Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

Summary

את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה נדונות

Abstract

בשנים האחרונות, הניתוח המהיר של תאים בודדים יש בדרך כלל בוצע באמצעות cytometry זרימה ונוגדנים שכותרת-fluorescently. עם זאת, סוגיית חפיפת רפאים של פליטות fluorophore הגבילה את מספר הבדיקות בו זמנית. לעומת זאת, cytometer ההמוני CyTOF החדש על ידי זוגות מדעי DVS מערכת הקדמת תא בודד נוזל ICP-MS. ¹ במקום fluorophores, פולימרים המכילים איזוטופים chelating מתכת מועשרת-מאוד הם מצמידים לנוגדנים או בדיקות ספציפיות אחרות. ^2-5 בגלל טוהר המתכת והרזולוציה המונית של cytometer ההמוני, אין "חפיפת רפאים" מהאיזוטופים שכנים, ולכן אין צורך מטריצות פיצויים. בנוסף, בשל השימוש במתכות lanthanide, אין רקע ביולוגי ולכן אין לה מקבילה של autofluorescence. עם חלון המוני הפורשים מסה אטומית 103-203, באופן תיאורטי עד 100 תוויות יכולות להבחין בו זמנית. כיום, יותר מ 35 ערוצים זמינים באמצעות ריאגנטים chelating הזמינים ממדעי DVS, המאפשר לנתיחת תקדים של הפרופיל החיסוני של דגימות. ^6-7

חסרונות cytometry המוני כוללים דרישה המחמירה לאיזוטופ נפרד מתכת לבדיקה (אין מקביל לפיזור קדימה או בצד), ועובדה שמדוברת בטכניקה הרסנית (אין אפשרות למיון החלמה). התצורה הנוכחית של cytometer המסה יש גם שיעור תא שידור של רק ~ 25%, ולכן דורש קלט מספר גבוה יותר של תאים.

ביצועים יומיים אופטימליים של cytometer ההמוני דורשים מספר שלבים. המטרה הבסיסית של אופטימיזציה היא למקסם את עוצמת האות הנמדדת של איזוטופים המתכת הרצויה (M) תוך מזעור ההיווצרות של תחמוצות (16 '), שיהיה הפחתה בעוצמת אות M ולהפריע לאות רצויה בM 16. הצעד הראשון הוא לחמם את המכונה כל כך חם, אני יציבCP פלזמה כבר נקבע. שנית, את ההגדרות עבור קצב זרימת גז נוכחי ואיפור חייבות להיות מותאמות על בסיס יומי. במהלך איסוף דגימה, שיעור אירועי התא המרבי מוגבל על ידי יעילות גלאי ומהירות עיבוד עד 1000 תאים / 2. עם זאת, בהתאם לאיכות המדגם, שיעור אירועי תא איטי יותר (300-500 תאים / 2) הוא בדרך כלל רצוי שיאפשר רזולוציה טובה יותר בין אירועי תאים ובכך למקסם את הגופיות שלמות על כפילויות ופסולות. לבסוף, ניקוי נאות של המכונה בסוף היום מסייע למזער אות רקע בשל מתכת חופשיה.

Protocol

כל דגימות התאים לCyTOF חייבות להיות קבועות וpermeabilized. זה מאפשר כניסה רבה יותר של intercalator דנ"א המכיל אירידיום, וגם מונע תמוגה תא במהלך הרחצה במים וצעדי MilliQ resuspension מייד לפני ההזרקה לתוך cytometer ההמוני.

1. Start-up של Cytometer ההמוני

1. פתח את תוכנת CyTOF. בחר הגדרת מכשיר. בכרטיסיית קייג' הכרטיס, לך לפינה ימנית התחתונה ולחץ על מחמם "על" כפתור. הפעל לפחות 15 דקות לפני הזמן רצוי בתנור כדי לאפשר מספיק זמן למעטפת תא התרסיס להגיע 200 ° C.
2. החלף את המזרק הלבן נור מקרין 3 מ"ל במשאבת המזרק עם מזרק מלא במים טרי MilliQ.
3. ניקוי nebulizer. Backflush nebulizer באמצעות המזרק והצינורות למשוך 2-3 פעמי citranox 5% הם באמצעות היציאה הקטנה יותר הנוזליות מבוא והקדמת יציאת הגז הגדולה יותר. חזור backflushing עם MilliQ מים לאo להסיר citranox שיורית.
4. בדקו כדי לוודא שהנוריות בלוח הקדמי של CyTOF הם מוארים כמו באיור 1.

איור 1. נוריות לוח CyTOF לפני ההפעלה.

5. פתח שסתום מכל גז ארגון. זה אמור לגרום לאור "הארגון" בחזית כדי להפעיל.
6. צרף nebulizer לאיפור כניסת גז. הברג החוצה את איפור מחבר צינורות גז ולהסיר את O-טבעת הגומי השחור וחתיכת הפלסטיק החרוטה הלבנה. שים לב "המפרק" הרחב יותר על גזע נמל הקדמת הגז של nebulizer. הנח את המחבר בהקדמת יציאת גז. הנח את טבעת o השחורה מעל הקצה של נמל הדלק, ולאלץ את O-טבעת עבר החלק הרחב יותר של גזע הנמל. מניח את יריעת הפלסטיק לבן חרוטים בראש עם הקצה הצר ציינה, ובורג על צינור גז האיפור.
7. בכרטיסיית בקר RFG של חלון הגדרת המכשיר, לחץ על "התחל פלזמה". מאז nebulizer כבר הוכנס, לחץ על "אישור". התוכנה תהפוך בילר, תתחיל הזרימה של גז, ולהצית את פלזמה. מתח הגלאי יהיה כבש את. יהיה חלון קופץ אומר "רצף הזנק פלזמה סיים בהצלחה" כשסיים, לחץ על "אישור". אורות חדשים צריכים להיות על בפנל הקדמי (איור 2 >).

איור 2. נוריות לוח CyTOF אחרי הפלזמה והציתה הזנק הושלמה בהצלחה.

9. הפעלת משאבת מזרק. בפינה הימנית העליונה, לחץ על כפתור הירוק "לשחק" כדי להתחיל במשאבת המזרק ולהתחיל זורם נוזל דרך הצינורות וריסוס מתוך nebulizer. הגדרות ברירת המחדל הן למזרק 3 מ"ל של מים. על מנת שמדגם שזורם דרך לולאת הדגימה, משאבת המזרק חייבת להיות שונה מעת לעת כשהוא פועל מחוץ למים. בחלק העליון של המסך, יש דלפק המציין כמה נוזלים זרמו ממשאבת המזרק. משאבת המזרק תפסיק כאשר מונה זה מגיע "3.000" או הבוכנה פוגע בסופו של המזרק. בעת מילוי במזרק, עליך ללחוץ על "עצור" ולא על הכפתור הכחול "שתיקה" על מנת לאפס את המונה.

דואר "> 2. כיול יומי של Cytometer ההמוני

1. Cytometer ההמוני צריך כ 20 דקות כדי להשיג פלזמה חמה, יציבה לפני הכיול. המטרה של צעדי הכוונון היא למקסם את האות הרצויה של Tm169 או Tb159 תוך שמירה על "Gd155" (תחמוצת; La139 + O16) אות תחת 3% מהערך הגבוה יותר. לחץ על הלחצן הגדרות רכישה כדי לפתוח את חלון הגדרות רכישת נתונים. בכרטיסיית analytes, לחץ על הטבלה המחזורית כדי לפתוח את פנל בחירת איזוטופ. בחר את האיזוטופים בפתרון כוונון מדעי DVS מופיע במדריך, ולאחר מכן לחץ על "שמור".
2. לחץ על איזוטופים Per קריאת הלחצן כדי לפתוח את המסה (ES) לפי חלון קריאה. בחר "קטניות רוזן", וrescale ציר y על ידי הזנת מספר חדש ולחיצה על "זן".
3. מלא 1 מיליליטר מזרק ירוק נור מקרין עם פתרון כוונון. הפעל את בורר יציאת מדגם כדי "לטעון", להזרים 450 μl של פתרון כוונון, ואז להפעיל את הבורר ל" להזריק ". בכרטיסיית הכיול ההמוני של הנתונים Acquisit יון חלון הגדרות, לחץ על "הפעל" כדי לפקח שהמונים זורמים על ידי. הצד השמאלי של החלון הוא מסה נמוכה יותר, ואילו בצד ימין הוא מסה גבוהה יותר. הערה: יש כבר יהיו סימנים באזור 9400-9800 TOF, עקב איזוטופים קסנון בגז הארגון (איור 3). חכה עד איזוטופים פתרון כוונון יתחילו להופיע כפסים בתצוגה זו (איור 4).

איור 3. חלון המוני כיול כרטיסייה, רמות רקע מראה לאיזוטופים שונים לאחר פתרון לשטוף ומים לשטוף. האזור סביב TOF 9400-9800 מתאים לאיזוטופים קסנון בגז הארגון, ותמיד צריך להיות נוכח. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
איור 4. חלון כרטיסיית כיול המוני, מראה פסים אנכיים לאיזוטופים שונים בפתרון כוונון DVS. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

4. חזור למסה (ES) לפי קריאת חלון ולחץ על הכפתור הירוק "Play" בפינה השמאלית העליונה. כל איזוטופ נבחר בשלב 2.1 מיוצג על ידי קו בצבע שונה. ציר x ברירת המחדל הוא "זמן", בשניות. לנטר את הרמות של איזוטופים השונים עד שהם יציבים.
5. כוונון של נוכחי. בכרטיסיית הפרמטר של חלון הגדרות רכישת הנתונים, בחר "נוכחי" מהתפריט הנפתח. בואו נתחיל = 0, גימור = 10, ערך צעד = 0.5, זמן התישבות = 200, ולחץ על "שמור". לחץ שוב על המסה (ES) לפי חלון קריאה ומשחק להיט. ציר ה-X הוא עכשיו "נוכחי". שים לב שבו אותות של איזוטופים השיא (איור 5), וr ecord. תחת כרטיסיית הגדרת DAC ערוצים של חלון הגדרת המכשיר, לגלול למטה כדי "נוכחי" ולהיכנס לערך חדש. לחץ על "הגדרת ערך נוכחי בפועל", ואז "לחסוך".

איור 5. פרופיל כוונון נוכחי.

6. כוונון של גז האיפור. שינוי תפריט נפתח ל" גז איפור ". בואו נתחיל = 0.55, סוף = 0.95, ערך צעד = 0.05, זמן התישבות = 200. לחץ לשמור. לחזור למסה (ES) לפי חלון קריאה ומשחק להיט. ציר ה-X הוא עכשיו שיעור "איפור גז" זרם. להקליט בו את האותות של שיא איזוטופים. שים לב לעלייה המהירה של האות "Gd155" הקרוב לסוף (איור 6). חזור אל כרטיסיית הגדרת ערוצי DAC, לגלול למטה כדי "איפור גז", ולהיכנס לערך חדש. לחץ על "הגדרת ערך נוכחי בפועל", ואז "לחסוך".

igure 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
איור 6. פרופיל כוונון גז איפור.

7. יחס של הקלטה רצויה תחמוצת לעומת איזוטופ. הפוך הזרקת μl 2 450 של פתרון כוונון. בכרטיסיית הפרמטרים, בחר "זמן" מהתפריט הנפתח, בואו נתחיל = 0, סוף = 10, ערך צעד = 1, והתיישב זמן = 200. לחץ על "שמור". הכה "לשחק" במסה (ES) לפי קריאת חלון. לאחר הקווים התייצבו (איור 7), השתמש בסמן כדי לקרוא את הערך בתיבות השמאליות העליונות לTm169 או Tb159 (ערך גבוה יותר) וגם את הערך "Gd155" (<3% מהערך הגבוה יותר). ערכים אלה ניתן גם לשמור בקובץ כוונון לשימוש עתידי.

איור 7. מדידת עוצמת אות פתרון כוונון לאחר אופטימיזציה גז נוכחי ואיפור.

8. ניקוי של סםלולאת ple. הזרק 3 מ"ל של מי MilliQ דרך לולאת הדגימה, ואחרי 500 μl של פתרון שטפי DVS. המעקב אחר ההתקדמות של הניקוי על ידי לחיצה על "לרוץ" בכרטיסיית הכיול ההמוני. שטוף עד עוצמת הפסים (איור 4) מתחילה לרדת, לאחר מכן פעל על ידי 3 מ"ל של מים ולפקח MilliQ עד למטה לרמות רקע (איור 3).

3. דוגמאות ריצה

1. פתח את חלון הרכישה. הגדרות ברירת מחדל: האם ניתוח = On-the-fly, אות לניתוח = כיול רוזן כפול, כפול = נתונים. הפחתת רעש נבחרה. כל אלה עשויים להיות שונים אם ירצו בכך. הזן את שם הקובץ. כל הקבצים חייבים להיות נשמרו :/ E / כונן.
2. הגדרת עיכובי רכישה. יהיה עיכוב קל ברישום אירועי תא של כ 30 שניות עקב אורכו של הצינור בין לולאת הדגימה וnebulizer. לפיכך, הסכום הכולל של "עיכוב רכישה" ו" רח הגלאיעיכוב היכולת "צריך להיות לפחות 30 שניות. עיכוב יציבות גלאי צריך להיות לפחות 20 שניות.
3. הגדרת זמן איסוף נתונים. "זמן רכישה," הוא מספר השניות שרצונך להפעיל המדגם שלך. מילוי לולאת המדגם 450 μl ידרוש 600 שניות כדי להשלים. הוא הציע כי 50-100 שניות תתווספנה לסוף זמן הריצה כדי למזער לשאת על מדגם.
4. Resuspension של מדגם. כדי למזער את הצטברות המלחים במכונה, הוא הציע שלפחות שתי שטיפות במי MilliQ להיעשות בסוף צביעת התא, ואחרי resuspension סופי במי MilliQ. נפח מי MilliQ משמש לresuspend תא גלול ישתנה בהתאם למספר התאים שנפתחו ובהתאוששות התא לאחר הליך ההכתמה כולו. מקום טוב להתחיל הוא 10 ⁶ (התחלה) תאים / מ"ל. לאחר resuspension, לסנן דרך מסננת תא כדי להסיר אגרגטים.
5. מדגם החל לרוץ. הזן את שם קובץ חדש למדגם הנוכחי. לעבור את שסתום לולאת דגימה ל" עומס ", להזריק מדגם, לחזור ל" להזריק", ואז "הפעלה" פגעה בחלון הרכישה.
6. רישום אירועים סלולריים. תאים יהיו מיוצגים בחלון התמונה כאוספים אופקיים של סימנים בכל ערוץ איזוטופ / סמן אנכי (איור 8). בעוד cytometer ההמוני יכול לרשום 1000 תאים / שני, רזולוציה טובה יותר בין אירועים סלולריים בדרך כלל לקבל ב300-500 תאים / sec. זה מתאים לממוצע של 1 ~ רענון תא / מסך. זה עשוי להימשך עד 30 שניות לפני שמונה אירוע התא מתחיל לטפס. זאת בשל עיבוד נתונים "On-the-fly"; אין מידע לאירוע תא הולך לאיבוד.

איור 8. חלון רכישה במהלך ריצת מדגם, מראה שורות אופקיות של נקודות מתאימות לגורמים הקשורים בשלושה אירועים נפרדים של תאים.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

7. איכות אירועים סלולריים. שים לב כל רקע פסים בכל ערוץ איזוטופ, כמו גם את שיעור אירועי התא. Cytometer ההמוני מכיר "אירוע סלולרי" כעלייה מסוימת באות מעל רקע, כך אות רקע ממתכת או מאוגד נוגדן יכול לשנות את הספירה "אירוע הנייד" בחינם. בנוסף, פועל תאים בריכוז גבוה מדי עלול לגרום לעלייה במספר אירועי מקטורן. רקע יכול להיות מופחת על ידי כביסות נוספות או דילול תא גדול יותר. כפילויות ניתן למזער על ידי דילול תא גדול יותר, במחיר של זמן ריצה מוגברת.
8. גימור מדגם רכישת נתונים. כאשר זמן הרכישה הושג, איסוף הנתונים יסיים. יהיה קצת עיכוב לפני חלון קופץ עם הלחצן "אישור" מופיע, שוב, זה נובע "On-the-fly" עיבוד נתונים. רכישת מדגם יכולה להיות גם הפסיקה prematurely על ידי לחיצה על הכפתור "העצור". במקרה זה, את כל האירועים הסלולריים כבר רשומים ייספרו והמעובד לתוך קבצי פלט.
9. הזרקה של לפחות 500 μl מי MilliQ בין כל דגימה מסייעת גם לצמצם carryover מדגם.

4. ניקוי המחשב לאחר שימוש

1. שטוף את הפתרון. לאחר המדגם הסופי הוא לרוץ ולולאת הדגימה סמוקה עם מים, להזריק 450 μl של פתרון לשטוף לתוך לולאת הדגימה. לפקח על שחרורו של מתכת חופשיה בכרטיסיית הכיול ההמוני של חלון נתוני רכישת הגדרות כמו בשלב 2.8 (איור 9). כאשר אות המתכת החופשית מתחילה ירידה, שטוף עם 3 מ"ל של מי MilliQ ולפקח עד רמות רקע המושגות.

איור 9. חלון המוני כיול כרטיסייה, במהלך ניקוי לאחר ריצה עם פתרון לשטוף DVS. את הפסים האנכיים באזור TOF 9800-11000 הם איזוטופים נוגדני תווית שהתנקו מהמכונה. את הפסים האנכיים ברחבי TOF 11500 מתאימים לשני איזוטופים intercalator IR. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

5. כיבוי המכונית

1. בכרטיסיית בקר RFG של חלון הגדרת המכשיר, בחר "תפסיק פלזמה". כאשר ההליך יושלם, יהיה חלון מוקפץ מבקש ממך להסיר את nebulizer. לחץ על "אישור". בכרטיסיית קייג' קארד, לכבות את התנור. סגור את השסתום על אספקת הארגון.
2. הסרת nebulizer. הסר את nebulizer מתא התרסיס על ידי משייכת זהירות לאחור. הבריגו החוצה את מדגם צינורות ההקדמה מ -1.6 סטפ והנח בצד. הברג החוצה את חיבור איפור גז ההקדמה כדי לשחרר מעט, ואז למשוך את nebulizer. השארה הולמת נדפק יחד תפחית את הסיכויים לליטרosing הגומי השחור O-הטבעת וחתיכת פלסטיק חרוטה לבנה.
3. ניקוי nebulizer. Backflush שתי היציאות של nebulizer עם citranox 5% באמצעות מזרק וצינורות כמו בשלב 1.3. חנות, מכוסה, בcitranox 5% עד לשימוש הבא.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול הנ"ל צריך להשיג ארבעה דברים. ראשית, המאפשר זמן חימום נאות לcytometer ההמוני יפיק פלזמה חמה, יציבה הכרחית לאות אופטימלית והיווצרות תחמוצת מינימאלית. כביסה שנייה, נאותה cytometer ההמוני עם פתרון לשטוף DVS מי MilliQ ו( איור 9) תעזור להפחית את הרמות של מתכת ספיחה לצינורות וחלקים אחרים של המכונה, כדי לסייע להפחית רקע במהלך רכישת מדגם (איור 8). זה גם יעזור להסיר את כל תאים שעלולים להיתקע במכונה ובכך לצמצם carryover ממדגם למדגם. תוך היווצרות תחמוצת לא ניתן למנוע לחלוטין שלישי כוונון, וראוי של cytometer ההמוני (תרשימי 5-7) יעזור אות לייעל כוללת במסת m הרצוי, תוך מזעור רקע במסת תחמוצת M 16. כפי שניתן לראות באיור 10, כוונון לא תקין (מגנט) גדל באופן משמעותי בהיווצרות תחמוצת M 16 בהשוואה למדגם מכוון כמו שצריך (כחול כהה). זה כולל את ההשפעה של הפחתת אות רצויה בM מעט, ובאופן משמעותי להגדיל הפרעות רקע לא רצויות בM 16.

לבסוף, שטיפה נאותה של המדגם במאגרי המים ובסופו של דבר MilliQ צריכה להפחית אות רקע מתכת / נוגדנים לרמות מקובלות. הכביסות וresuspension מי MilliQ הם קריטיות לשמירת הגדרות נוכחיות יציבות לאורך הקורס של כמה שעות של זמן ריצה. דילול נכון של המדגם במי MilliQ יש לקבוע על בסיס מדגם יומי. עם זאת, לדילול ~ 10 ⁶ (התחלה) תאים / מ"ל הוא מקום טוב להתחיל בו. על פי המדגם הראשון של קבוצה, פחות או יותר לדילול הדגימות הבאות ניתן לאכלס. כביסה נכונה ודילול נכון תבטחנה רקע מינימאלי ורזולוציה הגבוהה ביותר של תאים, תוך איזון את הצורך במהירות (איור 8).

-Together.within עמודים = "תמיד">
איור 10. השפעת הכוונון נכון על אות רצויה, והבדל בהיווצרות תחמוצת בין מתכות lanthanide שונות. חרוזי פוליסטירן מכילים La139 טבעי שפע, Pr141, Tb159, Tm169, וLu175 ממדעי DVS היו פועלים במצב של רכישת תא. דגימות נפרדות של החרוזים היו לרוץ בשיעורים המוצעים איפור גז הזרימה (השווה עם איור 6). הנתונים נותחו באמצעות FlowJo v9.4.9 עבור Mac, כולל gating את הפסולת מחרוזים שבורים. המדגם המכוון כמו שצריך היה ב0.74 ליטר / דקה. זה היה עוצמות גבוהות יותר מאשר אות בספיקות נמוכות, ואת אות גבוה בהמונים "M" מתכת עם אות פחות ב" M 16 "מסות התחמוצת מאשר האות המכוונת שלא כהלכה. א אות במסה" ז "וLa139 Tm169. שים לב שעוצמת האות La139 מושפעת יותר מTm169 ידי קצב זרימת גז איפור. ב 'אות במסה "M 16" תחמוצתes 155 ו185, המקבילה לLa139 + O16 וTm169 + O16 תחמוצות, בהתאמה. אין בפועל "Gd155" או "Re185" הווה בחרוזים. אות התחמוצת בערוץ "Gd155" חזקה במיוחד, עקב La139 שמתחמצן בקלות. זה מייצג את אחד מהרמות הגבוהות ביותר של תחמוצת אחד יכול מצפה לפגוש. גרף ג "M" ו "16 M" עוצמת אות כפונקציה של קצב זרימת גז איפור. סמלים מלאים מייצגים המוני "ז", ואילו סמלים פתוחים מייצגים המוניים "M 16". הצבע של הקווים מתאימים למסה המתאימה "ז". שים לב שLa139 וPr141 מושפעים מאוד על ידי קצב זרימת גז איפור, ואפילו הגיעו לנקודה שבי יותר מסה "M 16" תחמוצת היא הווה מהמוני "ז". לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

במשך העשורים האחרונים, cytometry הזרימה פלואורסצנטי היה סוס עבודת שיטה לניתוח תאים בודדים, הוא במונחים של ביטוי בשטח ומבחנים תפקודיים. עם זאת, בסוגיות של חפיפת ספקטרום של צבעי הניאון הגבילו את מספר הסמנים בו זמנית. בעוד ניסויים באמצעות יותר מ 12 סמנים בו זמנית כבר דיווחו, סכום הפיצוי הנדרש עושה את זה קשה מבחינה טכנית.

במקום fluorophores, cytometry ההמוני החלוץ ידי מדעי DVS משתמש פולימרים בעלי אתרי chelating למתכות כתוויות לנוגדנים. ^1-3 בשל הטוהר של המתכות והרזולוציה ההמונית של ICP-MS, אין שום יעילות "חפיפת רפאים". מאז ביותר של אלמנטים בם לא רלוונטיים מבחינה ביולוגית, יש גם קצת רקע כדי לגרום "autofluoresence." עובדות אלו מאפשרות שימוש של יותר מ 30 סמנים סימולטניים בתוך ניסוי אחד. ^6,7 יש גם dy רחב יותרמגוון namic באות בICP-MS מאשר בניסוי פלואורסצנטי טיפוסי.

עם זאת, cytometry מסה יש מגבלות. זוהי טכניקה הרסנית: תאים לא ניתן לשחזר למיון וניסויים נוספים. Cytometer המסה יש דרישה קפדנית לנוכחות של מתכות: אם מתכת אינה נוכחת, תא לא יזוהה. זו הסיבה העיקרית לשימוש בintercalators DNA המתכת chelating כדי להבטיח סטטיסטיקה נכונה אחוזים מהוריים, כפי שזוהו כל התאים ללא קשר אם כל בדיקות נוגדנים נקשרים. ^3,6-7 לבסוף, יעילות העברת התא הנוכחית של המכונה הם ~ 25%, בהשוואה ליעילות של> 90% לcytometer זרימת ניאון. לכן, מספר גדול יותר של תאים מתחילים נדרש לעתים קרובות, במיוחד עבור אוכלוסיות תאים נדירות. עם זאת, זה בדרך כלל מתאזן על ידי העובדה כי מדגם cytometer מסה אחת לעתים קרובות מחליף דגימות ניאון מרובות. לבסוף, התא המרבי acquisשיעור ition הוא הרבה יותר איטי מאשר cytometers זרימת ניאון הסטנדרטי ב ~ 1000 תאים / שני; שיעור אופטימלי הוא לעתים קרובות כי מחצית. לכן, כל דגימה לוקחת יותר זמן לרוץ.

כמה ממאמרים שהתפרסמו באחרונה בכתמים מסוגים שונים של דגימות תאים. ^3,5-7 מטרתו של מאמר זה הוא לספק מידע על השימוש הנכון בcytometer המוני ^TM CyTOF לדגימות ריצה. תחזוקה של nebulizer ידי backflushing עם והאחסון בcitranox 5% ממוזערים הצטברות של פסולת תא ומתכות, ובכך להפחית את הסיכוי לסתימות. תחזוקה של מכונה לביצועים אופטימליים יש שני חלקים. ראשית, הכוונון הנכון (איפור גז הנוכחי) של מכונה על לפחות בסיס יומי מסייע להבטיח מדידה נכונה. כביסה שנייה, הולמת במי MilliQ בין כל דגימה ועם פתרון לשטוף בסוף רצה להסיר בנוי פסולת אורגנית אורגנית תסייע למזער רקע בכלל וcarryoverבין דגימות. לבסוף, את האיכות של הכנת מדגם יש השפעה רבה על איכות נתוני רכישה. שטיפות מרובות בחיץ ולבסוף במי MilliQ לסייע להסיר כל מתכת רקע מintercalators או מחייב נוגדן ספציפי. דילול נכון של מדגם התא יעזור לאזן רזולוציה אופטימלית בין אירועים סלולריים תוך מזעור זמן ריצה כוללת למדגם. דילול נכון גם עוזר למזער את הסבירות לגרימת סתימות בnebulizer.

פתרון בעיות נפוצות

1. המכשיר לא מצליח לעבור "RFG מכין" צעד במהלך האתחול

תחת לשונית קייג' הכרטיס של הגדרת חלון הכלי, לחץ על "איפוס" תחת RFG. נסה להפעיל את המכונה. אם זה לא פותר את הבעיה, סגור את התוכנה, לפתוח מחדש, לחץ על "איפוס" שוב, והניסיון להתחיל. אם זה עדיין לא פותר את הבעיה, בדוק את מתג מפסק הגנרטור RFG בפינה השמאלית האחורית של המכונה. אם מעד,למיקום מחדש, "איפוס" "על" פגע, ותנסה להתחיל. אם זה עדיין לא פותר את הבעיה, פנה DVS.

2. מכונת כיבוי תוך כדי ריצה

1. בדקו אספקת ארגון. אם לחץ הארגון להגיע למכונה מקבל מתחת סביב 40 ​​psi, התוכנה מבצעת כיבוי אוטומטי.
2. RFG חרג 100W שגיאה. המצב זה מתרחש כאשר ביקוש הכח לפלזמה יוצא החוצה 1300 + / - 100W חלון, והתוכנה מבצעת כיבוי אוטומטי. הדבר נגרם בדרך כלל על ידי ריסוס אחיד מnebulizer, טיפין גדולות במיוחד. זה מוגזם מקרר את הפלזמה ודורש יותר אנרגיה כדי לשמור על הפלזמה. זה יכול לקרות בגלל שימוש בכוח מופרז כדי לחבר את צינור המזרק למזרק במהלך השינוי של משאבת המזרק. זה גורם לתרסיס גדול של טיפין, קירור הפלזמה. אם זה מקרה, פשוט להפעיל מחדש את המחשב.

זה יכול לקרות גם בשל טיפין גדולות שמתחילותנוצר כאשר nebulizer מתחיל להצטבר. אם חוזר שגיאה זו, הסר את nebulizer לניקוי, הכנס nebulizer נקי והפעלה מחדש.

הרבה פחות, צינורות המדגם הדקים בין לולאת הדגימה וnebulizer יכולים לסתום. זה יכול להיות מאובחן על ידי ויוצא דופן קצב זרימה הנמוכה של נוזל כאשר הצינור יוסר מnebulizer. אם זה מקרה, להסיר את הצינור והאביזרים להיבנות עם צינורות טריים המושפע, ולהחליף עם אבזרי nebulizer חדשים וערכת צינורות.

3. ללא פסי איזוטופ (או אירועים סלולריים) גלוי במהלך רכישת מדגם תא (איור 8), או בעת צפייה בחלון כרטיסיית כיול המוני (איורים 3, 4, 9)

1. בדקו את משאבת המזרק. זה מתרחש לעתים קרובות בשל שוכח להכות "לשחק" במהלך משתנה של מזרק משאבת המזרק. זה יכול לקרות גם אם "שתיקה", ולא "תחנה", הוא נפגע במהלך שינוי המזרק. "השהה" לא לאפס את מונה הנפח במשאבת המזרק, והוא יפסיק בנפח 3.000 מ"ל לוותר, לא משנה אם שרידים נוזליים. לבסוף, המזרק אולי נגמר מים.
2. בדקו שסתום מדגם. הקפד לטעון מדגם בעוד על "טען", ולאחר מכן לעבור ל" להזריק "בדיוק לפני תחילת ריצת המדגם.
3. מדולדל או מדי לדלל מדגם. ייתכן שמפעיל את כל המדגם שלך; לבדוק את חישובי זמן רכישה (ראה שלב 3.3). לחלופין, ייתכן שטעית בחישובי גורם הדילול, ו / או איבוד תאים יותר מצפוי במהלך עיבוד דגימה.
4. Nebulizer סתום. בדרך כלל זה הוא קדמת שגיאת RFG (ראה גיליון 2b), אבל סותמים notiecably יכולים להפחית את יעילות העברת התא לפני שגרם כיבוי.

יכולים להיות גם בדקו סוגיות 3c ו3d על ידי הפעלת מדגם של חרוזי כיול קלקר איחוד אירופיים המכילים. הם מסופקים בכ 1 מ'/ מ"ל ​​(מערבולת היטב לפני הסקת דוגמה!). לכן, ממלא את לולאת המדגם 450 μL היה נותן apסמיכות 450.000 חרוזים. יעילות העברת תא ^TM CyTOF היא מכונה תלויה, אבל כ 15-30%. לכן, 67,500-135,000 אירועי חרוזים שניתן היו לצפות שמהזרקה. מספרים נמוכים שעולים בקנה אחד עם כפכף בצינורות או nebulizer.

התא / יעילות העברת חרוז הוא משהו לבדוק מדי פעם, כדי לציין את כל מגמות ארוכות טווח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity