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Biology

थ्रोम्बिन इलाज में आरएनए - seq Transcriptomes का विश्लेषण और नियंत्रण मानव फेफड़े Microvascular endothelial कोशिकाओं

Published: February 13, 2013 doi: 10.3791/4393
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Summary

यह प्रोटोकॉल का एक पूर्ण और विस्तृत प्रक्रिया मानव थ्रोम्बिन उपचार के साथ या बिना फेफड़े microvascular endothelial कोशिकाओं में प्रोफाइल transcriptomes आरएनए seq, एक शक्तिशाली अगली पीढ़ी के डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी, लागू प्रस्तुत करता है. यह प्रोटोकॉल विभिन्न कोशिकाओं या ऊतकों अलग अभिकर्मकों या रोग राज्यों द्वारा प्रभावित generalizable है.

Protocol

इस प्रोटोकॉल की रूपरेखा प्रवाह संचित्र चित्र 1 में प्रदर्शित किया जाता है.

1. कोशिकाओं की थ्रोम्बिन, शाही सेना अलगाव, गुणवत्ता और शाही सेना का आकलन मात्रा के साथ उपचार

  1. संस्कृति मानव फेफड़ों Microvascular 90-100% संगम Endothelial (HMVEC LBL) मध्यम ईजीएम-2 में 6 अच्छी तरह प्लेटें में 5% FBS, वृद्धि कारक है और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कोशिकाओं (LONZA, बिल्ली # सीसी 3202).
  2. भुखमरी मीडिया (0% FBS) 30 थ्रोम्बिन के साथ इलाज के लिए पहले मिनट के लिए मीडिया बदलें.
  3. 0.05 यू / मिलीलीटर थ्रोम्बिन के साथ कोशिकाओं का इलाज या 37 पर 6 घंटे के लिए एक नियंत्रण के रूप में इलाज छोड़ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  4. इलाज और निर्माता के निर्देशों के अनुसार नियंत्रण Ambion मीर Vana किट का उपयोग कोशिकाओं से कुल शाही सेना को अलग.
  5. Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन (स्टेशन पर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक Experion StdSense यूकेरियोटिक शाही सेना के चिप के साथ शाही सेना की गुणवत्ता का आकलन= "_blank"> Www.bio rad.com).
  6. यों शाही सेना एक मानक spectrophotometric विधि का उपयोग.

2. लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण

  1. सामग्री शुरू करने के रूप में उच्च गुणवत्ता के नमूने के अनुसार कुल शाही सेना के 1 ग्राम का प्रयोग करें.
  2. करने के लिए पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, Illumina प्रोटोकॉल (15008136 # रेव एक) से मानक प्रक्रिया का पालन करें. इस प्रोटोकॉल में, पाली के दो राउंड (ए) युक्त mRNA चयन rRNA दूर rRNA अनुक्रमण को कम करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.
  3. Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन स्टेशन (मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक Experion डीएनए 1K चिप का उपयोग पुस्तकालयों की गुणवत्ता का आकलन www.bio rad.com ).
  4. QPCR का उपयोग कर पुस्तकालय यों: एक पुस्तकालय है कि पहले एक मानक वक्र और ligated एडाप्टर के लिए विशिष्ट प्राइमरों के रूप में अनुक्रम निर्धारण किया गया है का उपयोग करें. अज्ञात पुस्तकालयों (1:100 यानी, 1:500 और 1:1,000) dilutions की एक श्रेणी का उपयोग करें. भागो qPCR accoSyberGreen एम.एम. प्रोटोकॉल rding और प्रत्येक पुस्तकालय के मूल स्टॉक एकाग्रता की गणना.
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 एनएम और स्टोर करने के लिए एक प्रवाह सेल क्लस्टर के लिए तैयार है जब तक पुस्तकालय स्टॉक पतला.
  6. जब एक प्रवाह सेल क्लस्टर के लिए तैयार है, एक पानी में स्नान CBOT अभिकर्मक प्लेट पिघलना करने के. CBOT एक Illumina साधन क्लस्टर पीढ़ी की प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  7. CBOT साधन धो लें.
  8. Denature पुस्तकालयों: ट्यूब के पक्ष में 13 μl 1x ते और 6 μl 10 सुक्ष्ममापी पुस्तकालय और गठबंधन, 1 μl एन 1 NaOH (Illumina द्वारा प्रदान की गई) जोड़ने के. भंवर, स्पिन नीचे, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और बर्फ पर विकृत पुस्तकालयों जगह.
  9. पतला पुस्तकालयों: 12 बजे के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 996 μl HT1 और 4 μl विकृत पुस्तकालय के संयोजन के द्वारा पूर्व ठंडा संकरण बफर (HT1, Illumina द्वारा प्रदान की गई) के साथ विकृत पुस्तकालयों पतला. बर्फ पर विकृत और पतला पुस्तकालयों रखें.
  10. CBOT प्लेट की ट्यूबों के प्रत्येक पंक्ति उलटेंयह सुनिश्चित करना है कि सभी अभिकर्मकों thawed हैं. नीचे प्लेट स्पिन / पंचर पन्नी जवानों को हटाने और CBOT पर लोड.
  11. अशेष भाजक पतला, एक स्ट्रिप ट्यूब विकृत पुस्तकालयों के 120 μl, 1-8 लेबल. प्रत्येक ट्यूब में एक नियंत्रण कील के रूप में 1.2 μl पतला विकृत PhiX नियंत्रण पुस्तकालय (Illumina से) जोड़ें. भंवर और नीचे ट्यूबों स्पिन और उन्हें सही ओरिएंटेशन में CBOT (सही करने के लिए ट्यूब # 1) पर लोड.
  12. लोड प्रवाह और CBOT पर सेल कई गुना.
  13. पूरा प्रवाह की जाँच करें और क्लस्टरिंग रन शुरू.
  14. रन के बाद पूरा हो गया है, सभी गलियों भर अभिकर्मक वितरण की जांच. किसी भी असामान्यताओं का ध्यान करें. या तो अनुक्रमण रन तुरंत शुरू करने के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदान की ट्यूब में प्रवाह सेल की दुकान
  15. (एसबीएस, Illumina) अनुक्रमण द्वारा संश्लेषण अभिकर्मकों पिघलना के.
  16. अभिकर्मक ट्रे पर उपयुक्त स्थानों के लिए अभिकर्मकों लोड, दरार मिश्रण को छूने के बाद अन्य अभिकर्मकों नहीं छूना सुनिश्चित बनाने.
  17. एक नहींn अनुक्रमण प्रवाह सेल (यानी एक है कि पहले अनुक्रम निर्धारण किया गया था), प्रधानमंत्री अभिकर्मक लाइनों दो बार.
  18. 70% EtOH और Kimwipes के साथ अच्छी तरह से अनुक्रमण प्रवाह सेल, 70% EtOH और लेंस कागज द्वारा बाद साफ. किसी भी धारियाँ के लिए प्रवाह सेल का निरीक्षण किया. यदि आवश्यक हो तो इसे फिर से साफ करने के लिए.
  19. Sequencer पर प्रवाह सेल लोड और एक प्रवाह प्रदर्शन जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि manifolds और प्रवाह सेल के बीच सील तंग है.
  20. शुरू अनुक्रमण रन.
  21. गुणवत्ता (जैसे क्लस्टर घनत्व, फिल्टर गुजर समूहों, Q30, तीव्रता मैट्रिक्स) के रूप में वे चलाने के दौरान उपलब्ध हो का आकलन करें.
  22. मॉनिटर चलाने भर तीव्रता.
  23. 101 चक्र के बाद पूरा कर रहे हैं, प्रतिवर्तन रसायन शास्त्र का प्रदर्शन करने के लिए 2 पढ़ने के पूरा: पिघलना के बनती अंत अभिकर्मकों और 2 पढ़ा निगमन बफर (आईसीबी, SBS अभिकर्मकों के एक घटक, Illumina) और अभिकर्मकों लोड.
  24. अनुक्रमण रन जारी, 2 एन डी तीव्रता, Q30 एक पढ़ने का आकलनएन डी रन के रूप में की प्रगति के अन्य गुणवत्ता मैट्रिक्स.

3. डेटा विश्लेषण

  1. का नवीनतम संस्करण CASAVA (Illumina, वर्तमान में 1.8.2) का उपयोग करने के लिए fastq फ़ाइलों आधार कॉल (बीसीएल) फ़ाइलें परिवर्तित, fastq क्लस्टर गिनती 0 से स्थापित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक एकल fastq फ़ाइल का निर्माण सुनिश्चित . बहाव के विश्लेषण के लिए fastq फ़ाइलों को खोलना.
  2. बनती अंत (1.4.1) Tophat 5, के नवीनतम संस्करण है जो आरएनए - seq स्तनधारी जीनोम आकार अल्ट्रा उच्च throughput कम पढ़ें (bowtie, 0.12.7) aligner 6 और SAMtools (0.1 का उपयोग करने के लिए पढ़ता है aligns का उपयोग संरेखण प्रदर्शन. 17) 7. SAMtools सैम प्रारूप में पोस्ट प्रसंस्करण alignments के लिए विभिन्न सुविधाएं लागू करता है. संदर्भ मानव transcriptome iGenomes (से डाउनलोड किया जा सकता www.illumina.com ). Tophat चल रहा है, हम सभी मूलभूत fr unstranded (डिफ़ॉल्ट) के रूप में पुस्तकालय प्रकार विकल्प सहित पैरामीटर सेटिंग का इस्तेमाल किया.
  3. हमेंकार्यक्रम CuffDiff, कफ़लिंक का हिस्सा (1.3.0) 8 सॉफ्टवेयर पैकेज आईएनजी, नियंत्रण कोशिकाओं को थ्रोम्बिन का इलाज कोशिकाओं की तुलना करने के लिए बाहर विभिन्न व्यक्त पूर्व में जीन टेप मानव संदर्भ transcriptome पर आधारित स्क्रीन. इस तुलना ज्ञात टेप के अंतर की अभिव्यक्ति का पता लगाता है. Microsoft Excel का उपयोग करने के लिए तालिका के रूप में परिणाम कल्पना. कफ़लिंक प्रोग्राम चल रहा है, हम सभी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेटिंग्स का इस्तेमाल किया. FPKM <0.05 और पी> के साथ वे जीन टेप 0.05 बाहर फ़िल्टर्ड रहे हैं.
  4. उपन्यास isoforms का पता लगाने के लिए एक संदर्भ transcriptome बिना कफ़लिंक चलाते हैं. संदर्भ Cuffcompare का उपयोग कर जीनोम नमूना प्रतिलिपि फ़ाइलों की तुलना करें और Cuffdiff एक विश्लेषण के लिए संदर्भ जीनोम और एक 2 विश्लेषण के लिए संदर्भ जीनोम के रूप में संयुक्त नियंत्रण प्रतिलिपि फ़ाइलों के रूप में संयुक्त थ्रोम्बिन प्रतिलिपि फ़ाइलों का उपयोग कर के साथ अंतर अभिव्यक्ति का परीक्षण. Microsoft Excel का उपयोग तालिका रूपी स्वरूप में परिणाम कल्पना. फिर thos,ई FPKM <0.05 और पी> साथ जीन टेप 0.05 बाहर फ़िल्टर्ड रहे हैं. इस कदम के बाद, जांचकर्ताओं UCSC जीनोम ब्राउज़र (वेबसाइट नव रिपोर्ट टेप की एक सूची अपलोड चुनते कर सकते हैं http://genome.ucsc.edu/ ) एक मैनुअल निरीक्षण द्वारा उनकी वैधता की पुष्टि.
  5. सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए, विभिन्न व्यक्त जीनों की सूची जमा www.ingenuity.com ) जीन और रास्ते थ्रोम्बिन उपचार द्वारा प्रभावित के लक्षण वर्णन के लिए. इस चरण में, जांचकर्ताओं (कमरबंद का उपयोग चुनते कर सकते हैं http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), एक अनुसंधान पैकेज है कि सहायता और कफ़लिंक आरएनए - seq उत्पादन का विश्लेषण के काम को आसान बनाने के लिए बनाया गया है, प्रबंधन में मदद, कल्पना और एक Cuffdiff विश्लेषण द्वारा उत्पादित डेटा के सभी एकीकृत.

4. आरएनए - seq परिणाम की मात्रात्मक वास्तविक समय पो द्वारा सत्यापनlymerase चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर)

  1. नियंत्रण और थ्रोम्बिन का इलाज HMVEC LBL कोशिकाओं, शाही सेना गुणवत्ता मूल्यांकन और आरएनए 1.6 1.4 चरणों में वर्णित मात्रा का ठहराव से कुल शाही सेना अलगाव प्रदर्शन.
  2. 1 सुपरस्क्रिप्ट III पहली Strand संश्लेषण प्रणाली RT किट के साथ प्रत्येक नमूना के ग्राम कुल शाही सेना निर्माता के निर्देशों (Invitrogen, 18080-051) के बाद से उत्पन्न पूरक डीएनए.
  3. QRT-पीसीआर विश्लेषण एक एप्लाइड Biosystems VIIa 7 रियल टाइम पीसीआर, CUGBP (Hs00198069_m1 CELF1) ELAV - likefamilymember1, Fanconianemia, complementationgroupD2 (Hs00276992_m1 FANDCD2), TNFreceptor का पता लगाने के लिए TaqMan परख पर मांग oligonucleotides का उपयोग कर प्रणाली पर प्रदर्शन 1 - जुड़े कारक (Hs01090170_m1 TRAF1), और β-actin (ACTB, Hs99999903_m1). प्रत्येक नमूना एक टेम्पलेट कुल शाही सेना के 5 एनजी बराबर था. DDCt विधि का उपयोग कर quantitation उपाय और β-actin के लिए मानक के अनुसार. प्रत्येक परख कम से कम तीन replicates जैविक भर में प्रदर्शन किया गया था.

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Representative Results

चरण 1: 28S: 18s अनुपात परंपरागत रूप से शाही सेना गिरावट का एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है. आदर्श रूप में, 28S शिखर 18s बैंड (2 के एक अनुपात) के लगभग दो बार क्षेत्र में होना चाहिए, लेकिन यह आदर्श अनुपात अक्सर व्यवहार में देखा नहीं है. इसके अलावा, 28S: 18s अनुपात spectrophotometric तरीकों से प्राप्त शाही सेना की गिरावट की मात्रा को नजरअंदाज कर सकते हैं. अधिक सही और गिरावट, इसलिए शाही सेना नमूना की गुणवत्ता यों, Experion प्रणाली एक शाही सेना गुणवत्ता संकेतक संख्या (RQI) खरीदते हैं. RQI एल्गोरिथ्म मानकीकृत, अपमानित शाही सेना के नमूने की एक श्रृंखला से डेटा शाही सेना के नमूने के electropherogram तुलना और स्वचालित रूप से 10 (बरकरार आरएनए) और 1 (अपमानित आरएनए) के बीच एक नंबर देता है. शाही सेना गुणवत्ता कम से कम 7 की एक RQI, आदर्श 8 से अधिक चित्रा 2 Experion 8.4 की एक RQI के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए नमूना का उपयोग कर परिणाम से पता चलता है. चाहिए.

के लिएचरण 2: पुस्तकालयों लगभग 250-300 बीपी पर एक व्यापक बैंड चित्रा 3 में उच्च गुणवत्ता के एक पुस्तकालय Experion परिणामों से पता चलता है चित्रा 4 मानक वक्र के नमूनों की qPCR परिणाम और एक अज्ञात नमूना (गहरे नीले रंग में दिखाया गया है) से पता चलता है. अनुक्रमण रन की प्रगति और गुणवत्ता लगातार चलाने भर में मनाया जाना चाहिए चित्रा 5 1 चक्र इमेजिंग चरण के दौरान उपयुक्त क्लस्टर घनत्व से पता चलता है, इस चलाते गुणवत्ता का पहला संकेत है. क्लस्टर उज्ज्वल और ध्यान केंद्रित हो चित्रा 6 से पता चलता पहले बेस पहले चक्र के बाद उत्पन्न रिपोर्ट पूरा हो गया है. चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि इस बिंदु पर अनुमानित क्लस्टर घनत्व, तीव्रता के स्तर, और ध्यान गुणवत्ता का आकलन. 4 चक्र के बाद अगले गुणवत्ता जांच की चौकी, 7 चित्रा में दिखाया गया है. यह प्रत्येक लेन के लिए पूर्ण क्लस्टर घनत्व से पता चलता है. क्लस्टर घनत्व 850 कश्मीर / 2 मिमी से ऊपर नहीं होना चाहिए. 13 चक्र के बाद,(एक चक्र के दौरान जब एक आधार नहीं जोड़ा जाता है) को चरणबद्ध और आँकड़े prephasing (जब दो ठिकानों का एक चक्र के दौरान जोड़ रहे हैं) की गणना कर रहे हैं, के रूप में 8 चित्र में दिखाया गया है. विशिष्ट संख्या 0.1 और 0.25 के बीच हैं. प्रमुख गुणवत्ता के आकलन के 24 चक्र, जब कई गुणवत्ता मीट्रिक की गणना कर रहे हैं के बाद संभव है. Q30 ऊपर पढ़ता प्रतिशत, 9 चित्र में दिखाया गया है, बेस फोन में विश्वास का एक उपाय है. एक 30 के एक क्यू स्कोर के साथ पढ़ने का मतलब है कि वहाँ 1 1000 में एक मौका है कि बेस कॉल गलत है. क्यू स्कोर रन की प्रगति के रूप में कम है, लेकिन बैठक या Q30 से अधिक पढ़ता है की 95% से अधिक के साथ बाहर शुरू कर देना चाहिए. गुजर समूहों फिल्टर (पीएफ), 10 चित्र में दिखाया गया है, समूहों से जो वास्तविक अनुक्रम डेटा ले जाया जाएगा. आदर्श रूप में, यह 85% से ऊपर होना चाहिए. क्लस्टर पीएफ चरणबद्ध, prephasing तीव्रता, और Q30 सहित कई कारकों पर आधारित है. यह रन की प्रगति के रूप में नहीं बदल जाएगा. प्रतिशत गठबंधन (

चरण 3: 1 टेबल व्यक्त जीनों और दोनों नियंत्रण और थ्रोम्बिन का इलाज मानव फेफड़े microvascular endothelial कोशिकाओं में isoforms प्रस्तुत करता है. विशेष रूप से, वहाँ २६००० उपन्यास के बारे में पता लगाया isoforms, जो की ताकत दिखाता है आरएनए - seq यह अज्ञात RNAs, वैकल्पिक रूप से spliced ​​टेप और वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग जो 3 माइक्रोएरे तकनीक द्वारा detectable नहीं कर रहे हैं की पहचान कर सकते हैं. आरएनए - seq भी कम प्रचुर मात्रा टेप है कि inaccurately मात्रा निर्धारित कर रहे हैं या प्रोटीन द्वारा पता नहीं उपाय कर सकते हैं. 12 चित्रा और टेबल 2 प्रदर्शन differentially थ्रोम्बिन संकेतन मार्ग में जीन व्यक्त की है. मार्ग टोपोलॉजी आधारित दृष्टिकोण, सरलता मार्ग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग: यह तीसरी पीढ़ी ज्ञान मार्ग आधार संचालित 9 विश्लेषण का एक उदाहरण है. यह पता चलता है कि एक छह घंटे थ्रोम्बिन उपचार काफी थ्रोम्बिन रिसेप्टर संसद को नियंत्रित 4 और थ्रोम्बिन रिसेप्टर Par 3 नीचे को नियंत्रित करता है जबकि वहाँ थ्रोम्बिन रिसेप्टर 1 संसद की अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं है. की अभिव्यक्ति NFkB1, NF kB2 और एसआरसी भी काफी विनियमित. रो परिवार के जीनों के कुछ (रो बी, सी, एफ और जी) विनियमित कर रहे हैं, जबकि दूसरों को (रो जम्मू, क्यू, T1, यू और वी) नीचे विनियमित (4 तालिका). मायोसिन प्रकाश श्रृंखला 9 जीन (MYL9) विनियमित है, जबकि MYL12B नीचे विनियमित है. अन्य जीनों की अभिव्यक्ति या तो नीचे विनियमित या प्रभावित नहीं है.

चरण 4: आरएनए - seq एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर परिणाम को मान्य करने के लिए, हम परख तीन diffe qRT-पीसीआर के लिए एक प्रयोग प्रदर्शनकिराए पर जीन (13 चित्रा). आरएनए - seq डेटा में, TRAF1 विनियमित 7.96 गुना, 1.16 गुना से नीचे CELF1 विनियमित किया गया था, और FANCD2 1.70 गुना से नीचे विनियमित. QRT-पीसीआर डेटा में, इन इसी संख्या 7.25 गुना -1.15 गुना और -2.07 गुना क्रमशः, कर रहे हैं. इन तीन आरएनए - seq और qRT-पीसीआर द्वारा assayed जीनों के परिणाम अच्छा समझौता है, जो आरएनए - seq परिणाम की पुष्टि होती है.

जीन
नियंत्रण थ्रोम्बिन
कुल जीनों व्यक्त 16,636 16,357
केवल नियंत्रण 783
केवल थ्रोम्बिन 504
ऊपर विनियमित (2 गुना या अधिक से अधिक अंतर) 152
नीचे विनियमित (2 गुना या छreater अंतर) 2190
ज्ञात isoforms
नियंत्रण थ्रोम्बिन
कुल जाना जाता है isoforms व्यक्त 26,807 26,300
केवल नियंत्रण १४९२
केवल थ्रोम्बिन 985
ऊपर विनियमित (2 गुना या अधिक से अधिक अंतर) 480
नीचे विनियमित (2 गुना या अधिक से अधिक अंतर) +३५७४
उपन्यास isoforms
नियंत्रण थ्रोम्बिन
कुल उपन्यास isoforms व्यक्त 25,880 25,886
केवल नियंत्रण 418
केवल थ्रोम्बिन 424
ऊपर विनियमित (2 गुना या अधिक से अधिक अंतर) १,७७५
नीचे विनियमित (2 गुना या अधिक से अधिक अंतर) 12,202

तालिका 1. जीन / isoform अभिव्यक्ति सारांश * इस तालिका जीन, ज्ञात isoforms और उपन्यास नियंत्रण और थ्रोम्बिन इलाज HMVEC LBL कोशिकाओं में व्यक्त isoforms सूचीबद्ध करता है. गुना परिवर्तन प्रतिलिपि perMillion (FPKM) मैप FPKM को नियंत्रित करने टुकड़े थ्रोम्बिन FragmentsPerKilobase का अनुपात है. उन जीन, ज्ञात isoforms 2 गुना या अधिक से अधिक दो समूहों के बीच अंतर के साथ और उपन्यास isoforms सांख्यिकीय अलग अभिव्यक्ति के स्तर (रूप में Benjamini - Hochberg सुधार के बाद निर्धारित) है. * इस तालिका 4 संदर्भ में 2 टेबल से reproduced है.

नीचे विनियमित जीन
जीन प्रतीक कुल मिलाकर मोड़ो बदलें सदस्य व्यक्तिगत मोड़ो बदलें ** q_value FPKM नियंत्रण FPKM थ्रोम्बिन
पीएलसी -2.49
PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611
PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957
PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837
PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017
GAQ -1.87
GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996
Gai -1.56
GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795
GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198
PKC -2.15
PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305
PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818
PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878
IP3R -2.60
ITPR1 -1.39 0.००,००,१८,७३४ 1.51592 1.09009
ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944
CREB -2.36
CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004
GATA -2.33
GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131
TBP -1.35
TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476
जी प्रोटीन अल्फा -1.64
GNA14 -1.49 .०००१२२४९६ 2.78076 1.86573
GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795
GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198
GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996
PAR3 -1.87
F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286
SOS1
SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679
रास -1.69
KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659
NRAS -1.61 0 38.0874 23.6491
AKT -1.77
AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223
MLCP -2.38
PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199
PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516
PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188
FAK -1.31
PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044
P70 S6K
RPS6KB1 -1.99 0 8.46312
रॉक -3.68
ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112
ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759
CAMK -1.17
CAMK1 1.30 0.००,०२,५५,५८७ 7.90794 10.296
CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804
CAMK4 -2.58 ०.००,०६,१९,०४५ ०.६२,७१४ 0.243277
ऊपर से विनियमित जीन
प्रतीक कुल मिलाकर मोड़ो बदलें सदस्य व्यक्तिगत मोड़ो बदलें ** q_value FPKM नियंत्रण FPKM थ्रोम्बिन
PAR4 1.59
F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253
एसआरसी 1.47
एसआरसी 1.47 0 14.1085 20.675
NF-kB 1.65
NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457
NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293
असली 1.45 0 55.3482 80.28
आंशिक Up-/Partial नीचे विनियमित जीन
प्रतीक कुल मिलाकर मोड़ो बदलें सदस्य व्यक्तिगत मोड़ो बदलें ** q_value FPKM नियंत्रण FPKM थ्रोम्बिन
जी प्रोटीन gamमा 1.22
GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206
GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05
GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023
GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132
जी प्रोटीन बीटा 1.27
GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43
GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504
GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484
रो जीईएफ -1.16
ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015
ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758
ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813
ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635
ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159
PI3K -1.80
एटीएम -6.84 0 4.98972 0.729483
PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234
PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852
PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228
PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129
PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507
PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419
PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256
PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763
PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942
रो 1.19
RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587
RHOC 1.38 458.267 630.235
RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268
RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172
RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317
RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122
RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755
RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092
RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591
RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075
विधान परिषद के सदस्य -1.06
MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472
MYL9 1.48 0 202.636 299.559

तालिका 2. विभिन्न व्यक्त थ्रोम्बिन संकेतन मार्ग में जीन और isoforms * टेबल S4 संदर्भ में 4 से एक मामूली संशोधन के साथ इस तालिका reproduced है. **, क्ष मूल्य, एक झूठी खोज पी - मूल्य समायोजित दर.

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चित्रा 1. आरएनए - seq मानव फेफड़े microvascular endothelial कोशिकाओं में transcriptome थ्रोम्बिन की मध्यस्थता की रूपरेखा के लिए प्रोटोकॉल के फ़्लोचार्ट. सबसे पहले, कोशिकाओं का इलाज और अलग और आरएनए मात्रा ठहराना. उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना से पुस्तकालयों को तैयार है और उनकी एकाग्रता के (qPCR माध्यम से) और गुणवत्ता (एक bioanalyzer के माध्यम से), तो एक प्रवाह सेल पर क्लस्टर का आकलन. अनुक्रमण चलाने के लिए शुरू और रन की गुणवत्ता का विश्लेषण भर. प्रमुख गुणवत्ता चौकियों चक्र 1, 4, 13 और 24 हैं. CASAVA का प्रयोग, बीसीएल fastq फाइल करने के लिए फ़ाइलों को परिवर्तित करने और फिर Tophat साथ जीनोम को उन संरेखित करें. कफ़लिंक का उपयोग कर ज्ञात और अज्ञात isoforms का पता लगाने और CuffDiff साथ अंतर अभिव्यक्ति निर्धारित. Excel में आउटपुट फाइल देखें और बाहर फिल्टर जीन है कि एक अभिव्यक्ति 0.05 कम से कम FPKM स्तर या 0.05 से भी बड़ा पी - मूल्य है. सरलता मार्ग विश्लेषण शेष जीन जीन कार्यों के बारे में अधिक जानकारी के लिए सबमिट करें और रास्ते में एकथ्रोम्बिन उपचार द्वारा ffected. आमतौर पर, विभिन्न व्यक्त जीनों के सेट का चयन कर रहे हैं qRT-पीसीआर के रूप में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण से मान्य है.

चित्रा 2
चित्रा 2. 8.4 Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन स्टेशन से विश्लेषण की एक RQI के साथ एक प्रतिनिधि आरएनए नमूना) उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना के व्यक्ति ट्रेस. X-अक्ष समय दर्शाया गया है और y-अक्ष फ्लोरोसेंट संकेत दर्शाया गया है बी) आभासी जेल तस्वीर एक उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए नमूना. 28S शिखर की तीव्रता 18S शिखर से अधिक है और कोई संदूषण देखा है. दोनों बैंड तेज और परिभाषित कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 3. उच्च गुणवत्ता शाही सेना से तैयार पुस्तकालय के रूप में Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन स्टेशन से विश्लेषण 250 और 300 बीपी के बीच एक व्यापक चोटी का पता चला है और कोई उच्च आणविक भार डीएनए (डीएनए contaminating) मनाया जाता है) व्यक्ति एक उच्च गुणवत्ता पुस्तकालय के निशान. x-अक्ष समय दर्शाया गया है और y-अक्ष फ्लोरोसेंट संकेत बी) के एक उच्च गुणवत्ता पुस्तकालय के आभासी जेल चित्र दर्शाया गया है. 250 और 300 बीपी के बीच एक व्यापक चोटी का पता चला है और कोई उच्च आणविक भार डीएनए (डीएनए contaminating) मनाया जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
<strong> चित्रा 4. qPCR SyberGreen और प्राइमरों Illumina ligated एडाप्टर के लिए विशिष्ट का उपयोग कर परिणाम पहले क्लस्टर पुस्तकालय मानक वक्र के रूप में प्रयोग किया जाता है नव तैयार पुस्तकालय के लिए इष्टतम क्लस्टरिंग एकाग्रता का निर्धारण. अज्ञात पुस्तकालय के कमजोर पड़ने मानक वक्र सांद्रता के भीतर गिर जाता है. मानक वक्र नमूने तीर से दोषी पाया जाता है और अज्ञात नमूना अंधेरे नीले और एक तीर से यह भी संकेत दिया है.

चित्रा 5
चित्रा 5. पहले चक्र इमेजिंग चरण के दौरान उपयुक्त क्लस्टर घनत्व समूहों स्पष्ट, ध्यान और उज्ज्वल हैं) बेस ए, बी) बेस सी, सी) बेस जी, डी) बेस टी.

<td 19892>
मीटरी 1 लेन 3 लेन 4 लेन 5 लेन 6 लेन 7 लेन 8 लेन
क्लस्टर घनत्व (कश्मीर / 2 मिमी) 420.94 412.95 410.81 408.54 416.71 416.56 410.02 411.84
एक तीव्रता 25870.5 23886 23891.38 23735.83 23949.38 24933.08 24305.79 23950.29
सी तीव्रता 21559.62 19822.33 19759.33 19472 19954.21 20611.75 19438.29
जी तीव्रता 13619.46 11756.67 11486.44 10498.38 12186.62 12195.5 11826.88 11010.5
टी तीव्रता 19402.67 17663.79 17854.42 17353.75 17545.54 18060.67 18457.92 17397.12
एक फोकस स्कोर 68.2 67.46 67.67 67.75 67.41 67.43 67.63 67.05
सी फोकस स्कोर 67.93 67.33 67.56 67.66 67.33 67.39 67.46 66.9
जी फोकस स्कोर 65.4 64.14 63.98 63.92 63.29 63.41 63.47 63.74
टी फोकस स्कोर 66.45 65.57 65.5 65.49 65.03 65.23 65.57 65.59

6 चित्रा. पहले बेस पहले चक्र के बाद उत्पन्न रिपोर्ट पूरा क्लस्टर घनत्व (हालांकि इस स्तर पर) को कम करके आंका है. उपयुक्त है. तीव्रता अच्छे लग रहे (10,000-26,000, जी सबसे कम तीव्रता होने के साथ). ध्यान केंद्रित स्कोर भी उपयुक्त हैं, 65-70 चारों ओर गिरने, हालांकि उच्च मूल्यों को भी उपयुक्त हैं.

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चित्रा 7. क्लस्टर घनत्व 4 चक्र के बाद गणना क्लस्टर घनत्व 850 कश्मीर / 2 मिमी की तुलना में कम है और यहां तक कि सभी गलियों भर) सारणीबद्ध रूप है,. बी) ग्राफ के रूप बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 8
चित्रा 8. (एक चक्र के दौरान एक आधार नहीं जोड़ने) चरणबद्ध और पूर्व चरणबद्ध (एक चक्र के दौरान दो कुर्सियां ​​जोड़ने) दोनों मूल्यों 0.25 या नीचे कर रहे हैं, उचित / पूर्व चरणबद्ध चरणबद्ध स्तरों का संकेत है.) चरणबद्ध और पूर्व चरणबद्ध संख्यात्मक मान बी.) ग्राफ के रूप में चरणबद्ध मान). सी पूर्व ग्राफ के रूप में मान चरणबद्ध. Clic यहाँ कश्मीर बड़ा आंकड़ा देखने.

9 चित्रा
9 चित्रा. 24 चक्र के बाद Q30 स्कोर के विभिन्न अभ्यावेदन 30 या अधिक का स्कोर 1 1000 में एक मौका है कि आधार कॉल गलत है इंगित करता है. बी) चक्र द्वारा Q30 स्कोर, क्यू स्कोर के 90% के आसपास 30 से ऊपर) सारणीबद्ध फार्म (यहाँ Q30 स्कोर चलाने की सम्पूर्णता से 24 चक्र के माध्यम से कर रहे हैं). प्रत्येक बार है कि विशेष रूप से चक्र के लिए Q30 या इसके बाद के संस्करण में गिरने पढ़ता सी) Q30 24 चक्र के माध्यम से स्कोर वितरण के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है. क्यू स्कोर के 24 चक्र के माध्यम से एक संचयी आधार पर वितरण. क्यू स्कोर पर x-अक्ष और पढ़ता के लाखों y-अक्ष पर है. 30 ऊपर Q30 हरे रंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं के साथ पढ़ता है.oad/4393/4393fig9large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

10 चित्रा
10 चित्रा. फिल्टर फिल्टर गुजर क्लस्टर गुजर समूहों के विभिन्न अभ्यावेदन Q30 तीव्रता, और / पूर्व चरणबद्ध चरणबद्ध सहित कई मापदंडों पर आधारित है. प्रत्येक गली में समूहों के कम से कम 85% फिल्टर गुजर रहे हैं ए) सारणीबद्ध फार्म, बी) ग्राफ फार्म, नीले बक्से समूहों की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं, हरे बक्से फिल्टर गुजर समूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

11 चित्रा 11 चित्रा. PhiX जीनोम के लिए समूहों के लगभग 0.5% गठबंधन समूहों के प्रतिशत PhiX जीनोम संरेखित करें, नमूने में नुकीला PhiX की राशि के लिए उपयुक्त ए) सारणीबद्ध फार्म, बी) ग्राफ के रूप बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

12 चित्रा
12 चित्रा. विभिन्न प्रकार से थ्रोम्बिन संकेतन मार्ग में HMVEC LBL की थ्रोम्बिन उपचार द्वारा व्यक्त जीनों थ्रोम्बिन संकेतन मार्ग सरलता द्वारा बनवाया गया था. मार्ग में, लाल रंग विनियमित (3 गुना 1.3) जीन और हरी नीचे विनियमित जीन का संकेत करता है ( तालिका 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं. यह आंकड़ा 4 संदर्भ में चित्रा 4 से reproduced है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें

13 चित्रा
13 चित्रा. थ्रोम्बिन का इलाज HMVEC LBL आरएनए - seq डेटा से तीन विभिन्न व्यक्त जीनों के सत्यापन qRT-पीसीआर. qRT-पीसीआर बाहर किया गया था के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित मोड़ो TaqMan जीन अभिव्यक्ति परख के CUGBP के लिए रिश्तेदार सीटी मूल्यों से निर्धारित परिवर्तन, परिवार के सदस्य 1 (CELF1), Fanconi एनीमिया, complementation समूह D2 (FANCD2) और TNF ELAV तरह रिसेप्टर जुड़े कारक 1 (TRAF1)आरएनए - seq द्वारा पाया उन लोगों के लिए तुलना में थे. Replicates (n = 4) प्रत्येक नमूने के चला रहे थे और सीटी मूल्यों औसतन. Β-actin सभी सीटी मूल्यों normalized थे. त्रुटि सलाखों डेटा सॉफ्टवेयर असिस्ट द्वारा निर्धारित गुना परिवर्तन की सीमा के रूप में प्रतिनिधित्व करते हैं. <0.05 पी थ्रोम्बिन इलाज समूह और नियंत्रण समूह के बीच रिश्तेदार गुना परिवर्तन में दोनों शाही सेना seq और qRT पीसीआर assays सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था. mRNA स्तर नियंत्रण समूहों में प्रत्येक परख द्वारा मनमाने ढंग से एक है, जो दिखाई नहीं कर रहे हैं के रूप में स्थापित किया गया था. * <0.05 पी; **, पी <0.01. यह आंकड़ा 4 संदर्भ में 6 चित्रा से reproduced है.

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Discussion

प्रमुख कदम

आरएनए हैंडलिंग: RNases भी सबसे उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना नीचा, इसलिए देखभाल अलगाव, भंडारण और 10 शाही सेना के उपयोग के दौरान लिया जाना चाहिए. दस्ताने को हमेशा के लिए मानव हाथ पर पाया RNases द्वारा प्रदूषण को रोकने के लिए पहने जाते हैं. दस्ताने अक्सर छू त्वचा, doorknobs या अन्य आम सतहों के बाद विशेष रूप से परिवर्तित किया जाना चाहिए. Pipettes का एक सेट पूरी तरह समर्पित किया जाना चाहिए काम शाही सेना और सभी सुझावों और ट्यूबों RNase मुक्त होना चाहिए. शाही सेना अलगाव और आवेदन नीचे की ओर है कि नियमित रूप से RNase जैप के रूप में इस तरह के एक उत्पाद के साथ decontaminated कम यातायात क्षेत्रों में किया जाना चाहिए. गिरावट भी दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र के साथ हो सकता है. बहाव के अनुप्रयोगों के लिए शाही सेना अलगाव पर तुरंत aliquoting द्वारा कम किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से अलगाव के बाद सीधे qRT-पीसीआर जैसे बहाव आवेदन के लिए सीडीएनए बनाया जा सकता है. आरएनए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए और प्रयोग के दौरान बर्फ पर रखा. यह भी है छोटा सा भूतपहले अच्छी तरह से पिघलना करने के ortant और भंवर शाही सेना के नमूने और प्रयोग के दौरान.

शाही सेना के शुरू गुणवत्ता इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए आवश्यक है. अपमानित या अन्यथा कम गुणवत्ता शाही सेना के उपयोग के लिए पुस्तकालय तैयारी के कारण असफल हो या कम उपज कि अनुक्रमण लिए अपर्याप्त होगी में परिणाम कर सकते हैं. यहां तक ​​कि अगर पर्याप्त पुस्तकालय अपमानित या कम गुणवत्ता शाही सेना से बनाया जा सकता है, यह सही नमूने में मौजूद टेप का प्रतिनिधित्व नहीं है, अभिव्यक्ति की गलत मात्रा जिसके परिणामस्वरूप जाएगा. इसके अलावा, शाही सेना अलगाव के दौरान किसी भी unremoved जीनोमिक डीएनए प्रोटोकॉल में इस्तेमाल शाही सेना की राशि का एक अनुमान से अधिक हो सकते हैं, लेकिन अगर सुझाव श्रृंखला के बीच में एक (जैसे 1-2 ग्राम) राशि (0.1-4 ग्राम) प्रयोग किया जाता है, शाही सेना की वास्तविक राशि प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त होगा. इसके अलावा, किसी भी जीनोमिक डीएनए oligo (डीटी) मानक Illumina प्रोटोकॉल में प्राइमर आधारित पुस्तकालय निर्माण द्वारा उठाया होने की संभावना नहीं है और इस प्रकार यह नीचे की ओर आईएसएस कारण नहीं होगाmRNA प्रतिलेख व्यक्त स्तर के साथ ues. शुरू नियमित spectrophotometric रीडिंग का उपयोग कर शाही सेना की मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त हो सकता है और वहाँ ऐसे RiboGreen रूप में बेहद सटीक मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करें, क्योंकि पुस्तकालयों qPCR और जीन की अभिव्यक्ति के स्तर से तैयार करने के बाद सही मात्रा निर्धारित किया जाएगा की जरूरत नहीं है की कुल संख्या के सापेक्ष सामान्यीकृत डेटा विश्लेषण चरणों के दौरान पढ़ता है.

लाइब्रेरी मात्रा पुस्तकालयों की सटीक मात्रा का ठहराव समूहों की उचित पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है. सफलतापूर्वक ligated एडेप्टर के साथ ही डीएनए अणु समूहों फार्म जाएगा. डीएनए के बीच Spectrophotometric रीडिंग एडेप्टर और डीएनए के साथ नहीं, बिना अलग होगा जो पुस्तकालय की एकाग्रता के एक अनुमान से अधिक में परिणाम देगा और अंततः प्रवाह सेल के तहत क्लस्टरिंग में परिणाम. ligated एडेप्टर बिना डीएनए की मात्रा पुस्तकालय से पुस्तकालय के लिए अलग है, भले ही आरएनए शुरू के रूप में इस्तेमाल किया गया थाआईएनजी सामग्री, तो एक सही कि spectrophotometric पढ़ने का एक मानक प्रतिशत ligated एडाप्टर के साथ डीएनए है नहीं मान सकते हैं. एडाप्टर के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ qPCR प्रदर्शन सफलतापूर्वक अणु के दोनों सिरों को ligated एडाप्टर के साथ केवल उन डीएनए अणु का पता लगाने जाएगा. यह पुस्तकालयों की एक पूर्ण मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है और में एक सटीक क्लस्टर घनत्व बारी. एक Experion साधन या एक bioanalyzer के साथ पुस्तकालयों का आकलन भी महत्वपूर्ण है. यह पुस्तकालय है, जो डेटा विश्लेषण चरणों के दौरान महत्वपूर्ण है के आकार रेंज के एक दृश्य की अनुमति देता है, और यह सुनिश्चित करता है कि वहाँ कोई संदूषण कि क्लस्टर पीढ़ी के साथ हस्तक्षेप कर सकते है.

डेटा विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में, हम करने के लिए पंक्ति में आरएनए - seq मानव संदर्भ transcriptome और कफ़लिंक पढ़ता टेप इकट्ठा करने के लिए, उनके abundances का अनुमान, और थ्रोम्बिन का इलाज HMVEC LBL कोशिकाओं में अंतर अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण Tophat लागू. Tophat और कफ़लिंक टी रहे हैंwo लोकप्रिय उपकरण है, और वे मुक्त, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर 11 हैं. हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि कफ़लिंक पहले एनोटेट introns 12 का पता लगाने में एक उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता थी. हालांकि, Tophat और कफ़लिंक आरएनए - seq के सभी आवेदनों का पता नहीं है और न ही वे आरएनए - seq 11 विश्लेषण के लिए केवल उपकरण हैं. Tophat और कफ़लिंक एक अनुक्रम संदर्भ transcriptome या जीनोम की आवश्यकता होती है. वे शाही सेना seq डेटा या तो Illumina या ठोस अनुक्रमण मशीनों लेकिन नहीं 454 या क्लासिक केशिका मंच अनुक्रमण वैद्युतकणसंचलन से उत्पन्न के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं. एक अनुक्रम संदर्भ जीनोम के बिना काम कर रहे उपयोगकर्ताओं डी Novo transcriptome विधानसभा प्रदर्शन पर विचार (ट्रिनिटी जैसे कई उपकरण का उपयोग कर सकते हैं http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), ट्रांस रसातल ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) या ओअसेस् ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ zerbino / / ओअसेस् ). अब कई विकल्प transcriptome विश्लेषण कार्यक्रम मौजूद हैं. विभिन्न कार्यक्रमों के एक सर्वेक्षण के लिए, पाठकों Garber एट अल द्वारा अध्ययन को पढ़ने की इच्छा हो सकती है. 13 और मार्टिन और 14 वैंग, जो तुलनात्मक फायदे और नुकसान और सबसे वर्तमान और आमतौर पर इस्तेमाल कार्यक्रमों के सैद्धांतिक विचार का वर्णन द्वारा समीक्षा. transcriptome विश्लेषण (संदर्भ आधारित रणनीति, डी Novo की रणनीति, और संयुक्त रणनीति) रणनीतियों और कार्यक्रमों के चुनाव एक संदर्भ जीनोम के अस्तित्व या पूर्णता, अनुक्रमण और कंप्यूटिंग संसाधनों की उपलब्धता, डेटा के प्रकार सेट सहित कई कारकों पर निर्भर करता है उत्पन्न और सबसे महत्वपूर्ण बात, अनुक्रमण 14 परियोजना के व्यापक लक्ष्य.

एक अन्य बिंदु बनाया जाना चाहिए: सहtranscriptome विश्लेषण के लिए mputer कार्यक्रमों सभी प्रतिलिपि रिपोर्टिंग के एक 100% सटीकता नहीं मिल सकता है. त्रुटि अनुक्रमण एक और चिंता का विषय है. यह हमेशा सलाह दी जाती है कि किसी भी विभिन्न व्यक्त आरएनए - seq द्वारा की पहचान की प्रतिलिपि वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मान्य किया जा. जांच के आधार पर TaqMan रसायन वास्तविक समय पीसीआर के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है. इसके अलावा, किसी भी आगे के प्रयोग से पहले नव पहचान टेप सेंगर डीएनए अनुक्रमण का विधि द्वारा मान्य किया जाना चाहिए.

समस्या निवारण

पुस्तकालय तैयारी: उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए के एक धब्बा के बाद पुस्तकालय तैयारी कदम की वजह से किया जा सकता है एक ले जाने पर अंतिम पुस्तकालय तैयारी के दौरान मोती शोधन कदम से. एक पूर्ण पाँच मिनट के लिए चुंबकीय खड़ा करने के लिए रिटर्निंग पुस्तकालयों के मुद्दे को हल कर सकते हैं. यदि नहीं, तो इस मुद्दे को शाही सेना के अधूरा विखंडन से पुस्तकालय तैयारी के पहले चरण के दौरान स्टेम सकता है. यह भी हो सकता है अगर कमगुणवत्ता आरएनए इस्तेमाल किया है या अगर वास्तव में प्रोटोकॉल का पालन नहीं किया है. उदाहरण के लिए, ऊष्मायन बार या तापमान में फेरबदल, गलत क्रम में अभिकर्मकों जोड़ने या विखंडन और सीडीएनए पहली भूग्रस्त के संश्लेषण के बीच pausing. यदि चुंबकीय खड़ा करने के लिए पुस्तकालयों लौटने उच्च मेगावाट डीएनए निकाल नहीं है, यह सलाह दी जाती है कि ताजा शाही सेना के नमूने के साथ पुस्तकालय तैयारी दोहराएँ.

कम तीव्रता: यदि 1 चक्र तीव्रता उम्मीद से कम है, यह संभव है कि प्राइमरों क्लस्टर पीढ़ी या प्रवाह सेल के अंतिम चरण के दौरान समूहों के लिए नहीं संकरण किया था ठीक से भी लंबे समय के लिए क्लस्टरिंग और अनुक्रमण के शुरू के बीच संग्रहीत किया गया था चलाते हैं. इस मामले में, एक किताब के rehybridization Illumina से एक किताब rehyb किट का उपयोग किया जाना चाहिए. ज्यादातर अक्सर, इस rehyb तीव्रता मुद्दों को हल करने और चलाने के किसी भी समस्या के बिना शुरू कर सकते हैं. यदि हां, तो एक rehyb के बाद, तीव्रता अभी भी कम हैं, मुद्दा हो सकता हैसंश्लेषण (एसबीएस) अभिकर्मकों और Illumina तकनीकी सेवा के द्वारा या अनुक्रम पुस्तकालयों के साथ आगे की समस्या निवारण के लिए संपर्क किया जाना चाहिए. यदि पहले पढ़ा तीव्रता अच्छा कर रहे हैं, लेकिन बारी के बाद कम तीव्रता के आसपास हैं, दूसरे पढ़ा प्राइमर के एक प्राइमर rehyb आवश्यक हो सकता है. यह अनुक्रमण साधन और Illumina तकनीकी सेवा की प्रक्रिया के लिए संपर्क किया जाना चाहिए पर किया जाता है.

उच्च चरणबद्ध / prephasing: यदि सामान्य चरणबद्ध या prephasing से अधिक मनाया जाता है, एक संभावित कारण दरार बफर के साथ अन्य SBS अभिकर्मकों संदूषण है. SBS तैयारी के दौरान, यह पिछले दरार बफर संभाल और दरार बफर की हैंडलिंग और किसी अन्य अभिकर्मकों के बीच दस्ताने में बदलाव करने के लिए आवश्यक है. अगर दरार बफर संदूषण का संदेह है, प्रवाह सेल की एक किताब rehyb और प्रदर्शन किया जाना चाहिए नया SBS अभिकर्मकों तैयार किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, वहाँ संदूषण inst के लाइनों में हो सकता है rument. यदि इस पर संदेह है, साधन एक रखरखाव धोने (एक पानी एक NaOH धोने द्वारा धो, एक अंतिम पानी से धो द्वारा पीछा) से गुजरना चाहिए, एक किताब के rehyb प्रवाह सेल पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए और नए SBS अभिकर्मकों तैयार किया जाना चाहिए. यदि चरणबद्ध / prephasing मूल्यों मामूली (0.5 ~), रन तक में Q30 स्कोर और फिल्टर गुजर समूहों की गणना कर रहे हैं जारी रखा जा सकता है. ये स्तर अभी भी उच्च चरणबद्ध और / या prephasing साथ भी स्वीकार्य सीमा में हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल के generalizability

हालांकि यह Illumina HiScanSQ के लिए विशिष्ट है, इस प्रोटोकॉल के किसी भी HiSeq परिवार या Illumina उपकरणों के जीनोम विश्लेषक (द्वितीय के लिए लागू है www.illumina.com क्लस्टर पीढ़ी कदम और अनुक्रमण अभिकर्मकों की मामूली संशोधनों के साथ). अन्य ठोस श्रृंखला के रूप में अगली पीढ़ी के डीएनए अनुक्रमण प्लेटफार्मों ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), जी एस (सिस्टम www.454.com ) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ उभरते नए सिस्टम भी 11 आरएनए - seq के उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं. हालांकि उनके पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण प्रक्रियाओं के थोड़ा अलग हो सकता है, शाही सेना से निपटने के सुझावों, डेटा विश्लेषण (CASAVA चरणों का के बहाव) RT-पीसीआर और सत्यापन हिस्सों में इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत संदर्भ मूल्य के उनके आरएनए - seq आवेदन करने के लिए किया जा सकता है .

यह भी बताया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल थ्रोम्बिन इलाज HMVEC LBL कोशिकाओं के एक बिंदु पर आरएनए - seq विशिष्ट है, लेकिन यह आसानी से एक बिंदु बहु समय अध्ययन या अन्य कोशिकाओं में अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, ऊतकों के साथ इलाज विभिन्न उत्तेजनाओं या inhibitors, या एक स्वस्थ राज्य और एक रोग राज्य के बीच या कोशिकाओं, ऊतकों में transcriptomes की तुलना.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए बच्चों की दया अस्पतालों और क्लीनिकों में डॉ. स्टीफन Kingsmore और बाल जीनोम चिकित्सा केंद्र हमारे डेटा विश्लेषण के लिए अपने कंप्यूटिंग समूहों के उपयोग के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूँगा, Illumina सेवा क्षेत्र (एलिजाबेथ बोयर, स्कॉट कुक और मार्क कुक) टीम और तकनीकी उनके त्वरित प्रतिक्रिया और अगली पीढ़ी के डीएनए अनुक्रमण साधन, HiScanSQ, और डेटा की गुणवत्ता विश्लेषण के चलने पर उपयोगी सुझाव के लिए सलाहकार टीम. इस काम के हिस्से में स्वास्थ्य HL080042 ग्रांट (SQY करने के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था और शुरू हुआ और बच्चों की दया अस्पतालों और क्लीनिकों की निधि बंदोबस्ती, कैनसस सिटी में मिसौरी विश्वविद्यालय (SQY करने के लिए).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics
Thrombin Sigma T4393
Ambion mirVana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA Preparation Kit Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript Reverse Transcriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Cycle SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ* Illumina SY-103-2001
cBot Illumina SY-301-2002
qPCR machine - Viia7 Life Technologies Model #VIIA7 / Equipment #10631261 Or equivalent
Experion System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer is an alternative system
Spectrophotometer Bio-Tek Epoch Microplate Spectrophotometer Or equivalent
Centrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Or equivalent
Magnetic stand Life Technologies AM10027
96-well thermocycler General Lab Supplier
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated.

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References

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Cheranova, D., Gibson, M.,… More

Cheranova, D., Gibson, M., Chaudhary, S., Zhang, L. Q., Heruth, D. P., Grigoryev, D. N., Qing Ye, S. RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (72), e4393, doi:10.3791/4393 (2013).

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