Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Summary

Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır

Abstract

Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analiz genellikle akış sitometrisi ve floresan-etiketli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, fluorofor emisyon spektral örtüşme sorunu eşzamanlı probların sayısını sınırladı. Buna karşılık, daha çok floroforlar göre bir ICP-MS. ¹ bir sıvı tek hücreli giriş sistemi DVS Sciences çiftler tarafından yeni CyTOF kütle sitometresinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metal şelatlama izotopları ihtiva eden polimerler, antikorlar ya da başka özel problar ile birleştirilir. ^2-5 Çünkü metal saflık ve kitle sitometresinin kütle çözünürlüğü, komşu izotoplar hiçbir "spektral örtüşme" olduğunu ve bu nedenle tazminat matrisler gerek. Buna ek olarak, lantanit metallerinin kullanımına bağlı olarak, otoflöresans herhangi bir eşdeğer bu nedenle hiçbir biyolojik arka plan ve. Atomik kütle 103-203, teorik olarak en fazla 100 etiket eşzamanlı ayırtedilebilecektir kapsayan kitlesel bir pencere bulunmaktadır. Şu anda, 35'ten fazla kanalı örneklerin immünolojik profili görülmemiş diseksiyonu izin DVS Bilimler edinilebilir şelatlama reaktifler kullanılarak kullanılabilir. ^6-7

Kitle sitometri için Dezavantajları prob başına ayrı bir metal izotop (ileri veya yan dağılım hiçbir eşdeğeri) ve yıkıcı bir tekniktir (kurtarma sıralama ihtimalinin) olması için sıkı gereksinimi vardır. Kütle sitometresinin akım konfigürasyonu, aynı zamanda tek bir hücre iletim hızı ~% 25, ​​ve böylece hücrelerin daha yüksek giriş numarası gerektiren sahiptir.

Kitle sitometresinin Optimal günlük performans birkaç adım gerektirir. Optimizasyon temel hedefi M sinyal yoğunluğu azaltmak ve M +16 de istenilen sinyal ile müdahale edeceğini oksitler (M +16) oluşumunu azaltırken istenen metal izotopları (M) ölçülen sinyal yoğunluğunun maksimize etmektir. İlk adım, makinenin çok sıcak, istikrarlı Ben ısınmak içinCP plazma kurulmuştur. İkincisi, güncel ve makyaj gaz akış hızı ayarlarına günlük olarak optimize edilmelidir. Numune toplama sırasında yüksek hücre olay hızı detektörü verim ve işlem hızı 1000 hücre / dakika ile sınırlıdır. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre olay oranı (300-500 hücre / saniye), örnek kalitesine bağlı olarak, genellikle hücre olaylar arasında ve böylece daha iyi bir çözünürlüğe çiftler çifti ve kalıntı fazla bozulmadan singlet en üst düzeye izin vermek için arzu edilir. Son olarak, günün sonunda makinenin uygun temizleme serbest metale bağlı olarak arka plan sinyali en aza indirir.

Protocol

CyTOF için tüm hücre örneklerinin sabitlenir ve permeabilize gerekir. Bu, iridyum içeren DNA enterkalatörün daha fazla giriş sağlar, ve aynı zamanda kütle sitometresi içine enjekte hemen önce MilliQ su ve yıkama adımları sırasında yeniden süspansiyon hücre parçalama önler.

1. Start-up Kütle Sitometre arasında

1. CyTOF yazılım programını açın. Enstrüman Ayarları'nı seçin. Kart Kafesini sekmesinde, sağ alt köşeye gidin ve düğmesine "ON" Isıtıcı tıklayın. 200 ° C'ye ulaşması sprey haznesi manto için yeterli zaman tanımak için ısıtıcı üzerinde istenilen zaman önce en az 15 dakika çevirin
2. MilliQ su ile dolu taze bir şırınga ile şırınga pompası beyaz Norm-JECT 3 ml şırınga değiştirin.
3. Nebulizatör Temizleme. Küçük sıvı giriş portu ve büyük gaz giriş noktası hem de 5 ile% citranox 2-3 kez çekmek için şırınga ve tüp kullanarak nebulizatör Backflush. MilliQ su t su tutmanın tekrarlayınrezidüel citranox kaldır o.
4. CyTOF ön panelindeki ışıklar Şekil 1'deki gibi yandığını teyit için kontrol edin.

Almadan önce Şekil 1. CyTOF paneli ışıkları.

5. Argon gazı tank valfini açın. Bu açmak için ön "ARGON" ışığı neden olmalıdır.
6. Gaz girişi makyaj nebulizatör takın. Sökün gaz boru sistemi bağlayıcı makyaj ve siyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça kaldırın. Nebulizer gaz giriş noktası kök üzerinde daha geniş bir "knuckle" unutmayın. Gaz giriş noktası konektörü yerleştirin. Gaz bağlantı ucuna siyah o-ring yerleştirin ve liman kök geniş kısmı geçmiş o-ring zorlamak. Make-up gaz boru üzerine beyaz konik plastik işaret dar ucu ile üst parça ve vida yerleştirin.
7. Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, "Başlat Plazma" tuşuna basın. Nebulizatör önceden takılmış olduğundan, "OK" tuşuna basın. Yazılım, chiller açın gaz akışını başlatmak ve bir plazma tutuşturmak olacaktır. Dedektör gerilimi kadar rampa olacak. Bittiğinde "Plazma başlangıç ​​süreci başarıyla tamamladı" söyleyerek bir pop-up penceresi olacak; basın "Tamam". Yeni ışıkları (Şekil 2 ön panelde olmalıdır >).

Şekil 2. Plazma ateşlenir ve start-up başarıyla tamamlandı CyTOF paneli ışıkları sonra.

9. Şırınga pompası açma. Sağ üst köşesinde, şırınga pompası başlatmak ve borular yoluyla sıvı akan ve nebulizatör dıarıya başlamak için yeşil "play" tuşuna basın. Varsayılan şırınga ayarları 3 mL su içindir. Bu su bittiğinde örnek örnek döngü akan edilmesi için için, şırınga pompası belirli aralıklarla değiştirilmesi gerekir. Ekranın üst kısmında, sıvı şırınga pompası dışarı akıyordu ne kadar gösteren bir sayaç var. Şırınga pompası bu sayaç şırınga sonunda isabet "3000" ya da piston ulaştığı zaman durur. Şırınga doldurma zaman, "dur" yerine sayacını sıfırlamak için mavi "pause" düğmesine vurmalıdır.

Kitle Sitometre e "> 2. Günlük Kalibrasyon

1. Kitle sitometresinin kalibrasyon önce sıcak, kararlı plazma elde etmek için yaklaşık 20 dakika gerekir. Yüksek değerin% 3 altında sinyal; ayar adımların amacı "Gd155" (La139 + O16 oksit) tutarak Tm169 veya Tb159, istenen sinyali maksimize etmektir. Veri Toplama Ayarları penceresini açmak için Acquisition Ayarlar düğmesini tıklatın. Analitler sekmesinde, izotop seçim panelini açmak için periyodik tabloyu tıklatın. Kılavuzunda listelenen DVS Bilimleri ayarlama çözüm izotoplar seçin, ardından "Kaydet" düğmesini tıklatın.
2. Okuma penceresi Başına Kütle (es) açmak için düğmeye Okuma Başına İzotoplar tıklayın. Yeni bir numara girerken ve "enter" tuşuna basarak "Bakliyat Count" ve rescale y ekseni seçin.
3. Ayar solüsyonu ile yeşil 1 ml Norm-jesi şırınga doldurun. "LOAD" için örnek bağlantı noktası düğmesini çevirin, tuning çözüm 450 ul enjekte, sonra "eklemesine" düğmesini çevirin. Veri Acquisit ve Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki iyon Ayarlar penceresinde, kitleler tarafından akan hangi izlemek için "Çalıştır" tuşuna basın. Sağ tarafta yüksek kütle ise, pencerenin sol tarafında, düşük değerli bir kütledir. Not: önceden argon gazı içinde ksenon izotopları (Şekil 3) bağlı TOF 9400-9800 bölgede sinyalleri olacaktır. Akort çözüm izotoplar Bu ekranda çizgiler (Şekil 4) gibi görünmeye başlayacaktır kadar bekleyin.

Yıkama solüsyonu ve su durulama sonra çeşitli izotopları için arka plan düzeyini gösteren Şekil 3. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF 9400-9800 çevresindeki bölgeye argon gazı xenon izotoplar karşılık gelir ve her zaman mevcut olmalıdır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Şekil 4. Kütle kalibrasyon sekme penceresi, DVS ayarlama çözüm çeşitli izotopları dikey çizgiler gösteren. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

4. Penceresi Okuma Başına Kütle (es) geri dönün ve sol üst köşede yeşil "Oynat" düğmesine basın. Adım 2.1 'de seçilen her izotop farklı bir renkli çizgi ile temsil edilir. Varsayılan x-ekseni sn, "Zaman" dır. Onlar sabit oluncaya kadar farklı izotopların düzeyleri izleyin.
5. Akım ayarlama. Veri Toplama Ayarları penceresinin Parametre sekmesinde, açılan menüden "Current" seçeneğini seçin. = 0, bitiş = 10, adım değeri = 0.5, yerleşme zamanı = 200 başlayalım ve "Kaydet" tuşuna basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) geri tıklayınız. X-ekseni şimdi "Güncel" dir. Not nerede izotopları zirve (Şekil 5), ve r sinyalleri ecord. Enstrüman Setup penceresinin DAC Kanallar Kurulumu sekmesi altında, "Mevcut" aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın "Gerçek akım değeri ayarlama", sonra "Kaydet".

Şekil 5. Akım ayar profili.

6. Makyaj gaz Tuning. Açılır menüsüne gidin "Make-up gaz." = 0.95, adım değeri = 0.05, yerleşme zamanı = 200 = 0.55, son başlayalım. Kaydetmek basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) dönün. X-ekseni şimdi "Make-up gaz" akış oranıdır. Kayıt burada izotopları tepe sinyaller. Sonuna "Gd155" sinyali (Şekil 6) hızlı artış dikkat edin. DAC Kanallar Kurulum sekmesine dönmek için "Make-up gaz" aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın "Gerçek akım değeri ayarlama", sonra "Kaydet".

ŞEKIL 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Şekil 6. Make-up gaz ayar profili.

7. Kaydedilmesi oranı izotop vs oksit istenen. Ayarlama çözüm ikinci bir 450 ul enjeksiyonu olun. Parametre sekmesinde, açılan menüden "Time" öğesini, süre = 200 yerleşmeden, = 0, bitiş = 10, adım değeri = 1 başlayalım. "Tasarruf" a basın. Penceresinde Okuma Başına Kütlesindeki "play" (es) Hit. Hatları (Şekil 7) stabilize sonra, Tm169 veya Tb159 (daha yüksek bir değer) için üst sol kutulara değeri okumak için imleci kullanımı ve ayrıca "Gd155" değeri (daha yüksek bir değer arasında <% 3). Bu değerler aynı zamanda ileride bir ayar dosyasına kaydedilebilir.

Şekil 7. Akım ve Make-up gaz optimize sonra ayar çözümü sinyal intensitesi ölçümü.

8. Sam temizlenmesiple döngü. DVS Yıkama Çözeltisi 500 ul ardından, örnek döngü MilliQ 3 mL su enjekte edilir. Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki "run" düğmesine basarak temizleme ilerleme izleyin. Çizgiler yoğunluğunu (Şekil 4) arka plan düzeyleri (Şekil 3) aşağı kadar MilliQ su ve monitör 3 ml uygulayın, sonra azalmaya başlayana kadar yıkayın.

3. Koşu Örnekleri

1. Toplama penceresini açın. Varsayılan ayarlar:-The-Fly Analizi = Do = Çift, Çift Sayım Kalibrasyon = Veri Analiz Sinyal. Gürültü Azaltma seçilir. İstenirse, bu herhangi bir değiştirilebilir. Dosya adını girin. Tüm dosyaları E :/ / diskinize GEREKIR.
2. Edinimi Gecikmelerin ayarlanması. Örnek döngü ve nebulizatör arasındaki boru uzunluğu nedeniyle yaklaşık 30 sn hücre olayları kaydederken bir gecikme olacaktır. Bu nedenle, toplam "Toplama gecikmesi" toplam ve "Dedektör styetenek gecikmesi ", en az 30 saniye olmalıdır. Detektör kararlılık gecikme en az 20 saniye olmalıdır.
3. Veri toplama süresinin ayarlanması. "Toplama zaman" size örnek çalıştırmak istediğiniz saniye sayısıdır. Tüm 450 mikrolitre numune döngü Dolum 600 sn tamamlamak için gerektirir. Bu 50-100 sn numune taşınmasını en aza indirmek için çalışma süresi sonuna eklenecek önerilmektedir.
4. Örnek yeniden süspanse. Makine içinde tuzların birikmesi en aza indirmek için, MilliQ su içinde son bir yeniden süspansiyon, ardından hücre boyama sonunda, MilliQ su içinde en azından iki yıkamadan yapılması önerilmektedir. MilliQ su hacmi pelet Eğer ile başladığı hücre ile tüm boyama işlemi sonrası iyileşme hücre sayısına bağlı olarak değişecektir hücre süspansiyonu kullanılır. Iyi bir başlangıç ​​yeri 10 ⁶ (başlangıç) hücre / ml 'dir. Tabanda sonra, agrega kaldırmak için bir hücre süzgecinden filtre.
5. Başlangıç ​​örnek çalıştırın. Geçerli örnek için yeni bir dosya adı girin. , "LOAD" örnek enjekte, Toplama penceresinde o vurdu "Çalıştır" "INJECT" geri dönmek için örnek döngü valfi açın.
6. Hücre olayları kaydediliyor. Hücreler her dikey izotop / işaretleyici kanalı (Şekil 8) işaretleri yatay koleksiyonları gibi anlık penceresinde temsil edilecek. Kitle sitometresinin 1.000 hücre / sn kayıt olurken, hücre olaylar arasında daha iyi çözünürlük, genellikle 300-500 hücre / sn elde edilir. Bu ~ 1 hücre / ekran tazeleme bir ortalama karşılık gelir. Hücre olay sayacını tırmanmaya başlamadan önce yaklaşık 30 saniye kadar sürebilir. Bu "On-the-fly" veri işleme nedeniyle, herhangi bir hücre olay bilgileri kaybolur.

Şekil 8. Örnek sırasında Kazanç penceresi üç ayrı hücre olaylar ile ilişkili öğelere karşılık gelen noktalar yatay satırları gösteren, çalışıyor.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

7. Hücre olayların Kalitesi. Her bir izotop kanal, aynı zamanda, hücre olay oranında çizgiler Herhangi bir arka plan dikkat edin. Kitle sitometresinin bir arka plan üzerinde sinyal belirli bir artış olarak "hücre olay", yani serbest metal veya ilişkisiz antikor "hücre olayı" sayısı değiştirebilir arka plan sinyali tanır. Ayrıca, çok yüksek bir konsantrasyonda hücrelere çalışan çifti olay daha fazla sayıda neden olabilir. Arkaplan ek yıkar veya daha hücre seyreltme ile azalmış olabilir. Çiftlerin artan çalışma zamanı pahasına, büyük hücreli seyreltme ile minimize edilebilir.
8. Örnek veri toplama tamamlanması. Toplama zamanı ulaşıldığında, veri toplama sona erecektir. Ile bir pop-up penceresi önce biraz gecikme olacak "Tamam" düğmesi belirir ve yine bu "On-the-fly" veri işleme kaynaklanmaktadır. Örnek satın alma aynı zamanda Premat durdurulabilirurely "Stop" düğmesine basarak. Bu durumda, zaten kayıtlı tüm hücre olaylar çıktı dosyalarına sayılır ve işlenecektir.
9. Her numune arasındaki MilliQ su en az 500 ul Enjeksiyon ayrıca numune taşınmasını en aza indirir.

4. Kullanım sonrası Temizleme Makinesi

1. Çözüm yıkayın. Son örneği çalıştırın ve su ile yıkanmalıdır örnek döngü örnek döngüye yıkama solüsyonu 450 ul enjekte edildikten sonra. Adım 2.8 olarak Veri Toplama Ayarlar penceresinde (Şekil 9) Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki serbest metal serbest izleyin. Serbest metal sinyali azalmaya başladığında, MilliQ 3 mL su ile yıkayın ve arka plan düzeyi elde edilinceye kadar izlenmesi.

DVS Yıkama solüsyonu ile post-run temizlik sırasında Şekil 9. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF bölgede 9800-11000 yılında dikey çizgiler makineden temizlendi antikor-etiket izotopları vardır. TOF 11500 çevresindeki dikey çizgiler iki Ir enterkalatörün izotopu karşılık gelir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

5. Makine Kapatma

1. Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, "Plazma durdur" seçeneğini seçin. Işlemi tamamlandığında, nebulizatör kaldırmak isteyen bir pop-up penceresi olacak. "Tamam" tuşuna basın. Kart Kafesini sekmesinde, ısıtıcıyı kapatın. Argon kaynağı vanasını kapatın.
2. Nebulizer Kaldırma. Dikkatle geriye çekerek sprey odasından nebulizatör çıkarın. Sökün numune tanıtım Adım 1.6 hortumu ve bir kenara koyun. Biraz gevşetmek için sökün makyaj gaz giriş bağlantısı, sonra nebulizatör çekin. Birlikte vidalı montaj Leaving l şansını azaltacaktırsiyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça osing.
3. Nebulizatör Temizleme. Adım 1.3 olarak şırınga ve tüp kullanarak% 5 citranox ile nebulizer iki port Backflush. Mağaza, sonraki kullanıma kadar% 5 citranox içinde kaplı.

Representative Results

Yukarıdaki protokolü takiben dört şeyi başarmak gerekir. İlk olarak, kitle sitometresi için yeterli ısınma süresi sağlayan optimal sinyal ve minimal oksit oluşumu için gerekli bir sıcak, kararlı plazma üretecek. MilliQ su ve DVS Yıkama solüsyonu (Şekil 9) ile kitle sitometresinin İkincisi, yeterli yıkama (Şekil 8) örnek toplama sırasında arka plan azaltmaya yardımcı, metal adsorpsiyon düzeyleri tüp ve makinenin diğer parçaları azaltmaya yardımcı olacaktır. Ayrıca makinede sıkışmış ve böylece örnek numune taşınmasını en aza indirerek alabilirsiniz herhangi hücrelerini kaldırmak yardımcı olacaktır. Oksit kütlesi M +16 azından arka azaltırken kitle sitometresi (Şekil 5-7) Üçüncü, oksit oluşumunu tamamen önlenemez ise, uygun ayarlama, istenen kütle M de optimize toplam sinyal yardımcı olacaktır. Şekil 10 de görüldüğü gibi, yanlış ayarlama (macenta) anlamlı olarak az oksit oluşumu arttıM +16 düzgün ayarlanmış örnek (koyu mavi) ile karşılaştırıldığında. Bu biraz M istenilen sinyalin azalan bir etkiye sahiptir ve önemli ölçüde M +16 az istenmeyen arka plan paraziti artmaktadır.

Nihayet, tamponlar ve nihayet MilliQ su numunesinin yeterli yıkama kabul edilebilir seviyelere metal / antikor arka sinyal azaltmak gerekir. MilliQ su yıkar ve yeniden süspanse zamanının birkaç saat boyunca sabit akım ayarları korumak için kritik öneme sahiptir. MilliQ su içinde örnek Uygun seyreltme bir günlük örnek olarak tespit edilmesi gerekmektedir. Ancak, ~ 10 ⁶ (başlangıç) hücre / ml sulandırma başlamak için iyi bir yerdir. Kümesinin birinci örnek bağlı olarak, müteakip örnekler için daha büyük veya daha küçük seyreltme yerleştirilebilir. Hız ihtiyacı (Şekil 8) dengelerken Uygun yıkama ve uygun seyreltme, minimal plan ve hücrelerin büyük çözünürlük sağlayacaktır.

Şekil 10. İstediğiniz sinyal ve çeşitli lantanit metaller arasındaki oksit oluşumunu farklılığa uygun ayarlama Etkisi. DVS Bilimler doğal bolluk La139, Pr141, Tb159, Tm169 ve Lu175 içeren polistiren boncuklar hücre toplama modunda çalıştırmak edildi. Boncuk ayrı numuneler belirtilen Makyaj gaz akış oranları (Şekil 6 ile karşılaştırın) çalıştırmak edildi. Veri kırık boncuk enkaz üzerinden yolluk dahil, Mac için FlowJo v9.4.9 kullanılarak analiz edildi. Düzgün ayarlanmış örnek 0.74 L / dk idi. Bu düşük akış hızlarında daha yüksek sinyal intensitesi ve yanlış ayarlanmış sinyal daha "M +16" oksit kitlelerin az sinyal ile "M" metal kütleler daha yüksek sinyal vardı. "M" kitle La139 ve Tm169 de A. Sinyal. La139 sinyal yoğunluğu Make-up gaz akış hızı ile daha Tm169 etkilendiğini unutmayın. "M +16" oksit kitle B. SinyaliES + sırasıyla La139 O16 ve Tm169 + O16 oksitler karşılık gelen 155 ve 185,. Gerçek bir "Gd155" ya da "Re185" boncuk halinde mevcut bulunmaktadır. "Gd155" kanal oksit sinyal La139 kolaylıkla okside olması nedeniyle, özellikle güçlüdür. Bu oksit birinin üst düzeyde biriyle karşılaşabilirsiniz bekleyebilirsiniz temsil ediyor. "M" ve Make-up gaz akış hızının bir fonksiyonu olarak "M +16" sinyal intensitesi C. Grafik. Açık simgeleri kitle "M +16" temsil ederken Dolgulu simgeler, kitle "M" temsil eder. Çizgilerin rengini ilgili kitle "M" karşılık gelir. La139 ve Pr141 çok daha kitlesel "M +16" oksit kitle "M" den mevcut olan bir noktaya ulaşan, Make-up gaz akış hızı etkilenir dikkat edin. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Son birkaç yıldır, floresans akış sitometri yüzey ekspresyonu açısından ve fonksiyonel testleri, hem tek hücre analizi için bir beygir yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar spektral örtüşme sorunları eşzamanlı belirteçlerin sayısını sınırladı. 12'den fazla eşzamanlı işaretleyiciler kullanılarak deneyler bildirilmiştir ederken, gerekli tazminat miktarı bu teknik zorlaştırmaktadır.

Bunun yerine florofor, kitle sitometri antikorları için etiket gibi metaller için şelat siteleri ile polimerler kullanan DVS Bilimler öncülüğünü. ^1-3 metallerin saflık ve ICP-MS kütle çözünürlüğü sayesinde, etkin bir "spektral örtüşme." Olduğunu Kullanılan elemanların biyolojik olarak en alakalı olmadığından, neden biraz arka plan da var "otoflöresans." Bu gerçekler, tek bir deney içinde 30'dan fazla eşzamanlı belirteçlerin kullanımına izin. Geniş bir dy da ^6,7 vartipik bir floresan deneyde daha ICP-MS sinyal namik aralığı.

Ancak, kitle sitometri sınırlamaları vardır. Bu yıkıcı bir tekniktir: hücrelerin ayrıştırılması ve daha sonraki denemeler için geri alınamaz. Kütle sitometrisi metallerin mevcudiyetinde bir katı gereksinim vardır: bir metal mevcut olmaması halinde, bir hücre tespit edilemez olacaktır. Bu, tüm hücreleri bakmadan herhangi bir antikor probları bağlama tespit edileceği gibi, doğru yüzde-of-üst istatistikleri sağlamak için metal şelat DNA enterkalatörleri kullanımı için birincil sebebidir. ^3,6-7 Nihayet, geçerli hücre iletim verimliliği Makinenin ~% 25 bir floresan akış sitometresi için>% 90 bir verim ile karşılaştırıldığında vardır. Bu nedenle, hücrelerin daha büyük bir başlangıç ​​numarasını sık özellikle nadir hücre popülasyonlarının için gereklidir. Ancak, bu genellikle tek bir kitle sitometresinin örnek genellikle birden fazla floresan örnekleri yerine gerçeği tarafından dengeli. Son olarak, maksimum hücre müktesebatition oranı ~ 1000 hücre / sn standart floresan akış sitometre daha yavaştır; optimum hızı sık sık yarısıdır. Bu nedenle, her örnek çalıştırmak için uzun sürer.

Çeşitli kağıtlar son hücre örneklerinin çeşitli boyama yayınlanmıştır. ^3,5-7 Bu makalenin amacı, çalışan örnekler için CyTOF ^TM kitle sitometresinin doğru kullanımı hakkında bilgi vermektir. % 5 citranox içinde olan su tutmanın ve depolama ile nebulizer Bakım böylece takunya olasılığını azaltarak, hücre artıkları ve metallerin birikmesi minimize edecektir. Optimum performans için makinenin Bakım iki bölümden oluşur. İlk olarak, en azından bir günlük bazda makinenin düzgün ayarlama (Cari, Make-up gaz) doğru ölçümü garantilemek yardımcı olur. Her bir numune arasında ve sonunda yıkama çözeltisi ile MilliQ su ile İkinci olarak, yeterli yıkama biriken organik ve inorganik pislik genel olarak arka plan ve taşınmasını en aza indirilmesine yardımcı olur kaldırmak için çalışırörnekleri arasında. Son olarak, numune hazırlama kalitesi veri toplama kalitesi üzerinde büyük bir etkisi vardır. Tampon ve nihayet MilliQ su Çoklu yıkar enterkalatörleri veya spesifik olmayan antikor bağlayıcı herhangi bir metal arka planı kaldırmak yardımcı olur. Hücre örneği Uygun seyreltme numune başına toplam çalışma süresi en aza indirerek cep olaylar arasındaki optimal çözünürlüğü dengelemeye yardımcı olacaktır. Uygun dilüsyon da nebulizatör bir tıkanmaya yol açan olasılığını en aza indirir.

Sık Karşılaşılan Sorunlar Giderme

1. Makine Geçtiğimiz start-up sırasında adım "RFG hazırlayın" almaz

Instrument Set-up penceresi Kart Kafesini sekmesi altında, RFG altında "Reset" tuşuna basın. Makineyi başlatmayı deneyin. Bu sorunu çözmezse, yazılımı kapatın yeniden, tekrar "Reset" tuşuna basın ve başlatma girişimi. Bu hala sorunu çözmezse, makinenin sol arka köşesinde RFG jeneratör kesici anahtarı kontrol edin. Takıldı ise,"Açık", hit "Reset" ile yeniden konumlandırmak ve başlatmayı deneyin. Bu hala sorunu çözmezse, DVS başvurun.

2. Çalışırken makineyi kapatır

1. Argon kaynağı kontrol edin. Makinesine ulaşmasını argon basıncı 40 psi civarında altına alırsa, yazılımı otomatik kapatma yürütür.
2. RFG 100W hatası aştı. Plazma için güç talebi 1300 dışına çıktığında oluşur + / - 100W pencere ve yazılımı otomatik kapatma yürütür. Bu genellikle püskürtücüden dengesiz sprey, özellikle büyük damlacıklar neden olur. Bu aşırı plazma korumak için daha fazla enerji gerektiren, plazma soğur. Şırınga pompası değişimi sırasında şırınga şırınga hortumu bağlamak için kullanılan aşırı güç nedeniyle bu durum oluşabilir. Bu plazma soğutma damlacıklarının geniş bir sprey neden olur. Bu durumda, sadece makineyi yeniden başlatın.

Bu aynı zamanda başlayacak büyük damlalar nedeniyle olabilirnebulizatör tıkanmasına başladığında oluştururlar. Bu hata yinelenirse, temizlik için nebulizatör kaldırırsanız, temiz bir nebülizatör yerleştirin ve yeniden başlatın.

Daha az sıklıkla, örnek loop ve nebulizatör arasındaki ince örnek hortumunun tıkanmasına neden olabilir. Bu boru nebulizatör kaldırılır sıvı anormal derecede düşük akış hızı ile teşhis edilebilir. Bu durumda, etkilenen boru ve taze boru ile yeniden inşa edilecek parçaları kaldırmak ve yeni bir nebülizatör parçaları ve boru kiti ile değiştirin.

3. Kütle kalibrasyon sekme penceresi (Şekil 3, 4, 9) izliyor görünür hücre örneği toplama (Şekil 8) sırasında hiçbir izotop çizgiler (veya hücre olaylar), ya da

1. Şırınga pompası kontrol edin. Bu genellikle şırınga pompası şırınga değişen sırasında "oyun" vurmak unutmadan nedeniyle oluşur. "Pause" yerine "dur", şırınga değişim sırasında isabet, bu da olabilir. "Pause" şırınga pompası hacim sayacı sıfırlamak değilVe ne olursa olsun sıvı kalıntılarının, 3.000 mL dağıtılan ses duracaktır. Nihayet, şırınga su tükenmiş olabilir.
2. Numune vanayı kontrol edin. Ise "Load" ile ilgili örnek yüklemek için emin olun ve sonra sadece örnek çalışması başlamadan önce "enjekte" geçmek.
3. Tüketilmiş ya da aşırı örneği sulandırın. Size örnek tüm çalıştırmak olabilir; (Adım 3.3) Toplama Zaman hesaplamaları kontrol edin. Alternatif olarak, seyreltme faktörü miscalculated olabilir, ve / veya numune işleme sırasında beklenenden daha fazla hücre kaybetti.
4. Nebulizatör Tıkalı. Bu genellikle bir RFG hata (Sayı 2b bakınız) öncesinde, ancak bir takunya notiecably bir kapatma neden öncesinde hücre iletim verimliliği azaltabilir.

Sorunlar 3c ve 3d de Eu içeren polistiren kalibrasyon boncuk örnek bir çalışan tarafından kontrol edilebilir. Bunlar yaklaşık 1 milyon / mL (iyi örnek almadan önce vorteks!) De temin edilmektedir. Bu nedenle, 450 mcL örnek döngü dolum ap verecekproximately 450,000 boncuk. CyTOF ^TM hücre iletim verimliliği makineye bağımlı, ancak yaklaşık% 15-30. Bu nedenle, 67,500-135,000 boncuk olaylar enjeksiyon beklenir. Aşağıdaki Numaraları tüp veya nebülizer bir takunya ile tutarlıdır.

Hücre / boncuk iletim verimliliği herhangi bir uzun vadeli eğilimleri dikkat, bazen sınamak için bir şeydir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity