو خلية تدفق لفترة طويلة جدا بين المجموعات وبداية التسلسل: كثافة منخفضة تشغيل. في هذه الحالة، ينبغي إجراء rehybridization التمهيدي استخدام عدة rehyb التمهيدي من البورشيد. في معظم الأحيان، وهذا لا يحل القضايا rehyb كثافة والتي يمكن على المدى أكثر من دون أي مشكلة. إذا، بعد rehyb، وشدة لا تزال منخفضة، قد تكون المشكلةوينبغي مع المكتبات أو تسلسل من الكواشف (SBS) توليف والخدمات التقنية البورشيد ان اتصل لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أخرى. إذا شدة والقراءة الأولى هي جيدة، ولكن شدة منخفضة بعد بدوره حولها، قد rehyb التمهيدي للقراءة الثاني التمهيدي يكون ضروريا. يتم تنفيذ هذا الصك على التسلسل والخدمات التقنية البورشيد يجب الاتصال لإجراء العملية.

ارتفاع التدريجي / prephasing: إذا لوحظ أعلى من المعتاد أو الإلغاء prephasing، والسبب المحتمل هو تلوث الكواشف SBS أخرى مع العازلة الانقسام. خلال خطوات إعداد SBS، فمن الضروري للتعامل مع الانقسام مشاركة العازلة وتغيير القفازات بين التعامل مع المخزن المؤقت الانقسام وأي الكواشف الأخرى. إذا اشتبه الانقسام التلوث العازلة، ينبغي إجراء rehyb التمهيدي للخلية تدفق وينبغي إعداد الكواشف الجديدة SBS. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون هناك تلوث في خطوط من معاهد rument. إذا اشتبه ذلك، فإن الصك ينبغي أن يخضع لعملية غسل الصيانة (اغتسل ثم من الماء قبل الغسيل هيدروكسيد الصوديوم، ثم يغسل بالماء النهائي)، ينبغي إجراء rehyb التمهيدي على خلية تدفق وينبغي إعداد الكواشف الجديدة SBS. إذا كانت القيم الإلغاء / prephasing هي مرتفعة نسبيا (~ 0.5)، قد يستمر على المدى حتى يتم احتساب الدرجات Q30 ومجموعات تمرير التصفية. قد تكون هذه المستويات لا تزال في الحدود المقبولة حتى مع مراحل عالية و / أو prephasing.

التعميم من هذا البروتوكول

في الوقت الذي تقتصر على HiScanSQ البورشيد، هذا البروتوكول تنطبق على أي من الأسرة أو محلل HiSeq الجينوم الثاني من الصكوك البورشيد ( www.illumina.com ) مع تعديلات طفيفة من الخطوات الجيل العنقودية والكواشف التسلسل. تسلسل الحمض النووي الأخرى الجيل المقبل من منصات مثل سلسلة الصلبة ("_blank"> www.lifetechnologies.com)، ونظم GS ( www.454.com ويعمل أيضا)، وكذلك بعض النظم الجديدة الناشئة لغرض RNA-يليها 11. على الرغم من أن إنشاء تلك المكتبة وإجراءات التسلسل قد تكون مختلفة قليلا، والتعامل مع نصائح RNA، وأجزاء تحليل البيانات (المصب من الخطوات CASAVA) والتحقق من صحة من قبل RT-PCR الواردة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة مرجعية لتطبيقات RNA-يليها من .

وينبغي أيضا أن يكون أشار إلى أن هذا البروتوكول لا RNA-محددة ليليها في نقطة زمنية واحدة من الخلايا HMVEC-LBL ثرومبين المعاملة، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف مع دراسة متعددة نقطة أو دراسات في الوقت الخلايا الأخرى والأنسجة تعامل مع محفزات أو مثبطات مختلفة، أو مقارنات بين transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيفن Kingsmore والطب الجينوم مركز طب الأطفال في مستشفيات الرحمة للأطفال وعيادات لاستخدام مجموعات الحوسبة من أجل تحليل البيانات المتوفرة لدينا، البورشيد لفريق الخدمة الميدانية (اليزابيث بوير، كوك سكوت وكوك مارك) والتقنية فريق استشاري لردودها سريعة ومقترحات مفيدة على التوالي الصك الجيل القادم التسلسل DNA، HiScanSQ، وتحليل البيانات النوعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL080042 (لSQY) وبدء صندوق الوقف للمستشفيات والرحمة للأطفال وعيادات. جامعة ميسوري في مدينة كنساس (لSQY)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics
Thrombin Sigma T4393
Ambion mirVana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA Preparation Kit Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript Reverse Transcriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Cycle SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ* Illumina SY-103-2001
cBot Illumina SY-301-2002
qPCR machine - Viia7 Life Technologies Model #VIIA7 / Equipment #10631261 Or equivalent
Experion System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer is an alternative system
Spectrophotometer Bio-Tek Epoch Microplate Spectrophotometer Or equivalent
Centrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Or equivalent
Magnetic stand Life Technologies AM10027
96-well thermocycler General Lab Supplier
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Tags

علم الوراثة، العدد 72، البيولوجيا الجزيئية، علم المناعة، والطب، وعلم الجينوم، والبروتينات، وRNA-يليها، الجيل التالي تسلسل الحمض النووي، Transcriptome، التدوين، الثرومبين، الخلايا البطانية، وارتفاع الإنتاجية، DNA، الحمض النووي الجيني، RT-PCR، PCR
RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheranova, D., Gibson, M.,… More

Cheranova, D., Gibson, M., Chaudhary, S., Zhang, L. Q., Heruth, D. P., Grigoryev, D. N., Qing Ye, S. RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (72), e4393, doi:10.3791/4393 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter