Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer

Summary

De åtgärder som krävs för daglig avstämning och optimering av prestanda för en CyTOF massa flödescytometer beskrivs. Kommentarer till optimal provberedning och flöde diskuteras

Abstract

Under senare år har den snabba analysen av enstaka celler vanligen utförts med användning av flödescytometri och fluorescensmärkta antikroppar. Emellertid, har frågan om spektral överlappning av fluorofor utsläpp begränsade antalet samtidiga sönder. I motsats, den nya CyTOF massan cytometer av DVS Sciences kopplar en flytande enkel-cell-introduktion systemet till en ICP-MS. ¹ stället fluoroforer är kelatbildande polymerer innehållande högt anrikade metall isotoper kopplade till antikroppar eller andra specifika sönder. ^2-5 På grund av metall renhet och massa upplösning av massan cytometern, det finns ingen "spektral överlappning" från närliggande isotoper och därför inget behov av ersättning matriser. Dessutom, på grund av användningen av lantanid metaller, finns det inga biologiska bakgrund och därför ingen ekvivalent autofluorescens. Med en massa fönster spänner atommassa 103-203, teoretiskt upp till 100 etiketter kan urskiljas samtidigt. För närvarande, Mer än 35 kanaler är tillgängliga med hjälp av kelatbildande reagenser tillgängliga från DVS Sciences och möjliggjort en oöverträffad dissektion av det immunologiska profil prover. ^6-7

Nackdelar med massa cytometri inkluderar strikta krav på en separat metall isotop per prob (ingen motsvarande framåt eller sidospridning), och det faktum att det är en destruktiv teknik (ingen möjlighet att sortera återvinning). Den nuvarande utformningen av massan cytometern har också en hastighet cell överföring av endast ~ 25%, vilket kräver en högre ingång antal celler.

Optimala dagliga prestanda massan cytometern kräver flera steg. Det grundläggande målet för optimeringen är att maximera den uppmätta signalintensiteten av den önskade metallen isotoper (M) under minimering av bildningen av oxider (M +16) som kommer att minska M signalintensitet och störa någon önskade signalen vid M +16. Det första steget är att värma upp maskinen så en varm, stabil jagCP plasma har fastställts. Andra måste inställningarna för ström och smink gasflödeshastigheten optimeras på en daglig basis. Under provtagning, den maximala cellen händelsen ränta begränsas av detektor effektivitet och processorhastighet till 1000 celler / sekund. Beroende på provet kvalitet, en långsammare cell händelse takt (300-500 celler / sekund) är vanligtvis önskvärt att bättre upplösning mellan celler händelser och därmed maximera intakta undertröjor över dubbletter och skräp. Slutligen bidrar adekvat rengöring av maskinen vid slutet av dagen minimera bakgrunden signal på grund av fri metall.

Protocol

Alla cellprover för CyTOF måste fastställas och permeabiliserades. Detta möjliggör större inträde av iridium-innehållande DNA-interkalator, och förhindrar även cellys under MilliQ vattentvätt och steg resuspension omedelbart före injektionen in i massan cytometern.

1. Uppstart av mässan Cytometer

1. Öppna CyTOF programmet. Välj Instrument Setup. På kort Cage fliken, gå till det nedre högra hörnet och klicka Värmare "ON"-knappen. Slå på värmaren minst 15 min före önskad tid för att tillåta tillräcklig tid för spraykammaren manteln att nå 200 ° C.
2. Ersätt den vita Norm-Ject 3 ml spruta i sprutpumpen med en färsk spruta fylld med MilliQ-vatten.
3. Rengöring nebulisatorn. Backströmningsmedium nebulisatorn genom att använda sprutan och slangen för att dra 5% citranox 2-3 gånger genom både mindre flytande introduktion port och större gas introduktionen hamn. Upprepa returspolning med MilliQ vatten to avlägsna kvarvarande citranox.
4. Kontrollera att bekräfta att lamporna på framsidan av CyTOF lyser såsom i figur 1.

Figur 1. CyTOF lamporna före idrifttagning.

5. Öppna argon ventil bensintank. Detta bör leda till att "argon" lampan på framsidan för att sätta på.
6. Fäst nebulisatorn att make-up gasinlopp. Skruva av make-up kontakten gas slang och ta bort den svarta O-ringen och den vita koniska plaststycket. Notera vidare "knoge" på gasen införande porten skaft nebulisatorn. Placera kontakten på gasen introduktion porten. Placera den svarta o-ringen över änden av gasporten, och tvinga o-ringen förbi den bredare delen av hamnen stammen. Placera den vita koniska plast bit på toppen med den smala änden påpekade och skruva fast på make-up gas slang.
7. På RFG Controller fliken på Instrumentinställning fönstret, tryck på "Start Plasma". Eftersom nebulisatorn redan sitter, tryck "OK". Programvaran kommer att slå på kylaggregatet, starta flödet av gas, och antända ett plasma. Detektorn spänningen kommer rampa upp. Det kommer att finnas ett pop-up fönster som säger "Plasma uppstartssekvens har slutförts" när du är klar, tryck på "OK". Nya lampor ska vara på i frontpanelen (figur 2 >).

Figur 2. CyTOF lamporna efter plasma antändes och uppstart slutförts.

9. Slå på sprutpump. I det övre högra hörnet, tryck på den gröna "play"-knappen för att starta sprutpumpen och börja strömmande vätska genom slangen och sprutar ut ur nebulisatorn. Standardinställningarna spruta inställningar för 3 ml vatten. För att provet ska strömmar genom provslingan, måste sprutpumpen periodiskt ändras när det körs ur vatten. På toppen av skärmen finns en räknare som anger hur mycket vätska har strömmat ut ur sprutpumpen. Sprutpumpen stannar när denna räknaren når "3,000" eller kolven träffar slutet av sprutan. Vid påfyllning av sprutan måste du slå "stopp" i stället för blå "paus" för att nollställa räknaren.

e "> 2. Daglig Kalibrering av Mass Cytometer

1. Massan flödescytometer behöver ungefär 20 minuter för att uppnå en varm, stabil plasma före kalibrering. Syftet med tuning steg är att maximera den önskade signalen Tm169 eller Tb159 samtidigt "Gd155" (oxid, La139 + O16) signal under 3% av det högre värdet. Klicka Förvärvet knappen Inställningar för att öppna Datainsamling fönstret. I Analyter fliken periodiska systemet för att öppna panelen isotopen val. Välj isotoper i DVS Sciences tuning lösning som anges i handboken, klicka sedan på "Spara".
2. Klicka på Isotoper Per Läsa för att öppna mässan (er) Per läsning fönstret. Välj "Baljväxter Count" och skala om y-axeln genom att ange ett nytt nummer och trycka på "enter".
3. Fyll en grön 1 ml Norm-Ject spruta med tuning lösning. Vrid provöppningen att "ladda", injicera 450 ul tuning lösning, sedan vrid till "injicera". I Mass Kalibrering fliken Data Acquisit jon fönstret Inställningar trycker du på "Kör" för att övervaka vilka massorna flyter förbi. Den vänstra sidan av fönstret är lägre massa, medan den högra sidan är högre massa. Obs: det kommer redan signaler i TOF 9400-9800 regionen, på grund av xenon isotoper i argongas (Figur 3). Vänta tills tuning lösning isotoper börjar visas som strimmor i denna display (Figur 4).

Figur 3. Mass kalibrering fliken fönstret visar bakgrundsnivåer för olika isotoper efter tvätt och vatten skölj. Regionen runt TOF 9400-9800 motsvarar xenon isotoper i argongas, och bör alltid vara närvarande. Klicka här för att se större bild .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Figur 4. Mass kalibrering fliken fönstret visar vertikala ränder för olika isotoper i DVS tuning lösning. Klicka här för att se större bild .

4. Gå tillbaka till mässan (er) Per Läsa fönstret och tryck på den gröna "Play"-knappen i det övre vänstra hörnet. Varje isotop valde i steg 2,1 representeras av en annan färgad linje. Standardinställningen x-axeln är "Tid" i sek. Övervaka nivåerna av de olika isotoperna tills de är stabila.
5. Avstämning av strömmen. På Parameter fliken Data Acquisition fönstret, välj "Current" från rullgardinsmenyn. Låt start = 0, avsluta = 10, steg värde = 0,5, insvängningstid = 200, och tryck på "spara". Klicka tillbaka på mässan (er) Per läsning fönster och tryck play. X-axeln är nu "Aktuellt". Notera där signalerna i isotoperna topp (figur 5), och r ecord. Enligt DAC kanaler fliken av instrumentet Setup fönstret, bläddra ner till "Aktuellt" och ange det nya värdet. Tryck på "Set faktiskt strömvärde" och sedan "spara".

Figur 5. Aktuell inställning profil.

6. Tuning av make-up gas. Ändra nedrullningsbara menyn på "Make-up gas." Låt start = 0,55, slut = 0,95, steg värde = 0,05, insvängningstid = 200. Tryck på Spara. Återgå till mässan (er) Per läsning fönster och tryck play. X-axeln är nu "Make-up gas" flödeshastighet. Anteckna där signalerna i isotoperna toppen. Observera den snabba ökningen av den "Gd155"-signalen nära änden (Figur 6). Återgå till DAC kanaler fliken Inställningar rulla ned till "Make-up gas" och ange det nya värdet. Tryck på "Set faktiskt strömvärde" och sedan "spara".

igure 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figur 6. Make-up gas tuning profil.

7. Inspelning förhållande önskade isotopen vs oxid. Gör en andra 450 ul injektion av tuning lösning. På Parameter, välj "Time" från rullgardinsmenyn, låt start = 0, slut = 10, steg värde = 1, insvängningstid = 200. Tryck på "Spara". Hit "play" i Mass (es) Per Läsa fönstret. Efter linjerna har stabiliserats (Figur 7), använd markören för att läsa värdet i de övre vänstra rutorna för Tm169 eller Tb159 (högre värde) och även "Gd155" värde (<3% av det högre värdet). Dessa värden kan också sparas i en stämning fil för framtida referens.

Figur 7. Mätning av signal tuning lösning intensiteter efter att optimera Ström och Make-up gas.

8. Rengöring av samPLE slinga. Injicera 3 ml MilliQ-vatten genom provet slingan, följt av 500 | il av DVS tvättlösning. Övervaka rengöring genom att trycka på "kör" i Mass Calibration fliken. Tvätta tills intensiteten i strimmor (Figur 4) börjar minska, följ med 3 ml MilliQ vatten och bildskärmen tills ner till bakgrundsnivå (Figur 3).

3. Köra prover

1. Öppna Förvärv fönstret. Standardinställningar: Gör Analys = On-The-Fly, Signal Analysera = Dual, Dual Count Kalibrering = Data. Brusreducering är vald. Någon av dessa kan ändras om så önskas. Ange filnamnet. Alla filer måste sparas till E :/ / enhet.
2. Inställning förvärv förseningar. Det kommer att finnas en viss fördröjning vid registrering cell händelser omkring 30 sekunder på grund av längden på slangen mellan provet slingan och nebulisatorn. Därför är summan av "Förvärv fördröjning" och "detektor stförmåga fördröjning "bör vara minst 30 sek. Detektor stabilitet fördröjning bör vara minst 20 sek.
3. Inställning datainsamling tid. "Förvärv tid" är antalet sekunder du vill köra ditt prov. Fyller hela 450 ul prov slinga skulle kräva 600 sekunder för att slutföra. Det föreslås att 50-100 sek läggas till i slutet av körtiden att minska prov överföring.
4. Resuspension av prov. För att minimera uppbyggnad av salter i maskinen, föreslås att minst två tvättar i MilliQ-vatten ske vid slutet av cellfärgning, följt av en slutlig återsuspension i MilliQ-vatten. Volymen av MilliQ-vatten som används för att resuspendera cellpelleten varierar beroende på antalet celler du började med och cellen återhämtning efter hela färgningsproceduren. En bra startpunkt är 10 ⁶ (start) celler / ml. Efter återsuspension, filtrera genom ett cellfilter för att avlägsna aggregat.
5. Starta provet körs. Ange ett nytt filnamn för den aktuella provet. Slå ventilen provslingan att "ladda", sprutas provet, växla tillbaka till "injicera", klicka sedan på "Kör" i förvärvet fönstret.
6. Registrering cell händelser. Celler kommer att vara representerade i ögonblicksbilden fönstret som horisontella samlingar av märken i varje vertikal isotop / markör kanal (Figur 8). Medan massan cytometern kan registrera 1.000 celler / sekund, är bättre upplösning mellan cell händelser erhålls vanligtvis vid 300-500 celler / sek. Detta motsvarar i genomsnitt ~ 1 cell / skärmuppdatering. Det kan ta upp till 30 sekunder innan cellen sluträknaren börjar klättra. Detta beror på att "On-the-fly" databehandling, ingen cell händelse information går förlorad.

Figur 8. Förvärv fönster under prov körs, visar horisontella rader av fläckar som motsvarar de element som är associerade med tre separata cell händelser.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

7. Kvalitet av cell händelser. Märker någon bakgrund strimmor i varje isotop-kanal, liksom cell händelsen takt. Massan flödescytometer erkänner ett "cell händelse" som en viss ökning av signal över bakgrunden, så bakgrundssignal från fri metall eller obunden antikropp kan ändra "cell händelse" räknas. Dessutom kan löpande celler vid en alltför hög koncentration orsaka ett ökat antal dubblett händelser. Bakgrund kan minskas genom ytterligare tvättar eller större celler utspädning. Dubletter kan minimeras genom ökad cell-utspädning, på bekostnad av ökad driftstid.
8. Efterbehandling prov datainsamling. När förvärvet tiden har uppnåtts, kommer datainsamlingen är klar. Det kommer att finnas lite fördröjning innan ett popup-fönster med en "OK"-knappen visas, igen, detta på grund av "On-the-Fly" databehandling. Prov förvärv kan också stoppas Prematurely genom att trycka på "Stop"-knappen. I detta fall kommer alla celler händelser redan registrerade räknas och bearbetas till utdatafiler.
9. Injektion av minst 500 | il MilliQ vatten mellan varje prov hjälper också till att minimera provets överföring.

4. Rengöring av maskinen efter användning

1. Tvätta lösning. Efter det slutliga provet körs och provet slingan spolas med vatten, injicera 450 ul tvättlösning i provet slingan. Övervaka frisättningen av fri metall i Mass Kalibrering fliken Data Acquisition fönstret som i steg 2,8 (Figur 9). När den fria metallen signalen börjar sjunka spola med 3 ml MilliQ vatten och övervaka dess bakgrundsnivåerna uppnås.

Figur 9. Mass kalibrering fliken fönstret under efter-run rengöring med DVS tvättlösning. De vertikala ränder i TOF regionen 9800-11000 är antikroppar märke isotoper som rensas ut ur maskinen. De vertikala ränder runt TOF 11.500 motsvarar de två Ir interkalator isotoper. Klicka här för att se större bild .

5. Stänga av maskinen

1. I RFG Controller fliken på Instrumentinställning fönstret, välj "Stop Plasma". När proceduren är klar kommer det att finnas en pop-up fönster där du ombeds att ta bort nebulisatorn. Tryck på "OK". I kortet Cage fliken, stänga av värmaren. Stäng ventilen på argon utbudet.
2. Avlägsnande av nebulisatorn. Avlägsna nebulisatorn från spraykammaren genom att försiktigt dra bakåt. Skruva provet införsel slangen från steg 1,6 och placera åt sidan. Skruva av make-up gas introduktion anslutning lossa något och dra sedan nebulisatorn avstängd. Lämnar kopplingen skruvas ihop kommer att minska risken för Losing den svarta O-ringen och vit konisk plastbiten.
3. Rengöring nebulisatorn. Backströmningsmedium båda hamnar i nebulisatorn med 5% citranox med sprutan och slangen som i steg 1,3. Store, omfattas, i 5% citranox till nästa användning.

Representative Results

Efter ovanstående protokoll bör utföra fyra saker. Först kommer tillåta tillräcklig uppvärmningstid för massan cytometern producera en varm, stabil plasma är nödvändig för optimal signal och minimal oxidbildning. Andra, tillfredsställande tvätt av massan cytometern med MilliQ vatten och DVS tvättlösning (figur 9) kommer att bidra till att minska halterna av metall adsorption till slangen och andra delar av maskinen, vilket bidrar till att minska bakgrunden under prov förvärv (Figur 8). Det kommer också att ta bort alla celler som kan fastna i maskinen och därigenom minimera överföring från prov till prov. Tredjedel, medan oxidbildning inte helt kan förhindras, korrekt inställning av massan cytometern (figur 5-7) kommer att hjälpa till att optimera den totala signal vid den önskade massan M, och samtidigt minimera bakgrunden på oxid massa M 16. Såsom framgår av fig. 10, felaktig inställning (magenta) ökade avsevärt oxidbildning vidM 16 jämfört med det rätt inställd provet (mörkblå). Detta har effekten av något minskande önskad signal vid M och avsevärt öka oönskad bakgrund störningar på M 16.

Slutligen bör tillfredsställande tvätt av provet i buffertar och slutligen i MilliQ-vatten minskar metall / antikropp bakgrund signal till acceptabla nivåer. De MilliQ-vatten tvättar och resuspension är kritiska för att upprätthålla stadig Aktuella inställningar under loppet av flera timmar av körning. Korrekt utspädning av provet i MilliQ-vatten måste bestämmas på en daglig stickprovskontroller. Men späda till ~ 10 ⁶ (start) celler / ml är ett bra ställe att börja. Baserat på det första provet av en uppsättning, kan större eller mindre utspädning för efterföljande prover inrymmas. Korrekt tvättning och korrekt utspädning garanterar minimal bakgrund och den största upplösningen av celler, samtidigt balansera behovet av hastigheten (Figur 8).

Figur 10. Effekt av ordentlig avstämning på önskad signal, och skillnaden i oxidbildning mellan olika lantanidserien metaller. Polystyrenkulor som innehåller naturliga överflöd La139, Pr141, Tb159, Tm169 och Lu175 från DVS Sciences kördes i cell förvärv läge. Separata prover av pärlorna kördes vid de angivna Make-up gasflödeshastigheter (jämför med fig 6). Uppgifterna analyserades med FlowJo v9.4.9 för Mac, inklusive slussning ut skräp från trasiga pärlor. Den rätt inställd provet var vid 0,74 l / min. Detta hade högre signalintensiteter än vid lägre flödeshastigheter, och högre signal vid "M" metall massor med mindre signal vid "M 16" oxid massor än felaktigt inställda signalen. A. Signal på "M" massa La139 och Tm169. Notera att La139 signalintensiteten påverkas mer än Tm169 med Make-up gasflöde. B. Signal på "M 16" oxid massaes 155 och 185, vilket motsvarar La139 + O16 och Tm169 + O16 oxider, respektive. Det finns ingen verklig "Gd155" eller "Re185" som finns i pärlorna. Oxiden signalen i "Gd155" kanal är särskilt stark, på grund av La139 är lätt oxideras. Detta är ett av de högsta nivåerna av oxid kan man förvänta sig att stöta på. C. Diagram "M" och "M 16" intensitet signalen som en funktion av Make-up gasflödeshastigheten. Fyllda ikoner representerar massan "M", medan öppna ikoner representerar massan "M 16". Färgen på linjerna motsvarar den respektive massan "M". Observera att La139 och Pr141 mycket påverkas av Make-up gasflöde, även når en punkt där mer massa "M 16" oxid finns än massa "m". Klicka här för att se större bild .

Discussion

Under de senaste årtiondena har fluorescens flödescytometri varit en arbetshäst metod för att analysera enskilda celler, både i fråga om yta uttryck och i funktionella analyser. Emellertid har frågan om spektral överlappning av de fluorescerande färgämnena begränsat antalet samtidiga markörer. Medan försök med mer än 12 samtidiga markörer har rapporterats, gör ersättningsbeloppet nödvändigt detta tekniskt svårt.

Istället för fluoroforer, banade massa cytometri av DVS Sciences använder polymerer med kelatbildande ställen för metaller som etiketter för antikroppar. ^1-3 grund av renhet metaller och massa upplösning ICP-MS, det finns effektivt ingen "spektral överlappning." Eftersom de flesta av de element som används är inte biologiskt relevant, det finns också lite bakgrund att orsaka "autofluoresence." Dessa fakta tillåter användningen av mer än 30 samtidiga markörer inom ett enda experiment. ^6,7 Det finns också en bredare dymisk intervall i signal i ICP-MS än i ett typiskt fluorescens experiment.

Emellertid har massa cytometri begränsningar. Det är en destruktiv teknik: celler kan inte återvinnas för sortering och ytterligare experiment. Massan flödescytometer har ett strikt krav för närvaron av metaller: om en metall inte är närvarande, kommer en cell inte detekteras. Detta är den främsta orsaken till att använda metall-kelatbildande DNA interkalatorer för att säkerställa korrekt procent-av-förälder statistik, eftersom alla celler blir tolkade oberoende av om någon antikropp sonder binder. ^3,6-7 slutligen den aktuella cellen överföringseffektivitet av maskinen är ~ 25%, jämfört med en effektivitet> 90% för en fluorescerande flödescytometer. Därför är ett större startnummer celler krävs ofta, särskilt för sällsynta cellpopulationer. Detta är dock vanligtvis balanseras av det faktum att en enda massa cytometer prov ofta ersätter flera fluorescerande prover. Slutligen, den maximala cellen regelverkition kurs är mycket långsammare än vanliga lysrör flödescytometrar på ~ 1000 celler / sekund, optimal hastighet är ofta hälften. Därför tar varje prov längre tid att köra.

Flera tidningar har nyligen publicerats på färgningen av olika typer av cellprover. ^3,5-7 Syftet med denna artikel är att ge information om korrekt användning av en CyTOF ^TM massa cytometer för att köra prover. Underhåll av nebulisatom genom returspolning med och förvaring i 5% citranox kommer minimeras uppbyggnad av celldebris och metaller, och därigenom minska sannolikheten för träskor. Underhåll av maskinen för optimal prestanda har två delar. Först hjälper rätt inställning (Ström, Smink gas) av maskinen på minst dagligen säkerställa korrekt mätning. Det andra, tillfredsställande tvätt med MilliQ-vatten mellan varje prov och med tvättlösning i slutet av försöken att avlägsna bebyggda organiska och oorganiska skräp hjälper till att minimera bakgrunden i allmänhet och överföringmellan prover. Slutligen har kvaliteten för provberedning en stor inverkan på kvaliteten på datainsamling. Flera tvättar i buffert och slutligen i MilliQ-vatten bidra till att undanröja eventuella metall-bakgrund från interkalatorer eller icke-specifik antikroppsbindning. Korrekt utspädning av cellprovet hjälper balansera optimal upplösning mellan cell händelser samtidigt minimera den totala körtiden per prov. Rätt utspädning hjälper också minimera risken för att orsaka en täppa i nebulisatorn.

Felsökning Vanliga problem

1. Maskinen blir inte förbi "RFG Förbered" steg under uppstart

Under kortet Cage fliken instrumentet Set-up fönster, tryck på "Reset" under RFG. Försök att starta maskinen. Om detta inte löser problemet, stäng programmet, öppna, tryck på "Reset" igen, och försök att starta. Om detta fortfarande inte löser problemet, kontrollera RFG strömbrytaren generatorn brytare på vänster bakre hörnet av maskinen. Om utlöst,flytta till "On", klicka på "Reset", och försöker att starta. Om detta fortfarande inte löser problemet, kontakta DVS.

2. Maskinen stängs medan du kör

1. Kontrollera argon försörjning. Om argontryck når maskinen blir under omkring 40 psi, exekverar mjukvaran en automatisk avstängning.
2. RFG översteg 100W fel. Detta inträffar när effektbehovet för plasma går utanför 1300 + / - 100W fönster, och programvaran utför en automatisk avstängning. Detta orsakas oftast av ojämn spray från nebulisatorn, särskilt stora droppar. Detta kyler alltför plasmat, vilket kräver mer energi för att bibehålla plasmat. Detta kan inträffa på grund av överdriven kraft används för att fästa sprutan slangen till sprutan under byte av sprutpumpen. Detta orsakar en stor spray av droppar, kyla plasmat. Om så är fallet, helt enkelt starta om maskinen.

Detta kan också inträffa på grund av stora droppar som börjarbildas när nebulisatorn börjar täppa. Om detta fel återkommer, ta bort nebulisatorn för rengöring, sätt en ren nebulisator och starta om.

Mycket mindre ofta, kan den tunna provet slangen mellan provslingan och nebulisatorn täppa. Detta kan diagnostiseras genom abnormt låg flödeshastighet av vätska när röret avlägsnas från nebulisatorn. Om så är fallet, flytta den skadade slangen och kopplingar att byggas med färsk slang, och ersätt med en ny nebulisatorn inredning och slangar kit.

3. Inga isotop ränder (eller cell händelser) syns under cellprov förvärv (Figur 8), eller medan du tittar Mass fönster kalibrering flik (figur 3, 4, 9)

1. Kontrollera sprutpumpen. Detta sker ofta på grund av att glömma att slå "play" under byte av sprutpumpen sprutan. Det kan också hända om "paus", snarare än "stopp", träffas under sprutan förändring. "Paus" inte återställer volymen räknaren på sprutpumpen, Och det kommer att stanna vid 3,000 doseras mL, oavsett om flytande lämningar. Slutligen kan sprutan är slut på vatten.
2. Kontrollera provtagningsventil. Se till att ladda prov samtidigt på "Load" och sedan byta till "Inject" precis innan provkörning.
3. Utarmat eller alltför utspädd prov. Du kanske har kört alla dina prov, kontrollera beräkningarna Förvärv tid (se steg 3.3). Alternativt kan du ha räknat fel spädningsfaktorn och / eller förlorade flera celler än väntat under provbearbetning.
4. Igensatt nebulisatorn. Detta brukar föregås av en RFG fel (se Issue 2b), men en täppa kan notiecably minska effektiviteten cellen överföring innan orsakar en avstängning.

Frågor 3c och 3d kan också kontrolleras genom att köra ett prov av EU-innehållande pärlor polystyren kalibrering. De levereras till cirka 1 miljon / ml (virvel väl innan man drar provet!). Därför skulle fylla 450 mikroliter prov slinga ger APcirka 450.000 pärlor. Den CyTOF ^TM-cell överföring effektivitet är maskin-beroende, men cirka 15-30%. Därför skulle 67,500-135,000 pärla händelser förväntas från injektion. Siffror nedan som är förenlig med en täppa i slangen eller nebulisatorn.

Cellen / pärla överföringseffektiviteten är något att testa ibland, att notera eventuella långsiktiga trender.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity