Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Summary

Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Abstract

In den letzten Jahren hat die schnelle Analyse von Einzelzellen üblicherweise durchgeführt mittels Durchflusszytometrie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Allerdings ist das Problem der spektralen Überlappung von Fluorophor-Emissionen die Anzahl der gleichzeitigen Sonden begrenzt. Dagegen ist die neue Masse CyTOF Zytometer von DVS Sciences Paare eine Flüssigkeit einzellige Einführungssystem mit einem ICP-MS. ¹ Anstatt Fluorophore werden chelatisierende Polymere enthaltenden hoch angereicherten Metall-Isotope an Antikörper oder andere spezifische Sonden gekoppelt. ^2-5 Aufgrund der Metall-Reinheit und Massenauflösung der Masse Zytometer, gibt es keine "spektrale Überlappung" von benachbarten Isotope, und daher keine Notwendigkeit zur Kompensation Matrizen. Zusätzlich, aufgrund der Verwendung von Lanthanidmetallen, gibt es keine biologischen Hintergrund und damit kein Äquivalent Autofluoreszenz. Mit einer Masse Fenster Spanning Atommasse 103-203, theoretisch bis zu 100 Etiketten könnten gleichzeitig unterschieden werden. Gegenwärtig, Mehr als 35 Kanäle zur Verfügung mit dem Chelatisierungsreagenzien ab DVS Sciences, ermöglicht beispiellose Dissektion der immunologische Profil der Proben. ^6-7

Nachteile sind die Masse Zytometrie strengen Notwendigkeit eines gesonderten Metallisotops pro Sonde (kein Äquivalent vorwärts oder side scatter), und die Tatsache, dass es ein zerstörungsfreies Verfahren (keine Möglichkeit der Sortierung Rückgewinnung) ist. Die aktuelle Konfiguration der Masse Zytometer hat auch eine Zellen-Übertragungsrate von nur ca. 25% und erfordern somit eine höhere Anzahl von Zellen-Eingang.

Optimale tägliche Leistung der Masse Zytometer erfordert mehrere Schritte. Das grundlegende Ziel der Optimierung besteht darin, die gemessene Signalintensität der gewünschten Metall-Isotope (M) maximieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Bildung von Oxiden (M 16), daß das M Signalintensität zu verringern und stören beliebiger Signal an M +16. Der erste Schritt ist, um sich aufzuwärmen das Gerät so ein heißer, stabile ICP Plasma hergestellt wurde. Zweitens müssen die Einstellungen für aktuelle und Make-up-Gas-Strömungsrate auf einer täglichen Basis optimiert werden. Während der Probenahme wird der maximale Zelle Ereignisrate von Detektor-Effizienz und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu 1000 Zellen / Sekunde begrenzt. Jedoch in Abhängigkeit von der Probe Qualität, eine langsamere Zelle Ereignisrate (300-500 Zellen / Sekunde) ist in der Regel wünschenswert, damit eine bessere Auflösung zwischen Zellen Ereignisse zu maximieren und somit intaktes Singuletts über Dubletts und Schutt. Schließlich trägt angemessene Reinigung der Maschine am Ende des Tages minimieren Hintergrundsignal durch freie Metall.

Protocol

Alle Zellproben für die CyTOF müssen fixiert und permeabilisiert werden. Dies ermöglicht eine größere Eintrag des Iridium-haltigen DNA-Interkalator, und verhindert auch, dass während der Zelllyse MilliQ Wasser waschen und Resuspension Schritte unmittelbar vor der Injektion in die Masse Cytometer.

Ein. Start-up der Messe Cytometer

1. Öffnen Sie die CyTOF Software-Programm. Wählen Sie Instrument Setup. Auf der Karte Cage Registerkarte in der rechten unteren Ecke und klicken Sie Heater "ON"-Taste. Einschalten der Heizung mindestens 15 min vor der gewünschten Zeit, um genügend Zeit für die Sprühkammer Mantels erlauben bis 200 ° C zu erreichen
2. Setzen Sie die weiße Norm-Ject 3 ml Spritze in die Spritzenpumpe mit einer frischen Spritze mit MilliQ Wasser gefüllt.
3. Reinigung Vernebler. BackFlush den Vernebler, indem die Spritze und Schlauch bis 5% Citranox 2-3 mal durch die beiden kleineren flüssigen Einführung Hafen und dem größeren Gaseinleitungsöffnung ziehen. Wiederholen Rückspülung mit MilliQ Wasser to Reste von Citranox.
4. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass die Lichter auf der Vorderseite des CyTOF wie in Abbildung 1 leuchten.

Abbildung 1. CyTOF Bedienfeld leuchtet vor der Inbetriebnahme.

5. Öffnen Argongas Flaschenventil. Dies sollte die "ARGON" Licht an der Vorderseite zum Einschalten führen.
6. Befestigen Sie den Vernebler, um Make-up Gaseinlass. Lösen Sie das Make-up Gasschlauch Anschluss und entfernen Sie die schwarze Gummi-O-Ring und das weiße konische Stück Plastik. Beachten Sie den breiteren "Knöchel" auf der Gaseinleitungsöffnung Schaft des Verneblers. Legen Sie den Stecker auf der Gaseinleitungsöffnung. Setzen Sie die schwarze O-Ring über das Ende des Gases Port und zwingen den O-Ring an der breitere Teil des Hafens Stiel. Setzen Sie das weiße konische Kunststoff-Stück auf der Oberseite mit dem schmalen Ende wies darauf hin, und Schraube auf dem Make-up Gasschlauch.
7. Auf der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, drücken Sie "Start Plasma". Da der Zerstäuber bereits eingelegt ist, drücken Sie "OK". Die Software wird auf dem Kühler drehen, beginnen die Strömung des Gases, und zünden ein Plasma. Der Detektor Spannung hochfahren. Es wird ein Pop-up-Fenster mit der Meldung "Plasma Start-up-Sequenz wurde erfolgreich abgeschlossen", wenn Sie fertig sein; drücken Sie "OK". New Lichter sollten auf der Vorderseite (Abbildung 2 >).

Abbildung 2. CyTOF Bedienfeld leuchtet nach Plasma und gezündet Start-up erfolgreich abgeschlossen.

9. Einschalten Spritzenpumpe. In der oberen rechten Ecke, die grüne Taste "Play"-Taste, um die Spritze Pumpe zu starten und beginnen strömenden Flüssigkeit durch den Schlauch und Spritzen aus dem Zerstäuber. Die Standard-Spritze Einstellungen sind für 3 ml Wasser. Damit Probe durch die Probenschleife fließen muss der Spritzenpumpe periodisch geändert werden, wenn es nicht mehr genügend Wasser. Am oberen Rand des Bildschirms besteht ein Zähler angibt, wie viel Flüssigkeit aus der Spritze Pumpe geflossen ist. Die Spritzenpumpe wird gestoppt, wenn dieser Zähler "3,000" oder den Kolben erreicht trifft das Ende der Spritze. Beim Nachfüllen der Spritze, müssen Sie klicken Sie auf "Stop", anstatt das blaue "Pause"-Taste, um den Zähler zurückzusetzen.

e "> 2. Tägliche Kalibrierung der Messe Cytometer

1. Die Masse Zytometer benötigt ca. 20 min, um eine heiße, stabiles Plasma vor der Kalibrierung zu erreichen. Der Zweck der Abstimmung Schritte ist es, das gewünschte Signal der Tm169 oder Tb159 zu maximieren und gleichzeitig "Gd155" (Oxid; La139 + O16)-Signal unter 3% des höheren Wertes. Klicken Sie auf die Akquisition Schaltfläche Einstellungen, um die Datenerfassung Einstellungen Fenster zu öffnen. In der Analyten Registerkarte, klicken Sie auf das Periodensystem, um das Isotop Auswahl zu öffnen. Wählen Sie die Isotope im DVS Sciences Tuning-Lösung in der Bedienungsanleitung aufgeführt sind, klicken Sie dann auf "Speichern".
2. Klicken Sie auf die Isotope Per Lesen-Taste, um die Messe (n) Per Lesen öffnen. Wählen Sie "Impulse Count" und Skalieren der Y-Achse durch Eingabe einer neuen Nummer und drücken Sie "Enter".
3. Füllen Sie einen grünen 1 ml Norm-Ject Spritze mit Tuning-Lösung. Drehen Sie den Sample-Anschluss Wahlschalter auf "LOAD", injizieren 450 ul Tuning-Lösung, dann drehen Sie den Wahlhebel zu "injizieren". In der Messe Registerkarte Kalibrierung des Data Acquisit ion Fenster Einstellungen klicken Sie auf "Ausführen" zu überwachen, welche Massen werden durch fließt. Die linke Seite des Fensters geringer Masse, während die rechte Seite höher Masse. Anmerkung: Es wird schon Signale in der TOF 9400-9800 Region aufgrund Xenonisotope im Argongas (Abbildung 3). Warten Sie, bis Tuning-Lösung Isotopen erscheinen als Streifen in diesem Display (Abbildung 4) starten.

Abbildung 3. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der Hintergrundwerte für verschiedene Isotope nach dem Waschen und Wasser abspülen. Die Region rund um TOF 9400-9800 entspricht Xenon-Isotope in der Argon-Gas, und sollte immer vorhanden sein. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 4. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der vertikale Streifen für verschiedene Isotope im DVS Tuning-Lösung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

4. Gehen Sie zurück zu der Messe (n) Per Lesefenster und die grüne Taste "Play"-Button in der linken oberen Ecke. Jedes Isotops in Schritt 2.1 ausgewählt wird von einem anderen farbigen Linie dargestellt. Die Standard-x-Achse ist "Time", in sek. Überwachen Sie die Ebenen der verschiedenen Isotope, bis sie stabil sind.
5. Tuning des Stroms. Auf der Registerkarte Parameter des Data Acquisition Fenster, wählen Sie "Current" aus der Drop-Down-Menü. Lassen start = 0, finish = 10, Step-Wert = 0,5, Einschwingzeit = 200, und drücken Sie "speichern". Klicken Sie wieder auf der Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun "Current". Beachten Sie, wo die Signale der Isotope Peak (siehe Abbildung 5), und r ecord. Unter dem DAC Kanäle Registerkarte Setup des Instruments Setup-Fenster, scrollen Sie auf "Current" und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie "Stromistwert Set", dann "speichern unter".

Abbildung 5. Aktuelle Tuning-Profil.

6. Tuning der Make-up-Gas. Ändern Sie im Dropdown-Menü "Make-up-Gas." Lassen start = 0,55, end = 0,95, Step-Wert = 0,05, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie sparen. Zurück zur Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun "Make-up-Gas" Durchfluss. Aufzuzeichnen, wo die Signale der Isotope Peak. Beachten Sie die rasche Zunahme der "Gd155"-Signal am Ende (Abbildung 6). Zurück zur DAC Kanäle Registerkarte Setup unten scrollen, um "Make-up-Gas", und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie "Stromistwert Set", dann "speichern unter".

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Abbildung 6. Make-up-Gas Tuning-Profil.

7. Aufzeichnungsverhältnis gewünschte Isotop vs Oxid. Machen Sie eine zweite 450 ul Injektion von Tuning-Lösung. Auf der Registerkarte Parameter, wählen Sie "Time" aus der Drop-down-Menü, lassen start = 0, end = 10, Schritt-Wert = 1, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie auf "Speichern". Hit "Play" in Mass (n) Per Lesefenster. Nachdem die Linien stabilisiert zu haben (Abbildung 7), verwenden Sie den Cursor auf den Wert in der oberen linken Boxen für Tm169 oder Tb159 (höherer Wert) lesen und auch die "Gd155" Wert (<3% des höheren Wertes). Diese Werte können auch in einer Tuning-Datei für zukünftige Referenz gespeichert werden.

Abbildung 7. Messung der Tuning-Lösung Signalintensitäten nach Optimierung Strom-und Make-up-Gas.

8. Reinigung von samschen Schleife. Inject 3 ml MilliQ Wasser durch die Probenschleife, gefolgt von 500 ul DVS Waschlösung. Überwachen Sie den Fortschritt der Reinigung durch Drücken von "run" in der Messe Register Kalibrierung. Waschen, bis die Intensität der Streifen (Abbildung 4) abzunehmen beginnt, dann folgen von 3 ml MilliQ Wasser und Monitor bis hinunter in den Hintergrund Ebenen (Abbildung 3).

3. Laufende Proben

1. Öffnen Sie den Erwerb Fenster. Standardeinstellungen: Haben Analysis = On-The-Fly, Signal = Dual, Dual Count Kalibrierung = Daten zu analysieren. Noise Reduction ausgewählt ist. Jedes davon kann bei Bedarf geändert werden. Geben Sie den Dateinamen ein. Alle Dateien müssen auf die E :/ / Laufwerk gespeichert werden.
2. Einstellen Übernahme Verzögerungen. Es wird eine leichte Verzögerung bei der Registrierung von Ereignissen Zelle von etwa 30 sec aufgrund der Länge der Rohrleitung zwischen der Probenschleife und dem Zerstäuber sein. Daher ist die Summe der "Erwerb delay" und "Detector stFähigkeit Verzögerung "soll mindestens 30 sec betragen. Detector Stabilität Verzögerung sollte wenigstens 20 sec betragen.
3. Einstellen Datenerfassung Zeit. "Acquisition time" ist die Anzahl der Sekunden Sie möchten Ihr Beispiel auszuführen. Füllen des gesamten 450 ul Probenschleife erfordern würde 600 sec dauern. Es wird vorgeschlagen, daß 50 bis 100 sec zu dem Ende der Laufzeit hinzugefügt werden, um Probe zu minimieren Verschleppung.
4. Resuspension der Probe. Zur Minimierung Aufbau von Salzen in der Maschine wird vorgeschlagen, daß mindestens zwei Waschungen in MilliQ Wasser durchgeführt werden am Ende der Zelle Färbung, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in MilliQ Wasser. Das Volumen der MilliQ-Wasser verwendet, um das Zellpellet in Abhängigkeit von der Anzahl von Zellen mit dem Sie angefangen und der Zelle Erholung nach der gesamten Färbeverfahrens wird resuspendieren. Ein guter Ausgangspunkt ist 10 ⁶ (Start-) Zellen / ml. Nach der Resuspension durch ein Zellsieb filtern, um Aggregate zu entfernen.
5. Ausgehend Beispiel auszuführen. Geben Sie einen neuen Dateinamen für die aktuelle Probe. Schalten Sie die Probenschleife Ventil "LOAD", injizieren die Probe, wechseln Sie zurück zu "injizieren", dann klicken Sie auf "Run" in der Akquisition Fenster.
6. Registrierung Zelle Veranstaltungen. Zellen werden in dem Snapshot-Fenster als horizontale Sammlungen von Markierungen in jeder vertikalen Isotop / Marker Kanal (8) dargestellt werden. Während die Masse Zytometer 1.000 Zellen / sec registrieren können, wird eine bessere Auflösung zwischen Zelle Ereignisse in der Regel bei 300-500 Zellen / sec erhalten. Dies entspricht einem Durchschnitt von ~ 1 Zelle / screen refresh. Es kann bis zu 30 Sekunden, bevor die Zelle Event Zähler beginnt zu klettern. Dies ist auf "On-the-fly" Datenverarbeitung; keine Zelle Event Informationen verloren gehen.

Abbildung 8. Acquisition Fenster während Probe läuft, zeigt horizontalen Reihen von Stellen entsprechend den Elementen mit drei separaten Zelle Ereignissen verbunden.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

7. Qualität der Zelle Ereignisse. Beachten Sie alle Hintergrund-Streifen in jedes Isotop-Kanal sowie der Zelle Ereignisrate. Die Masse Zytometer erkennt eine "Zelle Veranstaltung" als eine gewisse Zunahme des Signals über dem Untergrund, so Hintergrundsignal aus freien Metall oder ungebundene Antikörper können die "Zelle Event" count ändern. Zusätzlich kann ausgeführt Zellen mit zu hoher Konzentration zu einer erhöhten Anzahl von Dublett Ereignisse. Hintergrund kann durch zusätzliche Wäschen oder mehr Zellverdünnung vermindert werden. Dubletts kann durch größere Zellverdünnung minimiert werden, auf Kosten eines erhöhten Laufzeit.
8. Finishing Probe Datenerfassung. Wenn die Erfassungszeit erreicht ist, wird die Datenerfassung beendet. Es wird ein wenig Verzögerung, bevor ein Pop-up-Fenster mit sein ein "OK"-Taste erscheint, wieder ist dies durch "On-the-Fly" Datenverarbeitung. Abtastmodus kann auch gestoppt Prémat werdenurely durch das Drücken der "Stop"-Taste. In diesem Fall werden alle Zellen bereits registrierten Ereignisse gezählt und in Ausgabedateien verarbeitet werden.
9. Injection von mindestens 500 ul MilliQ Wasser zwischen jeder Probe auch minimiert Probenverschleppung.

4. Reinigen des Geräts Nach dem Gebrauch

1. Waschlösung. Nach der letzten Probe wird ausgeführt und die Probenschleife mit Wasser gespült, injizieren 450 ul Waschlösung in die Probenschleife. Überwachen Sie die Freisetzung von freiem Metall in der Messe Kalibrierung der Registerkarte Data Acquisition Fenster Einstellungen wie in Schritt 2,8 (Abb. 9). Wenn das freie Metall-Signal zu verringern beginnt, mit 3 ml MilliQ Wasser spülen und zu überwachen, bis Hintergrundwerte erreicht werden.

Abbildung 9. Massenkalibrierung Registerkarte Fenster, während der Post-run Reinigung mit DVS Waschlösung. Die vertikalen Streifen im TOF Region 9800-11000 sind Antikörper-Label Isotope aus der Maschine gereinigt werden. Die vertikalen Streifen rund TOF 11500 zu den beiden Ir Interkalator Isotopen entsprechen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

5. Abschalten der Maschine

1. In der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, wählen Sie "Stop Plasma". Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wird es ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, die Vernebler entfernen. Drücken Sie auf "OK". In der Karte Cage Registerkarte schalten Sie die Heizung. Schließen Sie das Ventil auf der Argon-Versorgung.
2. Entfernen der Vernebler. Entfernen Sie den Vernebler aus der Sprühkammer durch vorsichtiges Ziehen nach hinten. Lösen Sie die Probe Einführung Schlauch aus Schritt 1,6 und legen beiseite. Lösen Sie das Make-up Gaseinleitung Verbindung zu leicht lösen, dann ziehen Sie den Vernebler aus. Verlassen die Armatur verschraubt reduziert die Chancen von lOsing den schwarzen Gummi-O-Ring und weiß konische Stück Plastik.
3. Reinigung Vernebler. BackFlush beide Ports der Vernebler mit 5% Citranox mit der Spritze und Schlauch wie in Schritt 1.3. Speichern Sie, bedeckt, in 5% Citranox bis zum nächsten Gebrauch.

Representative Results

Nach dem obigen Protokoll sollte durchzuführen vier Dinge. Erstens wird damit ausreichende Aufwärmzeit für die Masse Zytometer erzeugen einen heißen, stabiles Plasma für optimales Signal und minimalen Oxidbildung. Zweitens ausreichendes Waschen der Masse Zytometer mit MilliQ Wasser und DVS Waschlösung (Abbildung 9) wird dazu beitragen, die Niveaus von Metall Adsorption an die Schläuche und andere Teile der Maschine und hilft, Hintergrund während Probenaufnahme reduzieren (Abb. 8). Es wird auch helfen entfernen Sie alle Zellen, die in der Maschine stecken und könnte somit minimiert Verschleppung von Probe zu Probe. Drittens während Oxidbildung kann nicht vollständig verhindert werden, richtige Abstimmung der Masse Zytometer (Figuren 5-7) wird optimieren Gesamtsignal bei der gewünschten Masse M Hilfe, unter Minimierung Hintergrund an der Oxid Masse M +16. Wie in Abbildung 10 zu sehen, unsachgemäße tuning (magenta) deutlich Oxidbildung bei erhöhtenM 16 an den richtig abgestimmt Probe (dunkelblau) verglichen. Dies hat den Effekt der leicht abnehmende gewünschte Signal am M und signifikant erhöht unerwünschte Hintergrundinterferenz bei M +16.

Schließlich sollte ein ausreichendes Waschen der Probe in Puffer und schließlich in MilliQ Wasser Metall / Antikörper Hintergrundsignal auf akzeptable Werte zu reduzieren. Die MilliQ Wasser wäscht und Resuspension sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der stetigen Aktuelle Einstellungen im Verlauf von mehreren Stunden Laufzeit. Proper Verdünnung der Probe in MilliQ Wasser hat auf einer täglichen Basis von Stichproben ermittelt werden. Allerdings Verdünnen auf ~ 10 ⁶ (Start-) Zellen / ml ist ein guter Ort, um zu beginnen. Basierend auf der ersten Probe von einem Satz, können mehr oder weniger Verdünnung für nachfolgende Proben untergebracht werden. Proper Waschen und richtige Verdünnung wird sichergestellt, minimal Hintergrund und die größte Auflösung von Zellen, aber gleichzeitig die Notwendigkeit für Geschwindigkeit (Abbildung 8).

Abbildung 10. Effekt der richtigen Abstimmung auf das gewünschte Signal, und die Differenz in Oxidbildung zwischen verschiedenen Lanthanidenmetallen. Polystyrol-Kügelchen mit natürlichen Überflusses La139, Pr141, Tb159, Tm169 und Lu175 von DVS Sciences wurden in Zelle Akquisition Modus ausgeführt werden. Getrennte Proben der Perlen wurden zu den angegebenen Schminken Gasströmungsraten (vgl. Abb. 6) verlaufen. Die Daten wurden mit FlowJo v9.4.9 für Mac, einschließlich Ausblendung Schutt aus zerbrochenen Perlen. Die richtig abgestimmt Probe betrug bei 0,74 l / min. Diese hatten höhere Signalintensitäten als bei niedrigeren Strömungsgeschwindigkeiten und höheren Signal an "M" Metall Massen mit weniger Signal an den "M 16" Oxid Massen als die unsachgemäß abgestimmt Signal. A. Signal an "M" und Masse La139 Tm169. Beachten Sie, dass La139 Signalintensität mehr als Tm169 wird durch Make-up Gasdurchsatz betroffen. B. Signal bei "M 16" Oxid Massees 155 und 185, entsprechend La139 + O16 und O16 Tm169 + Oxide sind. Es gibt keine eigentliche "Gd155" oder "Re185" in den Perlen. Das Oxid Signal in der "Gd155" Kanal ist besonders stark, da La139 wird leicht oxidiert. Dies stellt eine der höchsten von Oxid kann man erwarten, zu begegnen. C. Graph von "M" und "M +16" Signalintensitäten als Funktion von Make-up Gasdurchsatz. Gefüllte Symbole repräsentieren Masse "M", während offene Symbole Masse "M 16" darstellen. Die Farbe der Linien an die jeweilige Masse "M" entsprechen. Beachten Sie, dass La139 und Pr141 stark durch Make-up Gasdurchsatz betroffen, auch einen Punkt erreicht, wo mehr Masse "M 16" Oxid vorhanden ist als die Masse "M". Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

In den letzten Jahrzehnten hat sich Fluoreszenz-Durchflusszytometrie war ein Arbeitstier Verfahren zur Analyse von einzelnen Zellen, sowohl in Bezug auf Oberflächen-Expression und funktionelle Assays. Allerdings hat die Fragen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe die Anzahl der gleichzeitigen Marker begrenzt. Während Experimente mit mehr als 12 gleichzeitige Marker gemeldet wurden, macht die Höhe der Entschädigung notwendigen dies technisch schwierig.

Statt Fluorophore, Pionier Masse Zytometrie von DVS Sciences verwendet Polymere mit chelatisierenden Seiten für Metalle als Marker für Antikörper. ^1-3 Aufgrund der Reinheit der Metalle und der Masse Auflösung von ICP-MS, es ist tatsächlich keine "spektrale Überlappung." Da die meisten der eingesetzten Elemente nicht biologisch relevanten, gibt es auch wenig Hintergrund zu bewirken "Autofluoreszenz." Diese Tatsachen erlauben die Verwendung von mehr als 30 gleichzeitige Markierungen in einem einzigen Experiment. ^6,7 Es gibt auch einen breiteren dydynamischen Bereich des Signals in der ICP-MS als in einem typischen Fluoreszenz-Experiment.

Allerdings hat Masse Zytometrie Einschränkungen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik: Zellen können nicht für die Sortierung und weitere Experimente wiederhergestellt werden. Die Masse hat eine strenge Zytometer Anforderung für die Gegenwart von Metallen: wenn ein Metall nicht vorhanden ist, eine Zelle wird nicht erkannt. Dies ist der Hauptgrund für die Verwendung von Metall-Chelat-DNA-Interkalatoren, um korrekte Prozent-of-übergeordneten Statistiken zu gewährleisten, da alle Zellen unabhängig davon, ob jeder Antikörper-Sonden binden detektiert wird. ^3,6-7 Schließlich wird die Stromzelle Übertragungseffizienz der Maschine beträgt ~ 25%, verglichen mit einem Wirkungsgrad von> 90% für ein fluoreszierendes Durchflußzytometer. Daher wird eine größere Anzahl von Zellen beginnend oft erforderlich, insbesondere für seltene Zellpopulationen. Jedoch ist dies in der Regel durch die Tatsache, dass eine einzige Masse Zytometer Probe häufig ersetzt mehrere fluoreszierenden Proben ausgewogen. Schließlich ist die maximale Zell-Besitzstandsition Rate ist viel langsamer als Standard-Leuchtstofflampen Durchflusszytometer bei ~ 1000 Zellen / sec; optimale Rate ist oft die Hälfte. Daher nimmt jede Probe mehr zu laufen.

Mehrere Zeitungen haben kürzlich auf der Färbung von verschiedenen Arten von Zellproben veröffentlicht worden. ^3,5-7 Der Zweck dieses Artikels ist es, Informationen über die richtige Verwendung eines CyTOF ^TM Masse Zytometer zum Laufen Proben. Wartung der Vernebler durch Rückspülung mit und Lagerung in 5% Citranox minimiert Aufbau von Zelltrümmern und Metallen, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Verstopfungen. Wartung der Maschine für eine optimale Leistung ist zweigeteilt. Erstens hilft die richtige Stimmung (Strom, Make-up-Gas) der Maschine auf mindestens täglich eine ordnungsgemäße Messung. Zweitens ausreichendes Waschen mit MilliQ Wasser zwischen jeder Probe und mit Waschlösung am Ende läuft zu entfernen aufgebauten organischen und anorganischen Verunreinigungen zu minimieren hilft Hintergrund im allgemeinen und Verschleppungzwischen den Proben. Schließlich hat die Qualität der Probenvorbereitung einen großen Einfluss auf die Qualität der Erfassung. Mehrere Wäschen in Puffer und schließlich in MilliQ Wasser helfen entfernen Metall-Hintergrund aus Interkalatoren oder unspezifische Antikörper-Bindung. Proper Verdünnung der Zellprobe hilft Gleichgewicht optimale Auflösung zwischen Zelle Veranstaltungen bei gleichzeitiger Minimierung der gesamten Laufzeit pro Probe. Proper Verdünnung auch minimiert die Wahrscheinlichkeit besteht, dass eine Verstopfung im Vernebler.

Fehlerbehebung Häufige Probleme

Ein. Die Maschine ist nicht vorbei "RFG vorbereiten" Schritt beim Start-up

Unter der Karte Cage auf der Registerkarte Instrument Set-up-Fenster, drücken Sie "Reset" unter HLG. Versuchen Sie, die Maschine zu starten. Wenn dies nicht beheben das Problem, schließen Sie die Software wieder zu öffnen, drücken Sie "Reset" wieder, und versuchen zu starten. Wenn dies immer noch nicht behoben das Problem, überprüfen Sie die HLG Generatorschalter Schalter auf der linken hinteren Ecke des Geräts. Wenn ausgelöst,Neupositionierung auf "On", drücken Sie "Reset", und versuchen zu starten. Wenn dies immer noch nicht behoben das Problem, wenden Sie sich DVS.

2. Die Maschine schaltet sich während des Betriebs

1. Überprüfen Argonzufuhr. Wenn die Argondruck Erreichen der Maschine bekommt unter etwa 40 psi, führt die Software eine automatische Abschaltung.
2. RFG überschritten 100W Fehler. Dies geschieht, wenn der Energiebedarf für das Plasma geht außerhalb des 1300 + / - 100W Fenster, und die Software führt eine automatische Abschaltung. Dies wird üblicherweise durch unebene Spray aus dem Zerstäuber, insbesondere große Tröpfchen verursacht. Diese übermäßig kühlt das Plasma, erfordern mehr Energie, um das Plasma aufrechtzuerhalten. Dies kann passieren, da übermäßige Kraft genutzt, um die Spritze Schlauch an der Spritze befestigt beim Wechseln der Spritzenpumpe. Dies bewirkt eine große Spray von Tröpfchen, Abkühlen des Plasmas. Ist dies der Fall einfach die Maschine neu starten.

Dies kann auch geschehen durch große Tröpfchen, zu beginnenbilden, wenn der Vernebler beginnt zu verstopfen. Wenn dieser Fehler auftritt, entfernen Sie den Vernebler für die Reinigung, legen Sie eine saubere Vernebler und neu zu starten.

Weitaus seltener, kann die dünne Probe Schlauch zwischen der Probenschleife und dem Vernebler verstopfen. Dies kann durch anomal niedrige Flussrate von Flüssigkeit, wenn der Schlauch aus dem Zerstäuber entfernt diagnostiziert werden. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie den betroffenen Schläuche und Verschraubungen mit frischen Schläuchen aufgebaut werden, und ersetzen mit einem neuen Vernebler Anschlüsse und Schläuche Kit.

3. Keine Isotop Streifen (oder Zelle Ereignisse) sichtbar während Zellprobe Akquisition (Abbildung 8), oder während Sie Massenkalibrierung Registerkarte Fenster (Abbildungen 3, 4, 9)

1. Überprüfen Sie die Spritzenpumpe. Dies geschieht häufig durch Vergessen auf "Play" während der Wechsel von der Spritzenpumpe Spritze getroffen. Dies kann auch passieren, wenn "Pause", anstatt "stop", während die Spritze Änderung getroffen wird. "Pause" nicht zurückgesetzt das Volumen Zähler auf der Spritzenpumpe, Und es wird bei 3,000 mL abgegebene Volumen zu stoppen, egal ob flüssig bleibt. Schließlich kann die Spritze aus Wasser laufen können.
2. Überprüfen Probenventils. Achten Sie darauf, Probe, während Sie auf "Load" laden, und wechseln Sie dann zu "injizieren" kurz vor dem Start das Beispiel auszuführen.
3. Erschöpfte oder übermäßig zu verdünnen Probe. Sie können alle Ihre Probe ausgeführt haben, kontrollieren Acquisition Time Berechnungen (siehe Schritt 3.3). Alternativ können Sie den Verdünnungsfaktor verrechnet haben, und / oder verloren mehr Zellen als bei Probe Verarbeitung erwartet.
4. Verstopfte Vernebler. Dies geschieht üblicherweise durch einen HLG Fehler (siehe Ausgabe 2b) vorausgeht, aber eine Verstopfung kann notiecably reduzieren die Zellen-Übertragungs-Effizienz vor abstellende.

Fragen 3c und 3d kann auch durch Ausführen einer Probe der Eu-haltigen Polystyroleichung Perlen überprüft werden. Sie werden mit rund 1 Mio. / mL (Vortex auch vor dem Zeichnen Probe!) Geliefert. Daher wäre Füllen der 450 ul Probenschleife geben aprund 450.000 Perlen. Die CyTOF ^TM Zellübertragung Effizienz ist machine-dependent, aber ca. 15-30%. Daher würde 67,500-135,000 Wulst Ereignisse aus diesem Injektion erwarten. Zahlen unter daß stimmen mit einer Verstopfung in dem Schlauch oder Vernebler.

Die Zelle / Bead Übertragungseffizienz ist etwas gelegentlich testen, um keine langfristige Trends beachten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity