الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

Summary

يتم وصف الخطوات الضرورية لضبط اليومية والاستفادة المثلى من أداء عداد الكريات الشامل CyTOF. وتناقش التعليقات على إعداد العينات ومعدل التدفق الأمثل

Abstract

في السنوات الأخيرة، وتحليل السريع للخلايا واحدة وعادة أجريت باستخدام التدفق الخلوي والأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently. ومع ذلك فقد حد مسألة التداخل الطيفي للانبعاثات fluorophore عدد من التحقيقات في وقت واحد. في المقابل، فإن كتلة CyTOF جديدة عداد الكريات من قبل الأزواج العلوم DVS السائل نظام إدخال وحيدة الخلية إلى ¹ ICP-MS. وبدلا من fluorophores، تقترن البوليمرات التي تحتوي على نظائر المعادن مخلبية عالي التخصيب إلى الأجسام المضادة أو تحقيقات أخرى محددة. ^2-5 بسبب نقاء المعدن والقرار الجماعي للعداد الكريات الشامل، وليس هناك "تداخل الأطياف" من النظائر المجاورة، وبالتالي لا حاجة للمصفوفات التعويض. بالإضافة إلى ذلك، ونظرا لاستخدام المعادن اللانثينيدات، وليس هناك خلفية البيولوجية وبالتالي لا يعادل تألق ذاتي. مع نافذة تمتد الشامل الكتلة الذرية 103-203، نظريا يمكن تمييز ما يصل الى 100 في وقت واحد التسميات. حاليا، أكثر من 35 قنوات متاحة باستخدام الكواشف مخلبية المتاحة من العلوم DVS، مما يسمح للتشريح لم يسبق لها مثيل من الملف المناعية من العينات. ^6-7

عيوب لكتلة الخلوي تتضمن شرط صارمة لنظائر المعادن منفصلة في التحقيق (لا يعادل مبعثر إلى الأمام أو الجانب)، وحقيقة أنها هي تقنية المدمرة (أي إمكانية لاستعادة الفرز). التكوين الحالي للعداد الكريات الشامل لديها أيضا معدل نقل خلية من خلايا فقط ~ 25٪، مما يتطلب إدخال عدد أكبر من الخلايا.

الأداء اليومي الأمثل للعداد الكريات الشامل يتطلب العديد من الخطوات. الهدف الأساسي من التحسين هو تعظيم قوة إشارة المقاسة من نظائر المعادن المطلوب (M) مع التقليل من تشكيل أكاسيد (M +16) التي من شأنها أن تقلل من شدة إشارة M وتتداخل مع أي إشارة المرجوة في M +16. الخطوة الأولى هي عملية الاحماء الجهاز بحيث ساخنة، وأنا مستقرةوقد أنشئت CP البلازما. الثانية، يجب أن يكون الأمثل للإعدادات الحالية والمكياج معدل تدفق الغاز على أساس يومي. خلال جمع العينات، ويقتصر هذا الحدث من قبل خلية الحد الأقصى لمعدل الكفاءة للكشف عن وسرعة المعالجة إلى 1000 خلية / ثانية. ومع ذلك، وهذا يتوقف على نوعية العينة، حدث تباطؤ معدل الخلية (300-500 خلية / ثانية) وعادة ما يكون من المرغوب فيه السماح أفضل قرار بين الأحداث الخلايا، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من singlets سليمة أكثر من الحلل والحطام. وأخيرا، وتنظيف كافية للآلة في نهاية اليوم يساعد على التقليل من إشارة الخلفية بسبب معدنية مجانية.

Protocol

يجب أن تكون ثابتة جميع العينات الخلية لCyTOF وpermeabilized. وهذا يتيح قدر أكبر من دخول intercalator DNA التي تحتوي على الإيريديوم، ويمنع أيضا تحلل الخلايا خلال غسل الماء MilliQ والخطوات إعادة تعليق على الفور من قبل عن طريق الحقن في عداد الكريات الشامل.

1. بدء قداس للعداد الكريات

1. فتح برنامج حاسوبي CyTOF. حدد إعداد الصك. على علامة التبويب بطاقة كيج، انتقل إلى الزاوية اليمنى السفلى وفوق سخان "ON" الزر. تشغيل المدفأة على الأقل 15 دقيقة قبل الوقت المطلوب لإتاحة الوقت الكافي للعباءة غرفة الرش لتصل إلى 200 ° C.
2. استبدال الأبيض القواعد والمعايير Ject حقنة مل 3 في مضخة الحقنة مع حقنة جديدة مملوءة بالماء MilliQ.
3. تنظيف البخاخات. Backflush والبخاخات باستخدام حقنة وأنابيب لسحب 5٪ citranox 2-3 مرات خلال كل من ميناء مقدمة أصغر السائل وإدخال الغاز أكبر الموانئ. تكرار backflushing مع MilliQ المياه رس إزالة citranox المتبقية.
4. تحقق للتأكد من أن تضاء الأضواء على اللوحة الأمامية للCyTOF كما في الشكل (1).

الرقم وحة CyTOF 1. أضواء قبل بدء التشغيل.

5. فتح صمام خزان الغاز الأرجون. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى "ARGON" الضوء على الجبهة لتشغيل.
6. إرفاق البخاخات لالمكياج مدخل الغاز. فك المكياج الغاز موصل الأنابيب وإزالة المطاط الأسود يا الدائري وقطعة من البلاستيك الأبيض المخروطية. ملاحظة الأوسع نطاقا "برجمة" على المنفذ الجذعية الغاز مقدمة من البخاخات. وضع موصل على منفذ إدخال الغاز. وضع الأسود يا الدائري على نهاية ميناء الغاز، وفرض يا الدائري الماضي على نطاق أوسع جزء من جذع الميناء. ضع قطعة من البلاستيك الأبيض على رأس مخروطي مع نهاية الضيقة اشار الى ان والمسمار أنابيب الغاز على الماكياج.
7. في علامة التبويب تحكم RFG من الصك إطار الإعداد، اضغط على "ابدأ البلازما". منذ يتم إدراج بالفعل البخاخات، اضغط على "OK". يقوم البرنامج بتشغيل المبرد، وبدء تدفق الغاز، وإشعال البلازما. والجهد للكشف عن تكثيف. سيكون هناك نافذة منبثقة قائلا "البلازما بدء تسلسل انتهت بنجاح" عند الانتهاء؛ اضغط على "OK". يجب أن تكون أضواء جديدة على اللوحة الأمامية في (الشكل 2 >).

الشكل 2. أضواء لوحة CyTOF بعد البلازما وأشعلت بدء بنجاح.

9. تشغيل مضخة الحقنة. في الزاوية العلوية اليمنى، اضغط على الأخضر "مسرحية" زر لبدء ضخ حقنة ويبدأ تدفق السائل من خلال أنابيب والرش من البخاخات. الإعدادات الافتراضية هي حقنة لمدة 3 مل من الماء. من أجل العينة أن تتدفق من خلال حلقة العينة، يجب ضخ حقنة تغيرت بشكل دوري عندما نفدت المياه. في الجزء العلوي من الشاشة، هناك عداد يشير إلى مدى السائل قد تدفقت من مضخة الحقنة. فإن مضخة محقنة تتوقف عند هذا العداد إلى "3،000" أو المكبس ويضرب نهاية الحقنة. عند إعادة تعبئة الحقنة، يجب ضرب "توقف" بدلا من الأزرق "وقفة" زر لإعادة تعيين العداد.

ه "2>. معايرة عداد الكريات اليومية لقداس

1. سوف تحتاج ما يقرب من عداد الكريات الشامل 20 دقيقة لتحقيق الساخنة، والبلازما مستقرة قبل المعايرة. الغرض من الخطوات لتحقيق أقصى قدر من ضبط إشارة المرجوة من Tm169 أو Tb159 مع الحفاظ على "Gd155" (أكسيد؛ La139 + Ø16) إشارة أقل من 3٪ من قيمة أعلى. انقر فوق الزر إعدادات اقتناء لفتح نافذة إعدادات اقتناء البيانات. في علامة التبويب Analytes، انقر فوق الجدول الدوري لفتح لوحة اختيار النظير. تحديد النظائر في ضبط DVS حل العلوم المدرجة في الدليل، انقر فوق "حفظ".
2. انقر فوق نظائر لكل قراءة الزر لفتح القداس (ES) لكل إطار القراءة. حدد "البقول عدد"، وإعادة مقياس ذ محور عن طريق إدخال رقم جديد والضغط على "دخول".
3. ملء الأخضر 1 مل القواعد والمعايير Ject المحاقن مع حل ضبط. تحويل ميناء محدد لعينة "تحميل"، وضخ 450 ميكرولتر من حل ضبط، ثم قم بتشغيل محدد إلى "حقن". في القداس علامة التبويب معايرة البيانات Acquisit أيون إعدادات النافذة، اضغط على "تشغيل" لمراقبة الجماهير التي تتدفق من قبل. الجانب الأيسر من النافذة أقل الشامل، في حين أن الجانب الأيمن أعلى الشامل. ملاحظة: سيكون هناك بالفعل إشارات في المنطقة 9400-9800 TOF، وذلك بسبب نظائر الزينون في غاز الارجون (الشكل 3). الانتظار حتى حل ضبط النظائر تبدأ في الظهور كما الشرائط في هذا العرض (الشكل 4).

الرقم معايرة الكتلة 3. نافذة علامة التبويب، يظهر أن مستويات الخلفية للنظائر المختلفة بعد حل غسل وشطف المياه. المنطقة المحيطة TOF 9400-9800 نظائر الزينون يتوافق مع غاز الارجون في، ويجب أن تكون دائما موجودة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

4 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
الشكل 4. نافذة علامة التبويب كتلة المعايرة، والتي تبين الشرائط العمودية لمختلف النظائر في حل ضبط DVS. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

4. العودة إلى القداس (ES) لكل القراءة النافذة واضغط على الاخضر "اللعب" زر في الزاوية اليسرى العليا. يتم تمثيل كل النظائر بتحديده في الخطوة 2.1 في خط بلون مختلف. الافتراضي هو محور س "تايم"، في ثوانى. رصد مستويات من النظائر المختلفة حتى أنها ثابتة.
5. ضبط التيار. في علامة التبويب معلمة من النافذة إعدادات اقتناء البيانات، حدد "التيار" من القائمة المنسدلة. دعونا نبدأ = 0، والانتهاء = 10 قيمة الخطوة، = 0.5، الساعة تسوية = 200، ثم اضغط على "حفظ". انقر مرة أخرى على الكتلة (ES) لكل إطار القراءة واللعب تضررا. المحور س الآن "التيار". ملاحظة الإشارات من حيث ذروة النظائر (الشكل 5)، وص ecord. تحت علامة التبويب إعداد DAC القنوات الصك إطار الإعداد، انتقل لأسفل إلى "التيار" وأدخل هذه القيمة الجديدة. اضغط على "تعيين القيمة الحالية الفعلية"، ثم "حفظ".

الشكل 5. الوضع الحالى ضبط.

6. ضبط للغاز الماكياج. تغيير القائمة المنسدلة ل"الغاز الماكياج." دعونا نبدأ = 0.55 في نهاية = 0.95 قيمة الخطوة، = 0.05، والوقت تسوية = 200. اضغط على حفظ. العودة إلى القداس (ES) لكل إطار القراءة واللعب تضررا. المحور س الآن "الماكياج الغاز" معدل التدفق. تسجيل حيث الإشارات من ذروة النظائر. مراقبة الزيادة السريعة للإشارة "Gd155" قرب نهاية (الشكل 6). العودة إلى علامة التبويب إعداد القنوات DAC، انتقل لأسفل إلى "الماكياج الغاز"، وأدخل هذه القيمة الجديدة. اضغط على "تعيين القيمة الحالية الفعلية"، ثم "حفظ".

igure 6 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
الشكل 6. المكياج الشخصي ضبط الغاز.

7. نسبة تسجيل المطلوب نظير مقابل أكسيد. جعل ثانية حقن 450 ميكرولتر من حل ضبط. في علامة التبويب معلمة، حدد "تايم" من القائمة المنسدلة، دعونا نبدأ = 0، نهاية = 10، قيمة الخطوة = 1، وتسوية الوقت = 200. اضغط على "حفظ". ضرب "مسرحية" في قداس (ES) لكل قراءة النافذة. بعد خطوط استقرت (الشكل 7)، استخدم المؤشر إلى قراءة قيمة في صناديق اليسرى العليا لTm169 أو Tb159 (أعلى قيمة)، وكذلك "Gd155" القيمة (<3٪ من أعلى قيمة). ويمكن أيضا أن يتم حفظ هذه القيم في ملف ضبط للرجوع إليها مستقبلا.

الشكل 7. قياس شدة ضبط إشارة الحل الأمثل بعد الغاز الحالية ومستحضرات التجميل.

8. تنظيف سامPLE حلقة. حقن 3 مل من الماء MilliQ خلال الحلقة العينة، تليها 500 ميكرولتر من محلول غسيل DVS. رصد التقدم المحرز في تنظيف بالضغط على "تشغيل" في القداس علامة التبويب المعايرة. يغسل حتى شدة الشرائط (الشكل 4) تبدأ في التناقص، ثم اتبع بنسبة 3 مل من الماء ورصد MilliQ حتى إلى مستويات الخلفية (الشكل 3).

3. تشغيل العينات

1. فتح إطار اقتناء. الإعدادات الافتراضية: هل تحليل = على ذبابة و، إشارة إلى تحليل = المزدوج، معايرة عدد مزدوج = البيانات. يتم تحديد الحد من الضوضاء. قد يتم تغيير أي من هذه الرغبة. أدخل اسم الملف. يجب حفظ جميع الملفات إلى :/ E / محرك الأقراص.
2. وضع تأخير الشراء. وسوف يكون هناك تأخير طفيف في تسجيل الأحداث خلية من حوالي 30 ثانية بسبب طول الأنبوب بين العينة وحلقة البخاخات و. ولذلك، فإن مجموع "تأخير اقتناء" والحادي والعشرين الكاشف "تأخير القدرة ينبغي "ان تكون على الاقل 30 ثانية. للكشف عن تأخير الاستقرار يجب أن تكون على الأقل 20 ثانية.
3. وضع البيانات في الوقت جمع. "اقتناء الوقت" هو عدد الثواني التي تريد تشغيل عينتك. وشغل كامل 450 حلقة عينة ميكرولتر تتطلب 600 ثانية لإكمال. يقترح أن تضاف 50-100 ثانية إلى نهاية وقت التشغيل لتقليل عينة المرحل.
4. إعادة تعليق من العينة. لتقليل تراكم الأملاح في الجهاز، يقترح أن يتم اثنين على الأقل يغسل في الماء MilliQ في نهاية تلطيخ الخلايا، تليها إعادة تعليق النهائية في الماء MilliQ. استخدام حجم المياه MilliQ ل resuspend بيليه الخلية سوف تختلف اعتمادا على عدد من الخلايا التي بدأت مع وانتعاش الخلايا بعد العملية تلطيخ بأكمله. مكان انطلاق جيدة هو 10 ⁶ (البداية) خلية / مل. بعد إعادة تعليق، تصفية من خلال مصفاة الخلية لإزالة الركام.
5. عينة بدء تشغيل. إدخال اسم ملف جديد للعينة الحالي. تبديل صمام حلقة لعينة "تحميل"، وضخ العينة، والتحول إلى "حقن"، ثم ضرب "تشغيل" في إطار اقتناء.
6. تسجيل الأحداث الخلية. وسيمثل الخلايا في إطار مجموعات لقطة والأفقي للعلامات في كل قناة النظائر / علامة العمودي (الشكل 8). في حين أن عداد الكريات الشامل يمكن تسجيل 1000 خلية / ثانية، وعادة ما يتم الحصول على دقة أفضل بين الأحداث الخلية 300-500 في خلية / ثانية. هذا يتوافق مع ما متوسطه تحديث ~ خلية / شاشة 1. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 30 ثانية قبل العداد الحدث الخلية يبدأ في الصعود. هذا ومن المقرر أن "على ذبابة" معالجة البيانات؛ يتم فقدان أي معلومات الحدث الخلية.

الشكل 8. نافذة اقتناء خلال عينة قيد التشغيل، تظهر صفوف أفقية من البقع المقابلة لعناصر مرتبطة ثلاثة أحداث منفصلة الخلية.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

7. نوعية الأحداث الخلية. تلاحظ أي خلفية streaking في كل قناة النظير، وكذلك معدل الحدث الخلية. ويعترف عداد الكريات الشامل "حدث الخلية"، كما بعض الزيادة في إشارة أعلى من الخلفية، لذلك إشارة الخلفية من المعدن أو غير منضم مجانا الأجسام المضادة يمكن أن تغير "الحدث خلية" العد. بالإضافة إلى ذلك، قد تشغيل الخلايا في تركيز عالية جدا وتسبب عددا متزايدا من الأحداث صدرة. يمكن تضاءلت الخلفية بواسطة يغسل إضافية أو مزيد من التخفيف الخلية. يمكن التقليل من الحلل التخفيف قدر أكبر من الخلايا، على حساب زيادة وقت التشغيل.
8. الانتهاء من الحصول على البيانات عينة. عندما تم الوصول إلى الوقت اقتناء، فإن جمع البيانات النهاية. وسوف يكون هناك قليلا من التأخير أمام نافذة منبثقة مع زر "موافق" يظهر، مرة أخرى، هذا ومن المقرر أن "على ذبابة على" معالجة البيانات. ويمكن أيضا الحصول على عينة يمكن وقفها بريماurely من خلال ضرب "إيقاف" الزر. في هذه الحالة، سيتم فرز جميع الأحداث مسجل من قبل الخلية ومعالجتها في الملفات الإخراج.
9. حقن لا يقل عن 500 ميكرولتر من المياه MilliQ بين كل عينة يساعد أيضا تقليل المرحل العينة.

4. تنظيف الجهاز بعد الاستخدام

1. غسل الحل. بعد تشغيل العينة النهائية وحلقة عينة مسح بالماء، وضخ 450 ميكرولتر من محلول الغسيل في حلقة العينة. رصد الإفراج عن المعادن مجانا في القداس علامة التبويب معايرة نافذة إعدادات اقتناء البيانات كما في الخطوة 2.8 (الشكل 9). عندما تكون إشارة معدنية مجانية تبدأ في التناقص، مع 3 بمسح مل من الماء ورصد MilliQ حتى تتحقق المستويات الخلفية.

الرقم معايرة الكتلة 9. نافذة علامة التبويب، خلال آخر تديره التنظيف بمحلول غسيل DVS. الشرائط العمودية في المنطقة TOF 9800-11000 هي الأجسام المضادة التسمية النظائر يجري تنظيفها من الجهاز. الشرائط العمودية حول TOF 11500 تتوافق مع النظيرين intercalator عير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

5. إغلاق الجهاز

1. في علامة التبويب تحكم RFG من الصك إطار الإعداد، حدد "إيقاف البلازما". عندما اكتمال العملية، سيكون هناك نافذة منبثقة تطلب منك لإزالة غموض. اضغط على "OK". في علامة التبويب بطاقة كيج، إيقاف سخان. إغلاق صمام على توريد الأرجون.
2. إزالة غموض. إزالة غموض من غرفة الرش عن طريق سحب بعناية إلى الوراء. فك مقدمة عينة أنابيب من 1.6 الخطوة ووضع جانبا. فك إدخال الغاز المكياج اتصال لتخفيف قليلا، ثم سحب قبالة البخاخات. وترك ثمل المناسب معا تقلل من فرص Losing المطاط يا الدائري الأسود والأبيض قطعة من البلاستيك مخروطي.
3. تنظيف البخاخات. Backflush كل من موانئ البخاخات مع citranox 5٪ باستخدام حقنة وأنابيب كما في الخطوة 1.3. متجر، يغطي، في citranox 5٪ حتى استخدام المقبل.

Representative Results

وينبغي بعد بروتوكول أعلاه إنجاز أربعة أمور. أولا، سوف يسمح كافية الاحماء الوقت للعداد الكريات الشامل إنتاج الساخنة، والبلازما المستقرة اللازمة لإشارة الأمثل والحد الأدنى من تشكيل أكسيد. والثانية، وغسل كافية من المياه مع عداد الكريات الشامل MilliQ وDVS الحل اغسل (الشكل 9) يساعد على التقليل من امتصاص المعادن مستويات للأنابيب وأجزاء أخرى من الجهاز، مما يساعد على تقليل الخلفية أثناء اقتناء العينة (الشكل 8). وسوف يساعد أيضا إزالة أي الخلايا التي قد تتعثر في الجهاز وبالتالي تقليل المرحل من عينة لعينة. والثالث، في حين لا يمكن تشكيل أكسيد يمكن منع تماما، وضبط الصحيح للعداد الكريات الشامل (أرقام 5-7) مساعدة إشارة إجمالي الأمثل في M الشامل المطلوب، مع التقليل في الخلفية كتلة أكسيد M +16. كما رأينا في الشكل 10، وضبط غير لائق (أرجواني) زيادة كبيرة في تشكيل أكسيد M +16 مقارنة مع عينة ضبطها بشكل صحيح (الأزرق الداكن). هذا له تأثير انخفاض طفيف في إشارة المرجوة M، وزيادة كبيرة غير مرغوب فيها تدخل في الخلفية M +16.

وأخيرا، يجب غسل كافية من العينة في مخازن وأخيرا في تخفيض المياه المعدنية MilliQ / الضد إشارة الخلفية إلى مستويات مقبولة. ويغسل بالماء وإعادة تعليق MilliQ حاسمة للحفاظ على الإعدادات الحالية ثابت طوال عدة ساعات من وقت التشغيل. التخفيف المناسبة من العينة في الماء MilliQ لابد من تحديد على أساس العينة يوميا. ومع ذلك، لتمييع ⁶ 10 ~ (البداية) خلية / مل هو مكان جيد للبدء. بناء على النموذج الأول من مجموعة، يمكن استيعابها تخفيف أكبر أو أقل للعينات لاحقة. وغسل الصحيح والسليم ضمان تخفيف الحد الأدنى من المعلومات الأساسية وأعظم قرار من الخلايا، في حين تحقيق التوازن بين الحاجة إلى السرعة (الشكل 8).

-together.within صفحة = "دائما">
الشكل 10. ضبط تأثير المناسبة على إشارة المطلوب، والاختلاف في تشكيل المعادن أكسيد بين اللانثينيدات المختلفة. تم تشغيل الخرز البوليسترين التي تحتوي على وفرة الطبيعية La139، Pr141، Tb159، Tm169، وLu175 من العلوم DVS في وضع اكتساب الخلية. تم تشغيل عينات منفصلة من الخرز المشار إليه في الماكياج معدلات تدفق الغاز (قارن مع الشكل 6). تم تحليل البيانات باستخدام FlowJo v9.4.9 لنظام التشغيل Mac، بما في ذلك من الحطام النابضة من الخرز مكسورة. كان العينة بشكل صحيح ضبطها عند 0.74 لتر / دقيقة. كان هذا إشارة من شدة أعلى في انخفاض معدلات التدفق، وارتفاع في إشارة الجماهير "M" معدنية مع أقل إشارة في "M +16" الجماهير من أكسيد إشارة ضبطها بشكل غير صحيح. A. الإشارات في كتلة "M" La139 وTm169. نلاحظ أن يتأثر La139 كثافة إشارة أكثر من Tm169 بواسطة الماكياج معدل تدفق الغاز. B. إشارة إلى "M +16" الكتلة أكسيدES 155 و 185، الموافق La139 + Ø16 Ø16 وأكاسيد Tm169 + على التوالي. لا يوجد الفعلي "Gd155" أو "Re185" موجودة في الخرز. في إشارة أكسيد قناة "Gd155" قوي بشكل خاص، وذلك بسبب أن تتأكسد بسهولة La139. هذا يمثل واحدا من أعلى مستويات أكسيد يمكن للمرء أن يتوقع أن تواجهها. C. رسم بياني ل"M" و "M +16" شدة الإشارة بوصفها وظيفة من الماكياج معدل تدفق الغاز. رموز ملء تمثل كتلة "M"، في حين تمثل الرموز مفتوحة الشامل "M +16". لون خطوط تتوافق مع كتلة كل منها "M". لاحظ أن تتأثر بشدة La139 وPr141 بواسطة الماكياج معدل تدفق الغاز، حيث بلغت حتى نقطة حيث المزيد من كتلة "M +16" أكسيد موجود من كتلة "M". اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

على مدى العقود القليلة الماضية، كان التدفق الخلوي مضان طريقة العمود الفقري لتحليل الخلايا واحدة، سواء من حيث التعبير والسطح في المقايسات الفنية. ومع ذلك فقد حد لقضايا التداخل الطيفي لصبغات الفلورسنت عدد علامات في وقت واحد. في حين تم الإبلاغ عن التجارب باستخدام أكثر من 12 علامات في وقت واحد، ومقدار التعويضات اللازمة يجعل هذا من الصعب من الناحية الفنية.

بدلا من fluorophores، رائدها الشامل الخلوي العلوم DVS يستخدم البوليمرات مع مواقع مخلبية للمعادن كتسميات عن الأجسام المضادة ^{1-3 من} ونظرا لنقاء المعادن والقرار الجماعي للICP-MS، هناك على نحو فعال لا "التداخل الطيفي". لأن معظم العناصر المستخدمة ليست ذات صلة بيولوجيا، وهناك أيضا الخلفية قليلا لإحداث "autofluoresence". هذه الحقائق تسمح باستخدام أكثر من 30 علامات في وقت واحد خلال تجربة واحدة. ^6،7 وهناك أيضا أوسع دىnamic متوسط ​​في إشارة ICP-MS في من التجربة في ومضان نموذجية.

ومع ذلك، الخلوي الجماعي لديها قيود. وهو أسلوب المدمرة: لا يمكن استرداد خلايا للفرز ومزيد من التجارب. وعداد الكريات الشامل لديه شرطا صارما لوجود المعادن: معدن إذا لم يكن موجودا، لن يتم الكشف عن خلية. هذا هو السبب الرئيسي لاستخدام DNA intercalators المعادن مخلبية لضمان الصحيح في المئة من بين الأم الإحصاءات، وسوف يتم الكشف عن كافة الخلايا بغض النظر عن ما إذا كان أي تحقيقات الأجسام المضادة مأزق. ^3،6-7 وأخيرا، فإن انتقال الخلية الحالية الكفاءة من الجهاز ~ 25٪، مقارنة مع 90٪ كفاءة> لتدفق عداد الكريات الفلورسنت. ولذلك، مطلوب في كثير من الأحيان عدد أكبر بدءا من الخلايا، خصوصا لسكان الخلية نادرة. ومع ذلك، يتم عادة متوازنة من قبل هذا حقيقة أن عداد الكريات كتلة واحدة في كثير من الأحيان عينة يستبدل العينات الفلورسنت متعددة. وأخيرا، فإن الخلية أقصى المكتسباتمعدل ition أبطأ بكثير من مستوى أجهزة قياس التدفق الخلوي في خلايا الفلورسنت 1000 ~ / ثانية؛ المعدل الأمثل في كثير من الأحيان نصف هذا العدد. لذلك، كل عينة وقتا أطول لتشغيل.

وقد تم مؤخرا عدة ورقات نشرت على تلطيخ لأنواع مختلفة من عينات الخلايا. ^3،5-7 والغرض من هذه المقالة هو تقديم معلومات عن الاستخدام السليم للكتلة CyTOF عداد الكريات ^TM للعينات قيد التشغيل. والحفاظ على البخاخات من backflushing مع وتخزينه في citranox 5٪ التقليل من تراكم الحطام الخلية والمعادن، مما يقلل من احتمال السدادات. صيانة الجهاز لتحقيق الأداء الأمثل من جزأين. أولا، ضبط الصحيح (الحالية، الماكياج الغاز) من الجهاز على أساس على الأقل يوميا يساعد على ضمان القياس الصحيح. الثانية، وغسل بالماء الكافي MilliQ بين كل عينة ومع الحل اغسل في نهاية يدير لإزالة الحطام المبنية العضوية وغير العضوية سيساعد على تقليل الخلفية بشكل عام والمرحلبين العينات. وأخيرا، ونوعية إعداد العينات لديها تأثير كبير على نوعية الحصول على البيانات. يغسل متعددة في المخزن المؤقت وأخيرا في MilliQ المياه تساعد على إزالة أي خلفية من المعدن أو غير محددة ملزمة intercalators الأجسام المضادة. سوف التخفيف المناسبة من العينة خلية تساعد في موازنة القرار الأمثل بين الأحداث الخلية مع تقليل إجمالي وقت التشغيل لكل عينة. التخفيف المناسبة يساعد في تقليل احتمال التسبب في سداده في البخاخات.

مخرج المشكلات الشائعة

1. الجهاز لا تجاوز "RFG إعداد" خطوة خلال ما يصل بدء

تحت علامة التبويب بطاقة قفص من إطار متابعة مجموعة أدوات، اضغط على "إعادة تعيين" تحت RFG. محاولة بدء تشغيل الجهاز. إذا كان هذا لا يحل المشكلة، أغلق البرنامج، إعادة فتح، اضغط على "إعادة تعيين" مرة أخرى، ومحاولة لبدء. إذا كانت هذه لا تزال لا يحل المشكلة، تحقق من الكسارة مولد RFG التبديل على الركن الخلفي الأيسر من الجهاز. إذا تعثرت،إعادة على "On"، "إعادة الضبط" ضرب، وحاول لبدء. إذا كانت هذه لا تزال لا يحل المشكلة، اتصل DVS.

2. الجهاز أثناء تشغيل إيقاف

1. تحقق الأرجون العرض. إذا كان ضغط الأرجون الوصول إلى آلة يحصل حوالي 40 رطل لكل بوصة مربعة أدناه، ينفذ البرنامج إيقاف تشغيل التلقائي.
2. تجاوز RFG 100W الخطأ. هذا يحدث عندما الطلب على الطاقة ليذهب خارج البلازما 1300 + / - 100W النافذة، وينفذ البرنامج إيقاف تشغيل التلقائي. ويتسبب هذا عادة عن طريق رذاذ متفاوتة من البخاخات، قطرات كبيرة بشكل خاص. هذا يبرد بشكل مفرط البلازما، والتي تتطلب المزيد من الطاقة للحفاظ على البلازما. وهذا يمكن أن يحدث بسبب استخدام القوة المفرطة لإرفاق أنابيب المحقنة إلى حقنة خلال المتغيرة للمضخة الحقنة. هذا يؤدي إلى رذاذ قطرات كبيرة من والتبريد البلازما. إذا كانت هذه هي الحالة، ببساطة إعادة تشغيل الجهاز.

وهذا يمكن أن يحدث أيضا بسبب قطرات الكبيرة التي تبدأ فيعندما شكل البخاخات يبدأ تسد. إذا كانت هذه يتكرر الخطأ، إزالة لتنظيف البخاخات، اضافة الى وجود غموض نظيفة وإعادة تشغيل.

في كثير من الأحيان أقل بكثير، يمكن للأنابيب رقيقة عينة بين العينة وحلقة البخاخات وتسد. يمكن تشخيص ذلك من خلال معدل تدفق مفاجئ انخفاض السائل عند إزالة أنابيب من البخاخات. إذا كانت هذه هي الحالة، إزالة الأنبوب والتجهيزات المتضررة لإعادة بناء أنابيب جديدة مع، واستبدال التجهيزات مع البخاخات جديدة وعدة أنابيب.

3. لا الشرائط النظائر (أو الأحداث الخلية) مرئية خلال اكتساب عينة الخلية (الشكل 8)، أو أثناء مشاهدة قداس نافذة علامة التبويب المعايرة (أرقام 3 و 4 و 9)

1. تحقق من مضخة الحقنة. هذا يحدث في كثير من الأحيان بسبب نسيان لضرب "مسرحية" خلال تغيير مضخة الحقنة حقنة. وهذا يمكن أن يحدث أيضا إذا تم ضرب "وقفة"، بدلا من "وقف"، خلال حقنة التغيير. "وقفة" لا إعادة تعيين العداد وحدة التخزين على مضخة محقنة، وسوف تتوقف عند حجم مل 3،000 الاستغناء، بغض النظر عما إذا بقايا السائل. وأخيرا، قد يكون تشغيل حقنة من الماء.
2. عينة فحص الصمام. تأكد من تحميل عينة بينما كان في "تحميل"، ومن ثم التبديل إلى "حقن" قبل بدء التشغيل العينة.
3. المنضب أو تخفيف مفرط العينة. قد يكون تشغيل لكم جميعا من عينتك؛ تحقق حسابات الزمن اقتناء (انظر الخطوة 3.3). بدلا من ذلك، قد تكون أخطأت أنت عامل التخفيف، و / أو فقدان أكثر من الخلايا مما كان متوقعا خلال تجهيز العينات.
4. انسداد البخاخات. ويسبق هذا عادة عن خطأ RFG (انظر العدد 2B)، ولكن يمكن أن تقلل تسد notiecably كفاءة انتقال الخلية قبل مما تسبب في إيقاف التشغيل.

ويمكن أيضا قضايا 3C و 3D يتم التحقق عن طريق تشغيل عينة من الخرز البوليسترين المعايرة بين الاتحاد الأوروبي والتي تحتوي على. يتم تزويد أنهم في حوالي 1 مليون / مل (دوامة جيدا قبل وضع العينة!). ولذلك، فإن ملء ال 450 حلقة عينة ميكرولتر إعطاء ا ف بproximately 450،000 الخرز. الخلية ^TM CyTOF كفاءة الإرسال هو آلة التي تعتمد على، ولكن ما يقرب من 15-30٪. ولذلك، فمن المتوقع 67،500-135،000 الأحداث حبة من أن الحقن. الأرقام أدناه التي تنسجم مع تسد في أنابيب أو البخاخات.

الخلية / حبة كفاءة نقل شيء لاختبار بعض الأحيان، أي أن نلاحظ الاتجاهات الطويلة الأجل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity