Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

Summary

De nødvendige skridt til daglig tuning og optimering af udførelsen af ​​en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveforberedelse og strømningshastighed diskuteres

Abstract

I de senere år har den hurtige analyse af enkelte celler, der normalt blevet udført under anvendelse af flowcytometri og fluorescens-mærkede antistoffer. Imidlertid har spørgsmålet om spektral overlapning af fluorofor-emission begrænset antallet af samtidige prober. I modsætning hertil, den nye CyTOF masse cytometer af DVS Sciences par en flydende encellede introduktion system til et ICP-MS. ^En stedet for fluoroforer er chelaterende polymerer indeholdende højt-beriget metal isotoper koblet til antistoffer eller andre specifikke prober. ^2-5 På grund af metal renhed og masse opløsning af massen cytometeret, er der ingen "spektral overlapning" fra tilstødende isotoper, og derfor ikke behov for kompensation matricer. Desuden, på grund af anvendelsen af ​​lanthanidmetaller, der er ingen biologisk baggrund og derfor ikke ækvivalent autofluorescens. Med en masse vindue spænder atommasse 103-203, teoretisk op til 100 etiketter kunne skelnes samtidigt. For øjeblikket, Mere end 35 kanaler er tilgængelige ved hjælp af chelaterende reagenser fås fra DVS Sciences, giver en hidtil uset dissektion af den immunologiske profil af prøver. ^6-7

Ulemper masse cytometri omfatter strenge krav om et særskilt metal isotop pr probe (ikke svarer til fremad eller sidespredning), og at det er en destruktiv teknik (ingen mulighed for sortering recovery). Den aktuelle konfiguration af massen cytometer har også en celle transmission på kun ~ 25%, og det kræver et højere input antal celler.

Optimal daglig ydeevne masse cytometeret kræver flere trin. Det grundlæggende mål for optimering er at maksimere det målte signal intensiteten af ​​det ønskede metal-isotoper (M) og samtidig minimere dannelsen af ​​oxider (M +16), som vil reducere M signalintensitet og forstyrre enhver ønsket signal på M 16. Det første trin er at varme op maskinen, så en varm, stabilt ICP plasma er blevet etableret. For det andet skal indstillingerne for nuværende og make-up gasstrømningshastighed optimeres på daglig basis. Under prøveindsamling, er den maksimale celle begivenhed hastighedsbegrænset af detektor effektivitet og forarbejdning hastighed til 1000 celler / sekund. Men afhængigt af prøvens kvalitet, en langsommere celle hændelsesrate (300-500 celler / sekund) er sædvanligvis ønskeligt at gøre det muligt bedre opløsning mellem celler begivenheder og således maksimere intakte singletter løbet dubletter og nedbrudt materiale. Endelig passende rensning af maskinen ved slutningen af ​​dagen til at minimere baggrundssignal som følge af frit metal.

Protocol

Alle celleprøver for CyTOF skal fastsættes og permeabiliseres. Dette giver mulighed for bedre adgang for iridium-holdige DNA-interkalator, og forhindrer også cellelysis i MilliQ vand vask og resuspension trin umiddelbart før injektion i massen cytometeret.

1. Opstart af Mass Cytometer

1. Åbn det CyTOF softwareprogram. Vælg Instrument Setup. På kortbåsen fanen, skal du gå til det nederste højre hjørne og klik Heater "ON" knappen. Tænd ovnen på mindst 15 minutter før den ønskede tid til at give tilstrækkelig tid til spray kammer kappe til at nå 200 ° C.
2. Udskift hvide Norm-Ject 3 ml injektionssprøjte i sprøjtepumpen med en frisk sprøjte fyldt med MilliQ vand.
3. Rengøring forstøver. Backflush forstøveren ved at bruge sprøjten og slangen til at trække 5% citranox 2-3 gange gennem både den mindre flydende introduktion havn og større gas introduktion port. Gentag tilbageskylning med MilliQ vand to fjerne resterende citranox.
4. Kontroller at bekræfte, at lysene på frontpanelet af CyTOF er tændt som i figur 1.

Figur 1. CyTOF lyser inden idrifttagningen.

5. Åbne argongas tankventilen. Dette bør medføre, at "ARGON" lys på forsiden for at tænde.
6. Fastgør forstøver til make-up gasindløb. Skru make-up gas slangeforbindelsesindretning og fjern den sorte gummi o-ring og den hvide koniske plastik stykke. Bemærk den bredere "kno" på gassen indføres port stilk forstøveren. Sæt stikket på gas introduktion port. Anbring det sorte O-ring over enden af ​​gasåbning, og tvinger O-ringen forbi den bredere del af havnen stamceller. Placer den hvide koniske plastik stykke på toppen med den smalle ende påpegede, og skru den på make-up gas slange.
7. På RFG Controller fanen Instrument Setup vinduet, tryk på "Start Plasma". Da forstøveren allerede er indsat, skal du trykke på "OK". Softwaren vil tænde for køleren, starter strømmen af ​​gas, og antænde en plasma. Detektoren spænding rampe op. Der vil være en pop-up-vindue sige "Plasma opstartssekvens er afsluttet med succes", når du er færdig, tryk "OK". Nye lys skal være tændt i frontpanelet (figur 2 >).

Figur 2. CyTOF lyser efter plasma antændt og opstart succesfuldt afsluttet.

9. Aktivering af sprøjtepumpe. I øverste højre hjørne, skal du trykke på den grønne "play"-knappen for at starte sprøjtepumpen og begynde strømmende væske gennem slangen og sprøjte ud af forstøveren. Standardindstillingerne sprøjte indstillinger er for 3 ml vand. For at prøve, der skal strømmer gennem prøvesløjfe, skal sprøjtepumpen periodisk ændres, når den løber ud af vandet. Øverst på skærmen er der en tælling hvor meget væske er strømmet ud af sprøjtepumpen. Sprøjtepumpen stopper, når denne tæller når "3,000" eller stemplet rammer enden af ​​sprøjten. Ved påfyldning af sprøjten, skal du trykke på "stop" i stedet for den blå "pause"-knappen for at nulstille tælleren.

e "> 2. Daily Kalibrering af Mass Cytometer

1. Massen cytometer skal cirka 20 min for at opnå en varm, stabil plasma før kalibrering. Formålet med tuning trin er at maksimere det ønskede signal af Tm169 eller Tb159 samtidig med at "Gd155" (oxid, La139 + O16) signal under 3% af højere værdi. Klik Overtagelsen knappen Indstillinger for at åbne Data Acquisition vinduet Indstillinger. I Analytter fanen det periodiske system for at åbne isotop juryen. Vælg isotoper i DVS Sciences tuning løsning, der står i manualen, og klik derefter på "gem".
2. Klik på Isotoper Per Reading knappen for at åbne Masse (r) Per Reading vindue. Vælg "Bælgsæd Count", og skalere y-aksen ved at indtaste et nyt nummer og trykke på "enter".
3. Fyld en grøn 1 ml Norm-Ject sprøjte med tuning løsning. Drej prøveporten vælgeren til "belastning", injiceres 450 pi tuning løsning, så drej vælgeren på "injektion". I Mass Kalibrering fanen Data Acquisit ion vinduet Indstillinger, tryk på "Kør" for at overvåge, hvilke masser flyder forbi. Den venstre side af vinduet er lavere masse, mens den højre side er højere masse. Bemærk: allerede vil være signaler i TOF 9400-9800 region på grund af xenon isotoper i argongas (figur 3). Vent tuning opløsning isotoper begynder at vise sig som striber i dette display (Figur 4).

Figur 3. Mass kalibrering fanebladvinduet, der viser baggrundsniveauer for forskellige isotoper efter vask og vand skyl. Regionen omkring TOF 9400-9800 svarer til xenon isotoper i argon gas, og bør altid være til stede. Klik her for at se større figur .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Figur 4. Mass kalibrering fanebladvinduet, der viser lodrette striber for forskellige isotoper i DVS tuning løsning. Klik her for at se større figur .

4. Gå tilbage til masse (r) Per Reading vinduet og tryk på den grønne "Play" knappen i øverste venstre hjørne. Hver isotop valgt i trin 2,1 er repræsenteret af en anden farvet streg. Som standard x-aksen er "Tid", i sek. Overvåge niveauerne af de forskellige isotoper, indtil de er stabil.
5. Tuning af strømmen. På Parameter fanen Data Acquisition vinduet Indstillinger skal du vælge "Current" fra drop-down menuen. Lad start = 0, finish = 10, løntrin værdi = 0,5, indsvingningstid = 200, og tryk på "Gem". Klik tilbage på masse (r) Per Reading vindue og ramte play. X-aksen er nu "Current". Bemærk, hvor signalerne af isotoper peak (fig. 5), og r Indspil. Under DAC Channels fanen Opsætning af instrumentet Setup vinduet, rul ned til "Current" og indtaste den nye værdi. Tryk på "Set faktiske aktuelle værdi", og derefter "gem".

Figur 5. Current tuning profil.

6. Tuning af make-up gas. Skift drop-down menu til at "Make-up gas." Lad start = 0,55, ende = 0,95, trin værdi = 0,05, settling tid = 200. Tryk gemme. Retur til masse (r) Per Reading vindue og ramte play. X-aksen er nu "Make-up gas" flow rate. Optag hvor signalerne af isotoperne peak. Observere den hurtige stigning af "Gd155" signal nær enden (figur 6). Vend tilbage til DAC kanaler fanen Opsætning, rul ned til "Make-up gas", og indtast den nye værdi. Tryk på "Set faktiske aktuelle værdi", og derefter "gem".

igur 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figur 6. Make-up gas tuning profil.

7. Optagelse forholdet ønskede isotop vs oxid. Lav en anden 450 pi injektion af tuning opløsning. På Parameter fanen "Time" vælges fra drop-down menu, lad start = 0, ende = 10, step value = 1, settling tid = 200. Tryk på "gem". Hit "play" i masse (r) Per Reading vindue. Efter linjerne har stabiliseret sig (fig. 7), skal du bruge markøren til at læse værdien i den øverste venstre bokse til Tm169 eller Tb159 (højere værdi) og også "Gd155" værdi (<3% af den højeste værdi). Disse værdier kan også gemmes i en tuning fil til senere brug.

Figur 7. Måling af tuning løsning signalintensiteter efter optimering Nuværende og Make-up gas.

8. Rengøring af samPLE loop. Injicere 3 ml MilliQ vand gennem prøvesløjfe, efterfulgt af 500 pi af DVS skylleopløsning. Overvåge udviklingen af ​​rengøringen ved at trykke på "run" i Mass Calibration fanen. Vask indtil intensiteten af striber (figur 4) begynder at falde, så følge med 3 ml MilliQ vand og overvåger frem ned til baggrundsniveauet (figur 3).

3. Kørsel af prøver

1. Åbn Acquisition vinduet. Standardindstillinger: Gør Analysis = On-The-Fly, Signal til at analysere = Dual, Dual Count Calibration = Data. Støjreduktion er valgt. Enhver af disse kan ændres om ønsket. Indtast filnavnet. Alle filer skal gemmes til E :/ / drev.
2. Indstilling køb forsinkelser. Der vil være en mindre forsinkelse i registrering celle arrangementer af omkring 30 sekunder på grund af længden af ​​røret mellem prøvesløjfe og forstøveren. Derfor er summen af ​​"Erhvervelse forsinkelse" og "Detector stevne forsinkelse "bør være mindst 30 sek. Detektor stabilitet forsinkelse skal være mindst 20 sek.
3. Indstilling dataindsamling tid. "Erhvervelse tid" er det antal sekunder, du ønsker at køre din prøve. Fylder hele 450 ul prøve loop ville kræve 600 sek at fuldføre. Det foreslås, at 50-100 sek sættes til slutningen af ​​kørslen tid for at minimere prøve prolongation.
4. Opblanding af prøven. For at minimere ophobning af salte i maskinen, foreslås det, at mindst to vaske i MilliQ vand udføres ved slutningen af ​​cellefarvning, efterfulgt af en endelig resuspendering i MilliQ vand. Volumenet af MilliQ vand anvendt til at resuspendere cellepelleten vil variere afhængigt af antallet af celler man startede med, og celleindvinding efter at hele farvningsprocedure. Et godt sted at begynde er 10 ⁶ (start) celler / ml. Efter resuspension filtreres gennem en celle si til fjernelse af aggregater.
5. Prøvens oprindelige køres. Indtast et nyt filnavn for den aktuelle prøve. Skift prøvesløjfe ventil til "LOAD", indsprøjtning af prøve, skal du skifte tilbage til "injektion", så hit "Run" i Acquisition vinduet.
6. Registrering celle begivenheder. Celler vil være repræsenteret i snapshot vinduet som horisontale samlinger af mærker i hver lodret isotop / markør kanal (figur 8). Mens massen cytometeret kan registrere 1.000 celler / sek, er bedre opløsning mellem celle begivenheder normalt opnås ved 300-500 celler / sek. Det svarer til et gennemsnit på ~ 1 celle / skærmens opdateringshastighed. Det kan tage op til 30 sek før cellen eventtælleren begynder at klatre. Dette skyldes "On-the-fly" databehandling; ingen celle begivenhed oplysninger går tabt.

Figur 8. Acquisition vindue under prøven kører, der viser vandrette rækker af pletter svarer til de elementer, der er forbundet med tre separate celle events.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

7. Kvaliteten af ​​celle-begivenheder. Mærke nogen baggrund striber i hver isotop kanal, samt cellen begivenhed sats. Massen cytometer genkender en "celle begivenhed" som en vis stigning i signal over baggrund, så baggrundssignal fra frit metal eller ubundet antistof kan ændre "cell begivenhed" tæller. Yderligere kan løbe celler ved en for høj koncentration forårsager et øget antal dublet hændelser. Baggrund kan formindskes ved yderligere vaske eller større celle fortynding. Dubletter kan minimeres ved større celle fortynding på bekostning af forøget driftstid.
8. Efterbehandling prøve datafangst. Når Overtagelsen tid er nået, vil dataindsamlingen færdig. Der vil være en smule forsinkelse, før et pop-up-vindue med en "OK"-knappen vises, igen, dette skyldes at "On-the-Fly" databehandling. Prøveindsamling kan også stoppes Prematurely ved at trykke på "Stop"-knappen. I dette tilfælde vil alle celle begivenhederne allerede registrerede tælles og forarbejdes til uddatafiler.
9. Indsprøjtning af mindst 500 ul MilliQ vand mellem hver prøve også med til at minimere mellem prøverne.

4. Rengøring af maskinen efter brug

1. Vask løsning. Efter den sidste prøve køres og prøvesløjfe skylles med vand, injiceres 450 pi af vaskeopløsning i prøvesløjfe. Overvåg frigivelse af fri metal i Mass Kalibrering fanen Data Acquisition vinduet Indstillinger som i Trin 2,8 (figur 9). Når det frie metal-signalet begynder at falde, skylles med 3 ml MilliQ vand og overvåge indtil baggrundsniveauet opnås.

Figur 9. Mass kalibrering fanebladvinduet, under post-run rengøring med DVS Wash løsning. De lodrette striber i TOF området 9800-11000, er antistof-label isotoper renses ud af maskinen. De lodrette striber omkring TOF 11.500 svarer til de to IR interkalator isotoper. Klik her for at se større figur .

5. Nedlukning af maskinen

1. I RFG Controller fanen Instrument Setup vinduet, vælg "Stop Plasma". Når proceduren er afsluttet, vil der være et pop-up vindue, hvor du skal fjerne forstøveren. Tryk på "OK". I kortbåsen fanen, skal du slukke for ovnen. Luk ventilen på argon forsyning.
2. Fjernelse af forstøver. Fjern nebulizer fra sprøjtekammer ved forsigtigt at trække bagud. Skru prøveintroduktion slangen fra Step 1,6 og læg til side. Skru make-up gas introduktion tilslutning til at løsne lidt, og træk derefter forstøveren slukket. Forlader fitting skruet sammen, vil mindske risikoen for, losing den sorte gummi o-ring og hvid konisk plastik stykke.
3. Rengøring forstøver. Backflush begge havne i forstøveren med 5% citranox hjælp af sprøjten og slangen som i trin 1,3. Store, er omfattet, i 5% citranox indtil næste brug.

Representative Results

Efter ovennævnte protokol skal udrette fire ting. For det første vil tillade tilstrækkelig opvarmningstid for massen cytometer frembringe en varm, stabilt plasma nødvendige for optimal signal og minimal oxiddannelse. For det andet, passende vask af massen cytometeret med MilliQ vand og DVS vaskeopløsningen (figur 9) vil bidrage til at mindske niveauerne af metal adsorption til røret og andre dele af maskinen, hvilket hjælper til at reducere baggrunden under prøveindsamling (figur 8). Det vil også hjælpe med at fjerne eventuelle celler, der kan sidde fast i maskinen og derved minimere overførsel fra prøve til prøve. For det tredje, mens oxiddannelse ikke helt kan undgås, korrekt indstilling af massen cytometer (fig. 5-7) der kan forbedre totale signal ved den ønskede masse M, samtidig minimere baggrund på oxid masse M +16. Som det ses i figur 10, forkert tuning (magenta) signifikant forøget oxiddannelse vedM 16 sammenlignet med den korrekt afstemt prøve (mørkeblå). Dette har den virkning, let faldende ønskede signal ved M, og en væsentlig forøgelse af uønsket baggrundsinterferens på M 16.

Endelig bør passende vask af prøven i puffere og endelig i MilliQ vand reducere metal / antistof baggrundssignal til acceptable niveauer. De MilliQ vand vask og resuspension er kritiske for at opretholde stabile Aktuelle indstillinger under hele flere timers runtime. Korrekt fortynding af prøven i MilliQ vand skal bestemmes på daglig stikprøvekontrol. Men fortynde til ~ 10 ⁶ (start) celler / ml er et godt sted at starte. Baseret på den første prøve i et sæt, kan større eller mindre fortynding for efterfølgende prøver imødekommes. Korrekt vask og korrekt fortynding sikrer minimal baggrund og den største opløsning af celler, samtidig med at afbalancere behovet for hastighed (figur 8).

Fig. 10. Virkning af korrekt indstilling af ønsket signal, og forskellen i oxiddannelse mellem forskellige lanthanidmetaller. Polystyrenperler indeholdende naturligt overflod La139, Pr141, Tb159, Tm169, og Lu175 fra DVS Sciences blev kørt i celle køb mode. Særskilte prøver af perlerne blev kørt ved de angivne Make-up gasstrømningshastigheder (sammenlign med figur 6). Dataene blev analyseret ved hjælp af FlowJo v9.4.9 til Mac, herunder gating ud vragrester fra knuste perler. Den korrekt afstemt prøve var på 0,74 L / min. Dette havde højere signalintensiteter end ved lavere strømningshastigheder og højere signal ved "M" metal masser med mindre signal ved de "M 16" oxid masser end forkert indstillet signal. A. Signal ved "M" masse La139 og Tm169. Bemærk, at La139 signalintensitet påvirkes mere end Tm169 med Make-up gasstrømningshastighed. B. Signal på "M 16" oxid massees 155 og 185, svarende til La139 + Ø16 og Tm169 + Ø16 oxider hhv. Der er ikke nogen egentlig "Gd155" eller "Re185" stede i perlerne. Oxidet signal i "Gd155"-kanalen er særlig stærk, på grund af La139 blive let oxideret. Dette er en af de højeste niveauer af oxid man kan forvente at støde på. C. Graf over "M" og "M 16" signalintensiteter som en funktion af Make-up gasstrømningshastighed. Fyldte ikoner repræsenterer masse "M", mens åbne ikoner repræsenterer masse "M 16". Farven af ​​linierne svarer til de respektive mas "M". Bemærk, at La139 og Pr141 stærkt påvirket af Make-up gasstrømningshastighed og kan endda nå et punkt, hvor mere masse "M 16" oxid er til stede end masse "M". Klik her for at se større figur .

Discussion

I de sidste årtier er fluorescens-flow-cytometri er en arbejdshest fremgangsmåde til analyse af enkelte celler, både med hensyn til overfladeekspression og i funktionelle assays. Imidlertid har spørgsmål vedrørende spektral overlapning af de fluorescerende farvestoffer begrænset antallet af samtidige markører. Mens forsøg med mere end 12 samtidige markører er blevet rapporteret, at kompensationsbeløbet nødvendig gør dette teknisk vanskeligt.

I stedet for fluoroforer, masse-cytometri udviklet af DVS Sciences anvender polymerer med chelaterende sites for metaller som mærker for antistoffer. ^1-3 På grund af renheden af metallerne og massen løsning af ICP-MS er der reelt ingen "spektral overlapning." Da de fleste af de anvendte elementer ikke er biologisk relevant, er der også lidt baggrund at forårsage "autofluoresence." Disse kendsgerninger tillader brugen af mere end 30 samtidige markører i et enkelt eksperiment. ^6,7 Der er også en større dymisk område i signal i ICP-MS end i en typisk fluorescens eksperiment.

Imidlertid masse cytometri har sine begrænsninger. Det er en destruktiv teknik: celler ikke kan inddrives til sortering og yderligere eksperimenter. Massen cytometer har et strengt krav om tilstedeværelse af metaller: hvis et metal ikke er til stede, vil en celle ikke blive detekteret. Dette er den primære årsag til anvendelse af metalchelaterende DNA-interkalatorer at sikre korrekte procent-of-forælder statistikker, som alle celler vil blive detekteret, uanset om helst antistof prober binder. ^3,6-7 endelig den aktuelle celle transmissionseffektivitet af maskinen er ~ 25%, sammenlignet med en effektivitet på> 90% for en fluorescerende flowcytometer. Derfor er en større udgangsark antal celler ofte nødvendig, især for sjældne cellepopulationer. Dette er dog sædvanligvis opvejet af det faktum, at en enkelt masse cytometer prøve ofte erstatter flere fluorescerende prøver. Endelig den maksimale cell gældendeition er meget langsommere end standard fluorescerende flowcytometre på ~ 1000 celler / sek, og den optimale sats er ofte halvdelen. Derfor er hver prøve tager længere tid at køre.

Flere papirer er for nylig blevet offentliggjort på farvning af forskellige typer af celleprøver. ^3,5-7 Formålet med denne artikel er at give oplysninger om den korrekte brug af en CyTOF ^TM masse cytometer til at køre prøver. Vedligeholdelse af forstøveren ved tilbageskylning med og opbevaring i 5% citranox vil minimeret opbygning af cellerester og metaller, hvilket reducerer sandsynligheden for tilstopninger. Vedligeholdelse af maskinen for en optimal ydeevne har to dele. Først den korrekte indstilling (Current, Make-up gas) i maskinen på mindst daglig basis hjælper med at sikre korrekt måling. For det andet, passende vaske med MilliQ vand mellem hver prøve og med vaskeopløsning ved udgangen af ​​løber til fjernelse bebyggede organisk og uorganisk affald vil bidrage til at minimere baggrund i almindelighed og fremførselmellem prøver. Endelig er kvaliteten af ​​prøvefremstilling har en stor indflydelse på kvaliteten af ​​dataindsamlingen. Multiple vaske i puffer og endelig i MilliQ vand hjælp fjerne metal-baggrund fra interkalatorer og ikke-specifik antistofbinding. Korrekt fortynding af celleprøven vil hjælpe balance optimal opløsning mellem celle begivenheder og samtidig minimere den samlede køretid per prøve. Korrekt fortynding hjælper også minimere sandsynligheden for at forårsage en blokering i forstøveren.

Fejlfinding Almindelige problemer

1. Maskinen ikke komme forbi "RFG Forbered" trin under opstart

Under kortbåsen fanen Instrument Set-up-vindue, skal du trykke "Reset" under RFG. Forsøg på at starte maskinen. Hvis dette ikke løser problemet, skal du lukke softwaren, genåbne, tryk "Reset" igen, og forsøg at starte. Hvis dette stadig ikke løser problemet, skal du kontrollere RFG generator breaker kontakten på venstre bageste hjørne af maskinen. Hvis udløst,repositionere til "On", hit "Reset", og prøv at starte. Hvis dette stadig ikke løser problemet, skal du kontakte DVS.

2. Maskinen lukker ned, mens den kører

1. Kontrollér argon forsyning. Hvis argontryk når maskinen kommer under omkring 40 psi, software udfører en automatisk nedlukning.
2. RFG oversteg 100W fejl. Dette sker, når strømmen efterspørgsel efter plasma går udenfor 1300 + / - 100W vindue, og softwaren udfører en automatisk nedlukning. Dette skyldes normalt uensartet spray fra forstøveren, især store dråber. Dette alt for afkøler plasma, hvilket kræver mere energi for at opnå plasma. Dette kan ske på grund af for stor kraft anvendes til at fastgøre sprøjten slangen til sprøjten under ændring af sprøjtepumpen. Dette forårsager et stort spray af smådråber, afkøle plasmaet. Hvis dette er tilfældet, blot genstarte maskinen.

Dette kan også ske på grund af store dråber, som begynder atdannes, når forstøveren begynder at tilstoppe. Hvis fejlen opstår igen, skal du fjerne forstøver til rengøring, skal du indsætte en ren forstøver og genstart.

Meget mindre hyppigt, kan den tynde prøve slangen mellem prøvesløjfe og forstøveren tilstoppes. Dette kan diagnosticeres ved unormalt lave strømningshastighed af væske, når røret fjernes fra forstøveren. Hvis dette er tilfældet, skal du fjerne det ramte slanger og fittings til at blive genopbygget med friske rør, og erstatte med en ny forstøver fittings og slanger kit.

3. Ingen isotop striber (eller celle hændelser) synlig under celleprøve køb (figur 8), eller mens du ser Mass kalibrering fanebladvinduet (figur 3, 4 og 9)

1. Tjek sprøjtepumpen. Dette sker ofte på grund af at glemme at ramme "play" under forandring af sprøjtepumpen sprøjten. Det kan også ske, hvis "pause" i stedet for "stop", rammes under sprøjten forandring. "Pause" ikke nulstille lydstyrken tælleren på sprøjtepumpen, Og det vil stoppe på 3,000 ml dispenseret volumen, uanset om flydende rester. Endelig kan sprøjten er løbet tør for vand.
2. Tjek prøve ventil. Sørg for at indlæse prøve mens "Load", og derefter skifte til "Inject" lige før prøven løb.
3. Forarmet eller overdrevent fortyndet prøve. Du har måske kørt alle dine prøve, tjek Acquisition Time beregninger (se trin 3.3). Alternativt kan du have fejlberegnet fortyndingsfaktoren, og / eller tabt flere celler end forventet i løbet af prøve behandling.
4. Tilstoppet forstøver. Dette er normalt efter en RFG fejl (se Issue 2b), men en tilstopning kan notiecably reducere celle transmissionseffektivitet før forårsage en nedlukning.

Spørgsmål 3c og 3d kan også kontrolleres ved at køre en prøve af EU-holdige polystyren kalibrering perler. De leveres på omkring 1 mio / ml (vortex godt før tegning prøve!). Derfor ville fylde 450 uL prøvesløjfe opnåelse apkring 450.000 perler. Den CyTOF ^TM celle transmission effektivitet er maskinafhængig, men ca 15-30%. Derfor vil 67,500-135,000 perlehændelser kan forventes fra denne injektion. Tallene under, der er i overensstemmelse med en tilstopning i slangen eller forstøver.

Cellen / perle transmission effektivitet er noget at teste lejlighedsvis at notere eventuelle langsigtede tendenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity