Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer

Summary

De nødvendige skritt for daglig tuning og optimalisering av ytelsen til en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveopparbeidelse og strømningshastighet er diskutert

Abstract

I de senere årene har den raske analyse av enkeltceller ofte blitt utført ved hjelp av flowcytometri og fluorescently-merkede antistoffer. Imidlertid har problemet med spektrale overlapping av fluorofor utslipp begrenset antallet samtidige sonder. I kontrast til nye CyTOF massen cytometer etter DVS Sciences par flytende encellet introduksjon system til en ICP-MS. ¹ stedet fluoroforer er chelaterende polymerer inneholdende høyt anrikede isotoper metal koplet til antistoffer eller andre spesifikke sonder. ^2-5 På grunn av metall renhet og masse oppløsning av massen cytometeret, er det ingen "spektral overlapping" fra nærliggende isotoper, og derfor ikke behov for kompensasjon matriser. Tillegg, på grunn av bruken av lantanid metaller, er det ingen biologisk bakgrunn og derfor ingen ekvivalent autofluorescens. Med en masse vindu spanning atommasse 103-203, teoretisk opptil 100 etiketter kunne skilles samtidig. I dag, Mer enn 35 kanaler er tilgjengelige via chelaterende reagenser tilgjengelig fra DVS Sciences, slik enestående disseksjon av den immunologiske profilen av prøver. ^6-7

Ulemper for massen cytometri inkludere strenge nødvendig med en separat metall isotop pr probe (ingen tilsvarer fremover eller sidespredning), og det faktum at det er en destruktiv teknikk (ingen mulighet for sortering utvinning). Gjeldende konfigurasjon av massen cytometeret har også en celle overføringshastighet på bare ~ 25%, og dermed krever et høyere inngang antall celler.

Optimal daglig ytelse av massen cytometeret krever flere trinn. Grunnleggende mål av optimaliseringen er å maksimere den målte signalintensitet av de ønskede isotoper metal (M) samtidig minimere dannelsen av oksider (M 16) som vil redusere M signalintensitet og forstyrre ønsket signal på M 16. Det første trinnet er å varme opp maskinen slik at en varm, stabil jegCP plasma er etablert. Sekund, må innstillingene for strøm og make-up gass strømningshastighet bli optimalisert på en daglig basis. Under prøvetaking, er den maksimale celle hendelsesraten begrenset av detektoren effektivitet og prosesseringshastighet til 1000 celler / andre. Imidlertid, avhengig av prøven kvalitet, en langsommere celle hendelsesrate (300-500 celler / sekund) er vanligvis ønskelig for å tillate bedre oppløsning mellom celler hendelser og dermed maksimere intakte singlets løpet dubletter og rusk. Slutt hjelper tilstrekkelig rengjøring av maskinen ved slutten av dagen minimere bakgrunnssignal grunnet materialovergang.

Protocol

Alle celleprøver for CyTOF må være fast og permeabilized. Dette muliggjør større oppføring av iridium-holdige DNA intercalator, og forhindrer også cellelyse under MilliQ vannvask og resuspendering trinnene umiddelbart før injisering inn i massen cytometeret.

1. Oppstart av Mass cytometeret

1. Åpne CyTOF programmet. Velg Instrument Setup. På kortet Cage kategorien, går du til nedre høyre hjørne og klikk Heater "ON"-knappen. Slå på varmeapparatet minst 15 min før ønsket tid å gi tilstrekkelig tid for spray kammer mantelen å nå 200 ° C.
2. Erstatt den hvite Norm-Ject 3 ml sprøyte i sprøyten pumpen med en frisk sprøyte fylt med MilliQ vann.
3. Rengjøring forstøveren. Tilbakespylingsledningen forstøveren ved hjelp av sprøyte og slangen for å trekke 5% citranox 2-3 ganger gjennom både mindre flytende innføring port og større gass introduksjon port. Gjenta tilbakespyling med MilliQ vann to fjerne rester citranox.
4. Sjekk for å bekrefte at lysene på frontpanelet på CyTOF er tent som i figur 1.

Figur 1. CyTOF panel lys før idriftsetting.

5. Åpne argongass tank ventil. Dette bør føre til at "ARGON" lys på forsiden for å slå på.
6. Fest forstøveren til sminke gassinnløp. Skru av make-up gass slangen kontakten og fjerner den svarte gummi o-ringen og den hvite koniske plastbiten. Legg merke til den bredere "knoke" på gassen innføring port stammen av forstøveren. Plasser kontakten på gass innføring port. Plasser den svarte o-ringen over enden av gass-porten, og tvinge o-ringen forbi bredere del av porten stammen. Plasser den hvite koniske plastdelen på toppen med den smale enden påpekt, og skru den inn make-up gass tubing.
7. På RFG Controller kategorien Instrument Setup vinduet, trykk "Start Plasma". Siden forstøveren allerede er satt inn, trykk "OK". Programvaren vil slå på chiller, starter flyten av gass, og tenne en plasma. Detektoren spenning vil trappe opp. Det vil være en pop-up vindu som sier "Plasma oppstart sekvens er ferdig hell" når du er ferdig, trykk på "OK". Nye lys skal være på i frontpanelet (Figur 2 >).

Figur 2. CyTOF panel lys etter plasma antent og oppstart fullført.

9. Slå på sprøytepumpe. I øvre høyre hjørne, trykk på den grønne "play"-knappen for å starte sprøytepumpen og begynne flytende væske gjennom slangen og sprøyting ut av forstøveren. Standardinnstillingene syringe innstillingene er for 3 ml vann. For at prøven skal strømme gjennom prøvesløyfen må sprøytepumpen periodisk endres når det renner ut av vannet. På toppen av skjermen, er det en teller som angir hvor mye væske har strømmet ut av sprøytepumpe. Sprøyten pumpen stanser når denne telleren når "3,000" eller stempelet når enden av sprøyten. Ved etterfylling sprøyten, må du trykke "stopp" i stedet for blå "pause" for å nullstille telleren.

e "> 2. Daily Kalibrering av Mass cytometeret

1. Massen cytometeret trenger ca 20 min for å oppnå en varm, stabil plasma før kalibrering. Formålet tuning trinnene er å maksimere det ønskede signal av Tm169 eller Tb159 samtidig "Gd155" (oksyd; La139 + O16) signalet under 3% av den høyere verdi. Klikk Acquisition innstillinger for å åpne Data Acquisition innstillinger. I analytter klikker den periodiske tabellen for å åpne isotopen valg panelet. Velg de isotoper i DVS Sciences tuning løsning som er oppført i manualen, og klikk "lagre".
2. Klikk på Isotoper Per Reading-knappen for å åpne messen (es) Per Reading vinduet. Velg "Belgfrukter Count", og rescale y-aksen ved å skrive inn et nytt nummer og trykke "enter".
3. Fyll en grønn 1 ml Norm-Ject sprøyte med tuning løsning. Slå prøven port til "Load", injisere 450 ul av tuning løsning, deretter slå på "inn". I Mass Kalibrering kategorien Data Acquisit ion-innstillinger, trykk på "Kjør" for å overvåke hvilke massene flyter forbi. Den venstre side av vinduet er lavere masse, mens den høyre side er høyere masse. Merk: Det vil allerede være signaler i TOF 9400-9800 regionen, grunnet xenon isotoper i argongass (figur 3). Vent til tuning løsning isotoper begynne å vises som streker i denne visningen (figur 4).

Figur 3. Mass kalibrering fanevinduet, viser bakgrunnsnivå for ulike isotoper etter vask løsning og vann skyll. Regionen rundt TOF 9400-9800 tilsvarer xenon isotoper i argongass, og bør alltid være til stede. Klikk her for å se større figur .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Figur 4. Mass kalibrering fanevinduet, viser vertikale striper for ulike isotoper i DVS tuning løsning. Klikk her for å se større figur .

4. Gå tilbake til Mass (es) Per Reading vinduet og trykk på den grønne "Play"-knappen øverst i venstre hjørne. Hver isotop valgt i trinn 2.1 er representert ved en annen farget linje. Standard x-aksen er "Tid", i sek. Overvåke nivåene av de forskjellige isotoper til de er stødig.
5. Tuning av strømmen. På Parameter kategorien Data Acquisition Settings vinduet, velg "Current" fra drop-down menyen. La start = 0, avslutt = 10, step value = 0,5, settling time = 200, og trykk på "lagre". Klikk tilbake på Mass (es) Per Reading vinduet og trykke play. X-aksen er nå "Aktuelt". Obs hvor signalene av isotoper peak (Figur 5), og r ecord. Under DAC kanaler Oppsett av instrumentet Setup vinduet, bla ned til "Aktuelt" og angi denne nye verdien. Trykk på "Set faktiske dagens verdi", deretter "Lagre".

Figur 5. Gjeldende tuning profil.

6. Avstemning av make-up gass. Endre drop-down-menyen til "Make-up gass." La start = 0,55, end = 0,95, steg value = 0,05, settling time = 200. Trykk lagre. Tilbake til Mass (es) Per Reading vinduet og trykke play. X-aksen er nå "Make-up gass" flow rate. Posten der signaler av isotoper peak. Observere den raske økningen av "Gd155" signal nær slutten (figur 6). Tilbake til DAC kanaler Oppsett, bla ned til "Make-up gass", og skriv inn den nye verdien. Trykk på "Set faktiske dagens verdi", deretter "Lagre".

igur 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figur 6. Make-up gass tuning profil.

7. Innspilling forholdet ønsket isotop vs oksid. Foreta et nytt 450 ul injeksjon av tuning løsning. På Parameter hovedmenyen, velg "Time" fra drop-down menyen, la start = 0, end = 10, step value = 1, settling tid = 200. Trykk "lagre". Hit "play" i Mass (es) Per Reading vindu. Etter linjene har stabilisert seg (figur 7), bruker markøren til å lese verdien i øvre venstre bokser for Tm169 eller Tb159 (høyere verdi), og også den "Gd155" verdi (<3% av den høyeste verdien). Disse verdiene kan også lagres i en tuning-fil for fremtidig referanse.

Figur 7. Måling av tuning løsning signal intensitet etter optimalisere Nåværende og Make-up gass.

8. Rengjøring av sample loop. Injiser 3 ml MilliQ vann gjennom prøvesløyfen, etterfulgt av 500 pl av DVS vaskeløsning. Overvåke fremdriften av rensingen ved å trykke "run" i Mass Calibration kategorien. Vask inntil intensiteten av striper (Figur 4) begynner å synke, og deretter følge med 3 ml MilliQ vann og skjermen til ned til bakgrunnsnivå (Figur 3).

3. Kjører Samples

1. Åpne Acquisition vinduet. Standardinnstillinger: Gjør Analyse = On-The-Fly, Signal til Analyser = Dual, Dual Count kalibrering = Data. Støyreduksjon er valgt. Noen av disse kan endres hvis ønskelig. Skriv inn filnavnet. Alle filer må lagres i E :/ / stasjonen.
2. Stille oppkjøp forsinkelser. Det vil være en liten forsinkelse i registrere celle hendelsene ca 30 sek på grunn av lengden av slangen mellom prøvesløyfen og forstøveren. Derfor summen av "Acquisition forsinkelse" og "Detektor stevne forsinkelse "bør være minst 30 sek. Detektor stabilitet forsinkelse bør være minst 20 sek.
3. Stille datainnsamling tid. "Erverv tid" er det antall sekunder du ønsker å kjøre prøven. Fyller hele 450 ul prøvesløyfe ville kreve 600 sek for å fullføre. Er det foreslått at 50-100 sek legges til slutten av kjøringen for å minimalisere prøven overheng.
4. Oppvirvling av prøven. Å minimalisere oppbygningen av salter i maskinen, er det foreslått at minst to vaskinger i MilliQ vann gjøres ved slutten av cellen farging, etterfulgt av en endelig resuspensjon i MilliQ vann. Volumet av MilliQ vann brukt for å resuspendere cellepelleten vil variere avhengig av antall celler du startet med og celle restitusjon etter hele farging prosedyren. Et godt utgangspunkt er 10 ⁶ (start) celler / ml. Etter resuspensjon, filtrere gjennom en celle sil for å fjerne aggregater.
5. Starter prøve kjøre. Tast inn et nytt filnavn for den aktuelle prøven. Slå prøvesløyfen ventil til "Load", injisere prøven, bytte tilbake til "inn", og trykk "Kjør" i Acquisition vinduet.
6. Registrering celle hendelser. Celler vil være representert i snapshot-vinduet som horisontale samlinger av karakterer i hver vertikale isotop / markør kanal (Figur 8). Mens massen cytometeret kan registrere 1000 celler / sek, er bedre oppløsning mellom celle hendelser vanligvis oppnås ved 300-500 celler / sek. Dette tilsvarer et gjennomsnitt på ~ 1 celle / skjermoppdateringsfrekvensen. Det kan ta opptil 30 sekunder før cellen hendelsen telleren begynner å klatre. Dette er på grunn av "On-the-fly" databehandling, ingen celle hendelse informasjon går tapt.

Figur 8. Acquisition vinduet under prøven kjører, som viser horisontale rekker av flekker som tilsvarer elementene tilknyttet tre atskilte cellekamre hendelser.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

7. Kvaliteten på celle hendelser. Merke noen bakgrunn streaking i hver isotop kanal samt cellen hendelsesraten. Massen cytometeret gjenkjenner en "celle hendelse" som en viss økning i signal over bakgrunnen, så bakgrunnen signal fra gratis metall eller ubundet antistoff kan endre "cellen arrangementet" teller. I tillegg kan kjøre celler ved for høy konsentrasjon føre til økt antall doublet hendelser. Bakgrunn kan bli redusert med ytterligere vask eller større celle fortynning. Dubletter kan minimeres ved større celle fortynning, på bekostning av økt driftstid.
8. Etterbehandling prøve datainnsamling. Når Acquisition er nådd, vil datainnsamlingen er ferdig. Det vil være litt av forsinkelse før en pop-up vindu med en "OK"-knappen vises, igjen, dette er på grunn av "On-the-fly" databehandling. Prøvetagning kan også bli stoppet prematurely ved å trykke på "Stop" knappen. I dette tilfellet vil alle cellen hendelser allerede registrert telles og behandles i utdatafiler.
9. Injeksjon på minst 500 ul MilliQ vann mellom hver prøve hjelper også minimere krysskontaminering.

4. Rengjøring av maskinen etter bruk

1. Vask løsning. Etter den endelige prøven drives og prøvesløyfen spyles med vann, injisere 450 ul vaskeløsning i prøvesløyfen. Overvåke utgivelsen av gratis metall i Mass Calibration kategorien Data Acquisition innstillinger som i trinn 2.8 (Figur 9). Når den frie metall signal begynner å synke, skyll med 3 ml MilliQ vann og overvåke inntil bakgrunnsnivå er oppnådd.

Figur 9. Mass kalibrering fanevinduet, under post-run rengjøring med DVS Wash løsning. De vertikale striper i TOF region 9800-11000 er antistoff-label isotoper blir renset ut av maskinen. De vertikale striper rundt TOF 11500 samsvarer med de to Ir intercalator isotoper. Klikk her for å se større figur .

5. Slå av maskinen

1. I RFG Controller kategorien Instrument Setup vinduet, velg "Stopp Plasma". Når prosedyren er fullført, vil det være en pop-up vindu som ber deg om å fjerne forstøveren. Trykk "OK". I kortkassen kategorien slå av varmeapparatet. Steng ventilen på argon forsyning.
2. Fjerning av forstøveren. Fjern forstøveren fra spray kammer ved å trekke bakover. Skru prøven innføring slangen fra trinn 1,6 og sett den til side. Skru av make-up gass innføring forbindelse å løsne litt, og trekk forstøveren av. Forlater montering skrudd sammen vil redusere sjansene for losing den svarte gummi o-ring og hvit konisk plastbiten.
3. Rengjøring forstøveren. Tilbakespylingsledningen begge portene på forstøveren med 5% citranox med sprøyten og slangen som i Trinn 1,3. Store, dekket, i 5% citranox til neste bruk.

Representative Results

Etter ovennevnte protokoll skal oppnå fire ting. Først, vil tillate tilstrekkelig oppvarmingstid for massen cytometeret produsere en varm, stabil plasma nødvendig for en optimal signal og minimal oksyddannelse. Sekund, tilstrekkelig vasking av massen cytometer med MilliQ vann og DVS vaskeoppløsning (figur 9) vil bidra til å redusere nivåene av metall adsorpsjon til slangen og andre deler av maskinen, bidrar til å redusere bakgrunnen under prøvetagning (Figur 8). Det vil også bidra til å fjerne eventuelle celler som kan bli sittende fast i maskinen og dermed minimere overføring fra prøve til prøve. Tredje, mens oksyddannelse ikke kan helt forhindret, riktig innstilling av massen cytometeret (figurene 5-7) vil bidra til å optimalisere total signal på den ønskede massen M, mens minimere bakgrunn på oksyd massen M 16. Som sett i figur 10, feilaktig tuning (magenta) betydelig økt oksyddannelse påM 16 sammenlignet med riktig innstilt prøven (mørk blå). Dette har effekten av litt avtagende ønsket signal på M, og betydelig øker uønsket bakgrunnsinterferens på M 16.

Endelig bør tilstrekkelig vasking av prøven i buffere og til slutt i MilliQ vann redusere metall / antistoff bakgrunnssignal til akseptable nivåer. De MilliQ vann vasker og resuspensjon er avgjørende for å opprettholde jevn Gjeldende innstillinger i løpet av flere timer med kjøring. Riktig fortynning av prøven i MilliQ vann må fastsettes på en døgnprøve basis. Men fortynning til ~ 10 ⁶ (start) celler / ml er et bra sted å starte. Basert på den første prøve av et sett, kan større eller mindre fortynning for etterfølgende prøver innlemmes. Skikkelig vask og riktig fortynning vil sikre minimal bakgrunn og størst oppløsningen av celler, mens balansere behovet for hastighet (figur 8).

Figur 10. Effekt av riktig stemming på ønsket signal, og forskjell i oksyddannelse mellom ulike lantanid metaller. Polystyrenkuler inneholder naturlige overflod La139, Pr141, Tb159, Tm169, og Lu175 fra DVS Sciences ble kjørt i celle oppkjøpet modus. Separate prøver av perlene ble kjørt den indikerte make-up gass strømningshastigheter (sammenlign med figur 6). Dataene ble analysert ved hjelp FlowJo v9.4.9 for Mac, inkludert gating ut rusk fra ødelagte perler. Den riktig innstilt prøven var på 0,74 L / min. Dette hadde høyere signal intensiteter enn ved lavere strømningshastighet, og høyere signal på "M" metall massene med mindre signal på "M 16" oksid massene enn feil innstilt signal. A. Signal på "M" mass La139 og Tm169. Vær oppmerksom på at La139 signal intensitet påvirkes mer enn Tm169 av Make-up gass flow rate. B. Signal på "M 16" oksid massees 155 og 185, som tilsvarer La139 + O16 og Tm169 + O16 oksider, henholdsvis. Det er ingen faktiske "Gd155" eller "Re185" tilstede i perlene. Oksydet signal i "Gd155" kanal er spesielt sterk, grunnet La139 blir lett oksidert. Dette representerer en av de høyeste nivåene av oksid man kan forvente å møte. C. Graf av "M" og "M 16" signal intensitet som funksjon av Make-up gass flow rate. Fylt ikoner representerer masse "M", mens åpne ikoner representerer masse "M 16". Fargen på linjene tilsvarer den respektive masse "M". Legg merke til at La139 og Pr141 er sterkt påvirket av Make-up gass flow rate, selv når et punkt der mer masse "M 16" oksid er til stede enn masse "M". Klikk her for å se større figur .

Discussion

For de siste tiårene, har fluorescens flowcytometri vært en arbeidshest metode for å analysere enkeltceller, både i form av overflate uttrykk og i funksjonelle analyser. Imidlertid har problemene med spektrale overlapping av de fluorescerende fargestoffer begrenset antallet samtidige markører. Mens forsøk med mer enn 12 samtidige markører er rapportert, gjør erstatningsbeløpet nødvendig dette teknisk vanskelig.

Istedenfor fluoroforer, masse cytometri utviklet av DVS Sciences bruker polymerer med chelaterende nettsted for metaller som etiketter for antistoffer. ^1-3 Grunnet renheten av metallene og masse oppløsning av ICP-MS, det er effektivt ikke "spektral overlapping". Siden de fleste av elementene som brukes er ikke biologisk relevant, det er også liten bakgrunn for å forårsake "autofluoresence." Disse fakta tillate bruk av mer enn 30 samtidige markører innenfor et enkelt eksperiment. ^6,7 Det er også en bredere dydynamisk rekkevidde i signal i ICP-MS enn i et typisk fluorescens eksperiment.

Imidlertid har masse cytometri begrensninger. Det er en destruktiv teknikk: celler kan ikke gjenopprettes for sortering og videre eksperimentering. Massen cytometeret har strenge krav for tilstedeværelse av metaller: hvis et metall ikke er tilstede, vil en celle ikke oppdages. Dette er den primære årsaken til bruk av metall-chelaterende DNA intercalators å sikre korrekte prosent-av-foreldre statistikk, som alle cellene vil bli oppdaget uavhengig av om antistoff sonder bind. ^3,6-7 slutt den gjeldende cellen overføring effektivitet av maskinen er ~ 25%, sammenlignet med en effektivitet på> 90% for en fluorescerende strømningscytometer. Derfor er en større start antall celler ofte kreves, spesielt for sjeldne cellepopulasjoner. Imidlertid er dette vanligvis balansert ut av det faktum at en enkelt masse cytometer prøven ofte erstatter flere fluorescerende prøver. Endelig er den maksimale celle regelverketition er mye lavere enn standard fluorescerende flowcytometere på ~ 1000 celler / sek, optimal hastighet er ofte halvparten. Derfor tar hver prøve lenger å kjøre.

Flere aviser har nylig blitt publisert på farging av ulike typer celleprøver. ^3,5-7 Formålet med denne artikkelen er å gi informasjon om riktig bruk av en CyTOF ^TM masse cytometer for kjører prøver. Vedlikehold av forstøveren ved tilbakespyling med og lagring i 5% citranox vil minimert oppbygging av celleavfall og metaller, og dermed redusere sjansen for tresko. Vedlikehold av maskinen for optimal ytelse har to deler. Først, det hjelper riktig tuning (Current, make-up gass) av maskinen på minst en daglig basis sikre riktig måling. Sekund, tilstrekkelig vasking med MilliQ vann mellom hver prøve, og med vaskeløsning på slutten av løper å fjerne oppbygget organisk og uorganisk rusk vil bidra til å minimere bakgrunn generelt og carryovermellom prøvene. Endelig har kvaliteten på prøveopparbeidelse en stor innvirkning på kvaliteten på datainnsamling. Flere vasker i buffer og til slutt i MilliQ vann bidra til å fjerne noe metall-bakgrunn fra intercalators eller ikke-spesifikk binding. Riktig fortynning av celleprøve vil bidra til å balansere optimal oppløsning mellom celle hendelser samtidig som total kjøretid per prøve. Riktig fortynning bidrar også minimere sannsynligheten for å forårsake en tresko i forstøveren.

Feilsøking Vanlige problemer

1. Maskinen får ikke forbi "RFG Forbered" trinn under oppstart

Under kortkassen kategorien Instrument Set-up vindu, trykk "Reset" under RFG. Forsøk å starte maskinen. Hvis dette ikke løser problemet, lukker programvaren, åpner, trykk "Reset" igjen, og forsøk å starte. Hvis dette fortsatt ikke løser problemet, sjekk RFG generator breaker bryter på venstre bakre hjørne på maskinen. Hvis utløst,omplassere til "On", trykk "Reset", og prøver å starte. Hvis dette fortsatt ikke løser problemet, kan du kontakte DVS.

2. Maskinen slår seg mens du kjører

1. Sjekk argon forsyning. Hvis argon press nå maskinen blir under rundt 40 psi, utfører programvaren en automatisk nedstengning.
2. RFG overskredet 100W feil. Dette skjer når kraftbehovet for plasma går utenfor 1300 + / - 100W vindu, og programvaren utfører en automatisk nedstengning. Dette skyldes vanligvis ujevn spray fra forstøveren, spesielt store dråper. Dette kjøler overdrevet plasma, som krever mer energi for å opprettholde plasmaet. Dette kan skje på grunn av overdreven kraft som brukes til å feste sprøyten slangen til sprøyten under endring av sprøytepumpe. Dette fører til en stor spray av dråper, kjøling plasma. Hvis dette er tilfelle, er det bare starte maskinen.

Dette kan også skje på grunn av store dråper som begynner åform når forstøveren begynner å tette. Hvis denne feilen vedvarer, må du fjerne forstøveren for rengjøring, sett en ren forstøver og starte på nytt.

Mye mindre ofte, kan den tynne prøven slangen mellom prøvesløyfen og forstøveren tette. Dette kan diagnostiseres ved anomalously lav strømningshastighet av væske når slangen fjernes fra forstøveren. Hvis dette er tilfellet, fjerner de berørte rør og rørdeler skal bygges om med fersk rør, og erstatte med en ny forstøver inventar og rør kit.

3. Ingen isotopen striper (eller celle events) synlig under celleprøve oppkjøp (Figur 8), eller mens du ser Mass kalibrering fanevinduet (figur 3, 4, 9)

1. Sjekk sprøytepumpe. Dette skjer ofte på grunn glemme å trykke "play" under endring av sprøytepumpen sprøyten. Dette kan også skje hvis "pause", snarere enn "stopp", er truffet under sprøyten endring. "Pause" ikke tilbakestille volumet telleren på sprøytepumpe, Og det vil stoppe på 3.000 ml utlevert volum, uavhengig av om flytende rester. Endelig kan sprøyte har kjørt ut av vannet.
2. Sjekk prøveventil. Sørg for å laste prøven mens på "Load", og deretter bytte til "Injiser" like før prøven løp.
3. Utarmet eller altfor fortynne prøven. Du har kanskje kjøre alle prøven, sjekk oppkjøpstidspunktet beregninger (se trinn 3.3). Alternativt kan du ha feilberegnet fortynningsfaktoren, og / eller tapt flere celler enn forventet under utvalgets behandling.
4. Tette forstøveren. Dette er vanligvis foran en RFG feil (se Issue 2b), men en tresko kan notiecably redusere celle overføring effektivitet før forårsaker en nedleggelse.

Problemer 3c og 3d kan også kontrolleres ved å kjøre en prøve av EU-holdige polystyren Kalibreringsperler. De leveres på ca 1 million / ml (vortex godt før tegning prøve!). Derfor, ville fylle 450 pl prøvesløyfen gi approximately 450000 perler. Den CyTOF ^TM celle overføring effektivitet er maskin-avhengige, men ca 15-30%. Derfor, ville 67,500-135,000 bead hendelser bli forventet fra at injeksjon. Tallene nedenfor som er konsistent med en tresko i slangen eller forstøveren.

Cellen / perle overføring effektivitet er noe å teste noen ganger, å merke noen langsiktige trender.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity