Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

Summary

De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden besproken

Abstract

De laatste jaren heeft een snelle analyse van afzonderlijke cellen die zijn uitgevoerd met behulp van flowcytometrie en fluorescent-gemerkte antilichamen. Echter, het probleem van de spectrale overlap van fluorofoor-uitstoot beperkt het aantal gelijktijdige sondes. In tegenstelling tot de nieuwe CyTOF massa cytometer door DVS Sciences paren een vloeistof eencellige invoersysteem een ICP-MS. ^Een plaats fluoroforen zijn chelaatvormende polymeren die hoogverrijkt metaalisotopen gekoppeld aan antilichamen of andere specifieke probes. ^2-5 Door de metalen zuiverheid en massa resolutie van de massa cytometer, er is geen "spectrale overlap" van naburige isotopen, en daarom geen noodzaak voor compensatie matrices. Bovendien, door het gebruik van lanthanide metalen er geen biologische achtergrond en dus geen equivalent van autofluorescentie. Met een massa venster verspreid over atoommassa 103 tot 203, in theorie tot 100 etiketten kunnen tegelijkertijd worden onderscheiden. Tegenwoordig, Meer dan 35 kanalen beschikbaar via de chelerende reagentia die beschikbaar zijn vanaf DVS Sciences, die een ongekend dissectie van de immunologische profiel van monsters. ^Zes-zeven

Nadelen massa cytometrie onder de strenge eis van een afzonderlijke metalen isotoop per probe (geen equivalent van voorwaartse of zijwaartse verstrooiing), en het feit dat het een destructieve techniek (geen mogelijkheid sorteren recovery). De huidige configuratie van de massa cytometer heeft ook een cel overdrachtssnelheid van slechts ~ 25%, waardoor het noodzakelijk wordt een hogere input aantal cellen.

Optimale dagelijkse prestaties van de massa cytometer vereist een aantal stappen. Het hoofddoel van de optimalisatie is aan de gemeten signaalsterkte van het gewenste metaal isotopen (M) te maximaliseren, terwijl het minimaliseren van de vorming van oxyden (M +16) die de M signaalintensiteit verlagen en interfereren met elke gewenste signaal M +16. De eerste stap is om op te warmen de machine, zodat een warme, stabiele ICP plasma is vastgesteld. Ten tweede moet de voor huidige en make-up gasstroom worden geoptimaliseerd op een dagelijkse basis. Tijdens het verzamelen, wordt het maximale cell incidentie beperkt door detector efficiency en verwerkingssnelheid tot 1000 cellen / seconde. Afhankelijk van het monster kwaliteit, een lagere cel incidentie (300-500 cellen / seconde) is gewoonlijk wenselijk om een ​​betere resolutie tussen cellen gebeurtenissen en dus intact singlets maximaliseren over wambuizen en vuil. Tenslotte adequate reiniging van de machine aan het eind van de dag minimaliseert achtergrondsignaal door vrij metaal.

Protocol

Alle celmonsters de CyTOF moet worden vastgesteld en gepermeabiliseerd. Dit maakt een grotere invoer van het iridium-bevattende DNA intercalator, en voorkomt ook cellyse tijdens de MilliQ water wassen en resuspensie stappen vlak voor het injecteren in de massa cytometer.

1. Start-up van de Mis Cytometer

1. Open het CyTOF softwareprogramma. Selecteer Instrument-setup. Op de kaart Cage tabblad, ga naar de rechter benedenhoek en klik Heater "ON" knop te drukken. Zet de verwarming minstens 15 min. voor gewenste tijd voldoende tijd voor de sproeikamer laat mantel 200 ° C. bereikt
2. Vervang de witte Norm-Ject 3 ml spuit in de spuit pomp met een frisse injectiespuit gevuld met MilliQ water.
3. Reinigen verstuiver. Backflush de vernevelaar met behulp van de spuit en slang aan 5% citranox 2-3 keer trekken door zowel de kleinere vloeibare introductie haven en de grotere inbrengen van gas-poort. Herhaal terugspoelen met MilliQ water to verwijderen resterende citranox.
4. Controleer bevestigen dat de lampjes op het voorpaneel van de CyTOF branden als in figuur 1.

Figuur 1. CyTOF lampjes vóór de inbedrijfstelling.

5. Open argon gas tank klep. Dit moet ertoe leiden dat de "argon" lampje op de voorkant in te schakelen.
6. Bevestig de vernevelaar om make-up gasinlaat. Schroef de make-up gas slang connector en verwijder de zwarte rubberen o-ring en de witte conische plastic stuk. Let op het bredere "knokkel" op het gas inlaatpoort steel van de vernevelaar. Plaats de connector op het gas introductie poort. Plaats de zwarte o-ring over het uiteinde van de gaspoort en dwingen de o-ring langs het brede deel van de haven stam. Plaats de witte conische plastic stuk op de top met de smalle kant op gewezen, en schroef op de make-up gas buizen.
7. Op het RFG Controller tab van het Instrument-setup venster, drukt u op "Start Plasma". Omdat de vernevelaar al is geplaatst, drukt u op "OK". De software zal draaien op de koelmachine, start de gasstroom, en ontsteken een plasma. De detector spanning zal opvoeren. Er zal een pop-up venster te zeggen "Plasma opstartprocedure met succes is voltooid" als u klaar zijn, druk op "OK". Nieuwe lampen moeten op in het voorpaneel (figuur 2 >).

Figuur 2. CyTOF lampjes na plasma ontstoken en start-up met succes afgerond.

9. Het inschakelen van injectiepomp. In de rechter bovenhoek, druk op de groene "play"-knop om de spuit pomp te starten en stromende vloeistof door de slang en spuiten van de vernevelaar te beginnen. De standaard spuit instellingen zijn voor 3 ml water. Om monster dat stroomt door de sample loop, moet de injectiespuit pomp regelmatig worden vervangen wanneer het water opraakt. Bovenaan het scherm, er een teller aangeeft hoeveel vloeistof stroomde uit de spuitpomp. De spuitpomp stopt wanneer de teller "3,000" of de zuiger bereikt raakt het uiteinde van de spuit. Wanneer opnieuw vullen van de spuit, moet je raken "stop" in plaats van de blauwe "pauze" knop om de teller te resetten.

e "> 2. Dagelijkse kalibratie van de Mis Cytometer

1. De massa cytometer heeft ongeveer 20 minuten een warme, stabiele plasma bereiken voor kalibratie. Het doel van de tuning stappen is om het gewenste signaal van Tm169 of Tb159 maximaliseren terwijl "Gd155" (oxide; La139 + O16) signaal onder de 3% van de hogere waarde. Klik op de Overname knop Instellingen om de data-acquisitie venster Instellingen te openen. In de analyten tabblad, klik op de periodieke tabel van de isotoop jury te openen. Selecteer de isotopen in de DVS Sciences tuning oplossing vermeld in de handleiding en klik vervolgens op "opslaan".
2. Klik op de Isotopen Per Lezen toets om de Massa ('s) te openen Per Reading venster. Selecteer "Peulvruchten Count", en herschalen de y-as door het invoeren van een nieuw nummer en druk op "enter".
3. Vul een groen 1 ml Norm-Ject spuit met tuning oplossing. Draai het monster poort keuzeschakelaar op "LOAD", 450 ul van tuning oplossing te injecteren, zet de schakelaar op 'injecteren'. In de Mis Kalibratie tabblad van het Data Acquisit ion venster Instellingen, druk op "Run" om te controleren welke massa's stromen door. De linkerkant van het venster is lager massa, terwijl de rechterkant is een hogere massa. Opmerking: er al signalen in de TOF 9400-9800 regio door xenon isotopen in het argongas (figuur 3). Wacht tot tuning oplossing isotopen start verschijnen als strepen in deze display (Figuur 4).

Figuur 3. Mass kalibratie tabblad venster, met achtergrondniveaus voor verschillende isotopen na het wassen oplossing en water afspoelen. De regio rond TOF 9400-9800 komt overeen met xenon isotopen in de argon gas, en moet altijd aanwezig zijn. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Figuur 4. Mass kalibratie tab-venster, met verticale strepen van verschillende isotopen in DVS tuning oplossing. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

4. Ga terug naar de Massa ('s) per Lezen venster en druk op de groene "Play" knop in de linker bovenhoek. Elke isotoop geselecteerd in stap 2.1 wordt vertegenwoordigd door een verschillend gekleurde lijn. De standaard x-as is "Time" in sec. Bewaken van de niveaus van de verschillende isotopen tot ze stabiel.
5. Afstemmen van de stroom. Op het tabblad Parameter van de Data Acquisition venster Instellingen, selecteer "Current" in het drop-down menu. Laten start = 0, afwerking = 10, stap value = 0,5, de afwikkeling van de tijd = 200, en druk op "opslaan". Klik weer op de Massa ('s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu "Current". Opmerking waar de signalen van de isotopen piek (figuur 5), en r ECORD. Onder de DAC-kanalen tab Setup van het Instrument-setup venster, scroll naar beneden naar "Huidige" en voer deze nieuwe waarde. Druk op de "werkelijke huidige waarde Set" en vervolgens op "opslaan".

Figuur 5. Huidige tuning profiel.

6. Afstemmen van de make-up gas. Wijzig drop-down menu op "Make-up gas." Laten start = 0,55, einde = 0,95, stap value = 0,05, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op op te slaan. Terug naar de Massa ('s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu "Make-up gas" debiet. Noteer waar de signalen van de isotopen piek. Let op de snelle toename van de "Gd155" signaal aan het einde (figuur 6). Keer terug naar de DAC-kanalen tabblad, scroll naar beneden naar "Make-up gas", en voer deze nieuwe waarde. Druk op de "werkelijke huidige waarde Set" en vervolgens op "opslaan".

igure 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figuur 6. Make-up gas tuning profiel.

7. Opnemen verhouding gewenste isotoop vs oxide. Maak een tweede 450 ul injectie van tuning oplossing. Op het tabblad Parameter, "tijd" te selecteren uit het drop-down menu, laat start = 0, einde = 10, stap value = 1, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op "redden." Hit "play" in Massa ('s) per Lezen venster. Nadat de lijnen zijn gestabiliseerd (Figuur 7), gebruikt u de cursor naar de waarde te lezen in de linkerbovenhoek dozen voor Tm169 of Tb159 (hogere waarde) en ook de "Gd155" waarde (<3% van de hoogste waarde). Deze waarden kunnen ook worden opgeslagen in een tuning-bestand voor toekomstige referentie.

Figuur 7. Meting van tuning oplossing signaalintensiteiten na het optimaliseren van huidige en Make-up gas.

8. Reiniging van samPLE lus. Injecteer 3 ml MilliQ water door de sample loop, gevolgd door 500 pi wasoplossing DVS. Bewaken van de voortgang van de reiniging door het indrukken van "run" in de Mis Calibration tabblad. Wassen tot de intensiteit van de strepen (Afbeelding 4) begint dan af door 3 ml MilliQ water en monitor volgt tot tot achtergrondniveaus (figuur 3).

3. Running Monsters

1. Open het Acquisitie venster. Standaardinstellingen: Doe Analyse = On-The-Fly, Signaal = Dual, Dual Count Calibration = gegevens te analyseren. Ruisonderdrukking is geselecteerd. Elk van deze kan indien gewenst gewijzigd worden. Voer de bestandsnaam in. Alle bestanden moeten worden opgeslagen op de E :/ / drive.
2. Instellen van overname vertragingen. Er zal een kleine vertraging in registratie cel gebeurtenissen van ongeveer 30 sec door de lengte van de buis tussen de sample loop en de vernevelaar zijn. Daarom is de som van "Verwerving vertraging" en "Detector stvermogen vertraging "moet ten minste 30 sec. Detector stabiliteit vertraging moet ten minste 20 sec.
3. Het instellen van het verzamelen van gegevens tijd. "Acquisitie tijd" is het aantal seconden dat u wilt uw monster uit te voeren. Het vullen van de hele 450 ul sample loop zou 600 sec in beslag. Voorgesteld wordt 50-100 sec worden toegevoegd aan het einde van de run tijd sample minimaliseren overdracht.
4. Resuspensie van het monster. Om opbouw minimaliseren van zouten in de machine wordt gesuggereerd dat minstens twee wasbeurten in MilliQ water worden gedaan bij het einde van de cel kleuring, gevolgd door een laatste resuspensie in MilliQ water. De hoeveelheid MilliQ water gebruikt om het cel pellet is afhankelijk van het aantal cellen te beginnen met de celopbrengst na de gehele kleuringsprocedure mengen. Een goed startpunt is 10 ⁶ (startende) cellen / ml. Na resuspensie, filtreer door een cel zeef om aggregaten te verwijderen.
5. Vanaf steekproef uit te voeren. Geef een nieuwe bestandsnaam voor de huidige steekproef. Zet de sample loop ventiel op "LOAD", het monster te injecteren, terug te schakelen naar 'injecteren', druk dan op "Openen" in het Acquisition venster.
6. Het registreren van cel evenementen. Cellen zullen worden vertegenwoordigd in de snapshot-venster als horizontale collecties van merken in elke verticale isotoop / marker kanaal (figuur 8). Terwijl de massa cytometer kunnen zich aanmelden 1.000 cellen / sec, wordt een betere resolutie tussen cel gebeurtenissen gewoonlijk verkregen bij 300-500 cellen / sec. Dit komt overeen met een gemiddelde van ~ 1 cel / scherm refresh. Het kan tot 30 seconden voordat de cel event-teller begint te klimmen. Dit komt door "On-the-fly" gegevensverwerking; geen cel event informatie verloren.

Figuur 8. Acquisition venster monsters tijdens lopen, met horizontale rijen punten overeenkomen met de elementen gekoppeld aan drie afzonderlijke cel events.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

7. Kwaliteit van cel gebeurtenissen. Constateert achtergrond strepen in elk isotoop kanaal en de cel incidentie. De massa cytometer herkent een "cel event" als een zekere verhoging van signaal boven de achtergrond, dus achtergrondsignaal van gratis metaal of ongebonden antilichaam kan de "cel gebeurtenis" telling veranderen. Bovendien kan draaien cellen te hoge concentratie tot een verhoogd aantal events doublet. Achtergrond kan worden verminderd door extra spoelingen of meer celverdunning. Doubletten kan worden geminimaliseerd door grotere cel verdunning, ten koste van een verhoogde uitvoering.
8. Afwerking sample data-acquisitie. Wanneer de Verwerving is bereikt, wordt de gegevensverzameling voltooien. Er zal een beetje vertraging voordat een pop-up venster met zijn een "OK" knop verschijnt, nogmaals, dit is te wijten aan 'On-the-Fly "verwerking van gegevens. Afnemen van het monster kan ook worden gestopt Prematurely door op de "Stop" knop. In dit geval zal de cel reeds geregistreerde gebeurtenissen worden geteld en verwerkt tot uitvoerbestanden.
9. Injectie van ten minste 500 pi MilliQ water elk monster helpt minimaliseren monster overdracht.

4. Het apparaat reinigen na gebruik

1. Wasoplossing. Na de laatste steekproef wordt uitgevoerd en de sample loop gespoeld met water, 450 ul van wasoplossing te injecteren in de sample loop. Toezicht houden op de afgifte van vrije metaal in de Mis Kalibratie tab van het data-acquisitie venster Instellingen als in stap 2.8 (Figuur 9). Wanneer het vrije metaal signaal begint af te spoelen met 3 ml MilliQ water en controleren totdat achtergrondniveaus worden bereikt.

Figuur 9. Mass kalibratie tabblad venster, tijdens de post-run reinigen met DVS Wash-oplossing. De verticale strepen in TOF regio 9800 tot 11.000 zijn antilichaam-label isotopen worden gereinigd uit de machine. De verticale strepen rond TOF 11500 overeen met de twee Ir intercalator isotopen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

5. Uitschakelen van de machine

1. In de RFG Controller tab van het Instrument-setup-venster, selecteer "Stop Plasma". Wanneer de procedure is voltooid, zal er een pop-up venster waarin u wordt gevraagd om de vernevelaar te verwijderen. Druk op "OK". In de Card Cage tabblad, zet de verwarming. Sluit de klep op de argon aanbod.
2. Verwijdering van vernevelaar. Verwijder de verstuiver uit de sproeikamer door voorzichtig naar achteren te trekken. Schroef het monster introductie slang van stap 1,6 en leg opzij. Schroef de make-up het inbrengen van gas aansluiting op iets los en trek de vernevelaar uit. Het verlaten van de fitting in elkaar geschroefd zal verminderen de kans op lOsing de zwarte rubberen o-ring en witte conische plastic stuk.
3. Reinigen verstuiver. Backflush beide poorten van de vernevelaar met 5% citranox met behulp van de spuit en de slang als in stap 1.3. Store, bedekt, in 5% citranox tot het volgende gebruik.

Representative Results

Naar aanleiding van het bovenstaande protocol moet volbrengen vier dingen. Ten eerste zal dat op adequate wijze opwarmtijd voor de massa cytometer produceren een warme, stabiele plasma noodzakelijk voor een optimale signaal-en minimale oxidevorming. Anderzijds voldoende was de massa cytometer met MilliQ water en DVS wasoplossing (figuur 9) zal helpen de niveaus van metaal adsorptie aan de buis en andere delen van de machine, waardoor achtergrond te verlagen monsters tijdens acquisitie (figuur 8). Het zal ook helpen bij het verwijderen alle cellen die kunnen vastlopen in het apparaat en daarmee het minimaliseren van overdracht van monster tot monster. Ten derde, terwijl oxidevorming niet volledig kan worden voorkomen, juiste afstemming van de massa cytometer (figuren 5-7) helpen optimaliseren totale signaal op de gewenste massa M, en achtergrondruis minimaliseert de oxide massa M +16. Zoals te zien in figuur 10, onjuiste tuning (magenta) sterk toegenomen oxide vorming bijM +16 ten opzichte van het correct afgestemd monster (donkerblauw). Dit heeft het effect van een lichte afname gewenste signaal M en aanzienlijke verhoging ongewenste achtergrond interferentie M +16.

Tenslotte voldoende was van het monster in buffers en tenslotte in MilliQ water moet metal / antilichaam achtergrondsignaal tot een aanvaardbaar niveau. De MilliQ wassen met water en resuspensie zijn van cruciaal belang voor het handhaven van stabiele Huidige instellingen in de loop van enkele uren van runtime. Juiste verdunning van het monster in MilliQ water moet worden bepaald op een dagelijkse basis van steekproeven. Echter, verdunnen tot ~ 10 ⁶ (startende) cellen / ml is een goede plek om te beginnen. Gebaseerd op het eerste monster van een set, kunnen meer of minder verdunning voor daaropvolgende monsters worden ondergebracht. Goede wassen en juiste verdunning zorgt minimale achtergrond en de grootste resolutie van cellen, waarbij een evenwicht om snelheid (figuur 8).

Figuur 10. Effect van een goede afstemming op gewenste signaal, en verschil in oxidevorming tussen verschillende lanthanide metalen. Polystyreen kralen met natuurlijke overvloed La139, Pr141, Tb159, Tm169, en Lu175 van DVS Sciences werden uitgevoerd in cel acquisitie modus. Afzonderlijke monsters van de korrels werden bij de aangegeven Make-up gasstromen (vergelijk figuur 6). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo v9.4.9 voor Mac, met inbegrip van gating puin dient uit gebroken korrels. De correct afgestemd monster was 0,74 l / min. Dit had hogere signaal intensiteiten dan bij lagere debieten, en een hogere signaal op "M" metal massa's met minder signaal op de "M +16" oxide massa dan de verkeerd afgesteld signaal. A. Signaal bij "M" massa La139 en Tm169. Merk op dat La139 signaal intensiteit wordt meer dan Tm169 beïnvloed door Make-up gasdebiet. B. Signaal bij "M +16" oxide massaes 155 en 185, die overeenkomen met La139 + O16 en O16 Tm169 + oxides, respectievelijk. Er geen echte "Gd155" of "Re185" aanwezig in de korrels. De oxide signaal in de "Gd155" kanaal bijzonder sterk vanwege La139 wordt gemakkelijk geoxideerd. Dit is een van de hoogste oxide kan men verwachten tegenkomen. C. Grafiek van "M" en "M +16" signaalintensiteiten als functie van Make-up gasdebiet. Gevuld pictogrammen vertegenwoordigen massa "M", terwijl open pictogrammen vertegenwoordigen massa "M +16". De kleur van de lijnen corresponderen met de respectievelijke massa "M". Merk op dat La139 en Pr141 hoge mate worden beïnvloed door Make-up gasstroom, met zelfs een punt waar meer massa "M +16" oxide aanwezig is dan massa "M". Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De laatste decennia is fluorescentie flow cytometrie is een werkpaard methode voor het analyseren enkelvoudige cellen, zowel oppervlakte-expressie en functionele bepalingen. Echter de problemen van spectrale overlap van de fluorescente kleurstoffen beperkt het aantal gelijktijdige markers. Terwijl experimenten met meer dan 12 gelijktijdige markers zijn gemeld, het bedrag van de schadevergoeding die nodig maakt dit technisch moeilijk.

In plaats van fluoroforen, massa cytometrie ontwikkeld door DVS Sciences maakt gebruik van polymeren met chelerende plaatsen voor metalen als labels voor antilichamen. ^{1 tot 3} Door de zuiverheid van de metalen en de massa resolutie van ICP-MS, is er feitelijk geen "spectrale overlap." Aangezien de meeste van de gebruikte elementen niet biologisch relevant is er weinig achtergrond veroorzaken "autofluoresence." Deze feiten maken het gebruik van meer dan 30 gelijktijdige markers binnen een experiment. ^6,7 Er is ook een bredere dynamische bereik in signaal in de ICP-MS dan in een typisch fluorescentie experiment.

Echter, de massa cytometrie heeft beperkingen. Het is een destructieve techniek: cellen kunnen niet worden hersteld voor het sorteren en verder experimenteren. De massa cytometer een strikt vereiste voor de aanwezigheid van metalen: als een metaal niet aanwezig een cel wordt niet herkend. Dit is de voornaamste reden voor het gebruik van metaal-chelerende DNA intercalators correcte percentage van ouder-statistieken, omdat alle cellen ongeacht of antilichaam probes binden gedetecteerd. ^3,6-7 slotte wordt de huidige cel transmissierendement van de machine ~ 25%, vergeleken met een rendement van> 90% bij een fluorescent flowcytometer. Daarom wordt een groter aantal cellen begint vaak nodig, met name voor zeldzame celpopulaties. Echter wordt dit gewoonlijk gecompenseerd door het feit dat een massa cytometer sample vaak meerdere fluorescent samples vervangt. Tenslotte de maximale cel acquisbankwezen in tarief is veel trager dan de standaard TL-flowcytometers bij ~ 1000 cellen / sec; optimale snelheid is vaak de helft. Daarom elk monster duurt langer lopen.

Verschillende kranten zijn onlangs gepubliceerd op de kleuring van verschillende soorten cellen monsters. ^3,5-7 Het doel van dit artikel is informatie te verstrekken over het juiste gebruik van een CyTOF ^TM massa cytometer voor het uitvoeren van steekproeven. Onderhoud van de vernevelaar door terugspoeling met en opslag in 5% citranox wordt geminimaliseerd opbouw van celresten en metalen, waardoor de kans op verstoppingen. Onderhoud van de machine voor een optimale prestatie bestaat uit twee delen. Enerzijds de juiste afstemming (Current, Make-up gas) van de machine ten minste een dagelijkse basis ervoor zorgt een meting. Tweede adequate wassen met MilliQ water elk monster en wasoplossing eind loopt verwijderen opgebouwde organische en anorganische afval zal helpen minimaliseren achtergrond in het algemeen en overbrengingtussen de monsters. Tenslotte de kwaliteit van monstervoorbereiding heeft een grote invloed op de kwaliteit van data-acquisitie. Meerdere wasbeurten in buffer en tenslotte in MilliQ water helpen verwijderen een metalen-achtergrond van intercalators of niet-specifieke binding van antilichaam. Juiste wijze van verdunning van de cel monster zal helpen de balans van optimale resolutie tussen cel gebeurtenissen terwijl het minimaliseren van de totale werktijd per monster. Juiste verdunning helpt ook de waarschijnlijkheid van een verstopping veroorzaken in de vernevelaar.

Veelvoorkomende problemen oplossen

1. De machine is niet voorbij "RFG Bereid" stap tijdens het opstarten

Onder de Card Cage tabblad van het Instrument Set-up venster, drukt u op "Reset" onder RFG. Poging om de machine te starten. Als dit niet het probleem oplossen, sluit de software, te heropenen, drukt u nogmaals op "Reset", en probeer te starten. Als dit nog steeds niet het probleem oplossen, controleert u de RFG generator breaker schakelaar op de linker achterste hoek van de machine. Indien geactiveerd,herpositioneren op "Aan", druk op "Reset", en probeer te starten. Als dit nog steeds niet het probleem oplossen, neem dan contact DVS.

2. De machine wordt uitgeschakeld tijdens het hardlopen

1. Controleer argon aanbod. Als de argondruk het bereiken van de machine wordt hieronder rond 40 psi, de software voert een automatische uitschakeling.
2. RFG overschreden 100W fout. Dit gebeurt wanneer de energiebehoefte voor de plasma gaat buiten de 1300 + / - 100W venster, en de software voert een automatische uitschakeling. Dit wordt meestal veroorzaakt door ongelijke spray uit de verstuiver bijzonder grote druppeltjes. Dit koelt het overmatig plasma, die meer energie aan het plasma behouden. Dit kan gebeuren als gevolg van buitensporig geweld gebruikt om de spuit slang bevestigen aan de spuit tijdens het wijzigen van de injectiepomp. Dit veroorzaakt een grote nevel van druppeltjes, koelen de plasma. Als dit het geval is, herstart de machine.

Dit kan ook gebeuren door grote druppels die beginnenvormen wanneer de vernevelaar begint te verstoppen. Als deze fout zich opnieuw voordoet, moet u de vernevelaar voor het reinigen, plaatst u een schone vernevelaar en opnieuw te starten.

Veel minder vaak, kan de dunne monsterleidingen tussen het monster lus en de vernevelaar verstoppen. Dit kan worden gediagnosticeerd door abnormaal lage stroomsnelheid van vloeistof wanneer de buis wordt verwijderd uit de vernevelaar. Als dit het geval is, verwijder dan de aangetaste buizen en fittingen worden herbouwd met verse slangen, en vervangen door een nieuwe vernevelaar fittingen en slangen kit.

3. Geen isotoop strepen (of cel gebeurtenissen) zichtbaar tijdens celmonster acquisitie (figuur 8), of tijdens het kijken naar de mis kalibratie tab-venster (afbeelding 3, 4, 9)

1. Controleer de injectiepomp. Dit gebeurt vaak als gevolg van vergeten te "spelen" geraakt tijdens het wisselen van de spuitpomp spuit. Dit kan ook gebeuren als "pauze", in plaats van "stop", wordt geraakt tijdens de spuit verandering. "Pauze" wordt het volume teller niet op nul op de spuit pomp, En het zal stoppen bij 3,000 mL verspoten volume, ongeacht of vloeibare resten. Ten slotte kan de spuit leeg zijn van water.
2. Controleer monster ventiel. Zorg ervoor dat monster te laden terwijl op "Load" en vervolgens naar "Inject" net vóór het begin van het monster lopen.
3. Verarmd of overdreven verdunnen monster. Je hebt misschien loopt al uw monster; controleren Acquisition Tijd berekeningen (zie Stap 3.3). Als alternatief kan u zich verkeken op de verdunningsfactor, en / of verloren meer cellen dan verwacht tijdens de monster verwerking.
4. Verstopte verstuiver. Dit wordt meestal voorafgegaan door een RFG fout (zie nummer 2b), maar een klomp kan notiecably voorafgaande verminderen de cel transmissie efficiëntie waardoor een shutdown.

Bull 3c en 3d kan ook worden gecontroleerd door het uitvoeren van een monster van de Eu-bevattende beads polystyreen kalibrering. Ze worden geleverd op ongeveer 1 miljoen / ml (vortex goed alvorens monster!). Daarom zou het vullen van de 450 ul sample loop geven approximately 450.000 kralen. De CyTOF ^TM cel transmissie-efficiëntie is machine-afhankelijke, maar ongeveer 15-30%. Daarom zou 67,500-135,000 bead events worden verwacht dat injectie. Onderstaande nummers die consistent zijn met een klomp in de slang of vernevelaar.

De cel / kraal transmissie-efficiëntie is iets om af en toe te testen, voor de lange termijn trends te noteren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity