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Biology

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

Published: April 26, 2013 doi: 10.3791/4401
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

Summary

Il pacchetto software 3DNA è un popolare e versatile strumento di bioinformatica con capacità di analizzare, costruire, e visualizzare le strutture di acidi nucleici tridimensionali. Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per un sottoinsieme di nuove e popolari funzionalità disponibili in 3DNA, applicabili ad entrambe le singole strutture e insiemi di strutture correlate.

Abstract

Il pacchetto software 3DNA è un popolare e versatile strumento di bioinformatica con capacità di analizzare, costruire, e visualizzare le strutture di acidi nucleici tridimensionali. Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per un sottoinsieme di nuove e popolari funzionalità disponibili in 3DNA, applicabili ad entrambe le singole strutture e insiemi di strutture correlate. Protocollo 1 elenca la serie di istruzioni necessarie per scaricare e installare il software. Questo è seguito, nel protocollo 2, dall'analisi di struttura di acido nucleico, compreso l'inserimento di coppie di basi e la determinazione dei parametri di corpo rigido che descrivono la struttura e, nel protocollo 3, da una descrizione della ricostruzione di un atomico modello di una struttura da suoi parametri del corpo rigido. La versione più recente di 3DNA, versione 2.1, presenta nuove funzionalità per l'analisi e la manipolazione di insiemi di strutture, come quelle dedotte da Resonance (NMR) misure magnetiche nucleari e dinamica molecolare (MDSimulazioni); queste caratteristiche sono presentati in protocolli 4 e 5. In aggiunta al pacchetto software stand-alone 3DNA, il server web w3DNA, situato a http://w3dna.rutgers.edu , fornisce un'interfaccia user-friendly per le caratteristiche selezionate del software. Protocollo 6 viene illustrata una funzionalità romanzo del sito per la costruzione di modelli di lunghe molecole di DNA decorate con proteine ​​legate alle posizioni specificate dall'utente.

Introduction

Comprendere le strutture tridimensionali di DNA, RNA e loro complessi con proteine, farmaci e altri ligandi, è cruciale per decifrare le loro diverse funzioni biologiche, e per permettere la progettazione razionale di terapeutica. Esplorazione di tali strutture comporta tre componenti separati, ma strettamente connessi: analisi (per estrarre i modelli in forme e interazioni), modelli (per la valutazione energetica e dinamica molecolare), e visualizzazione. Analisi strutturale e la costruzione del modello sono essenzialmente due facce della stessa medaglia, e la visualizzazione complementi entrambi.

La suite 3DNA dei programmi del computer è sempre più popolare toolkit bioinformatica strutturale con capacità di analizzare, costruire, e visualizzare le strutture di acidi nucleici tridimensionali. Precedenti pubblicazioni illustrate le funzionalità del software 1, a condizione che le ricette di svolgere attività selezionate 2, ha introdotto l'interfaccia web-baseda caratteristiche popolari del software 3, banche dati presentati di caratteristiche strutturali raccolti utilizzando 3DNA 4, 5 e illustrata l'utilità del software nella analisi sia DNA e strutture di RNA 6, 7.

L'obiettivo di questo articolo è quello di portare il kit software 3DNA di scienziati di laboratorio e altri con interessi e / o necessità di indagare il DNA e l'RNA organizzazione spaziale con strumenti di calcolo state-of-the-art. I protocolli presentati qui sono le istruzioni passo-passo (i) per scaricare e installare il software su un sistema Mac OS X, (ii-iii) analizzare e modificare le strutture del DNA a livello del componente passaggi di base-pair, ( iv-v) per analizzare e allineare insiemi di strutture relative al DNA, e (vi) per la costruzione di modelli di catene di DNA proteina-decorato con l'intuitiva interfaccia web w3DNA. Il software ha la capacità di analizzare singole strutture risolti utilizzando metodi cristallografici a raggi X e grandiinsiemi di strutture determinate con metodi di risonanza magnetica nucleare (NMR) o generati mediante tecniche di simulazione al computer.

Le strutture qui esaminate comprendono (i) la struttura cristallina ad alta risoluzione di DNA legato alla proteina Hbb da Borrelia burgdorferi 8 (il batterio zecche che causa la malattia di Lyme negli esseri umani 9, 10), (ii) due grandi insiemi di sequenza molecole correlate DNA prodotte con simulazioni molecolari 11 - 4.500 istantanee di d (GGCAAAATTTTGCC) 2 e d (CCGTTTTAAAACGG) 2 raccolti a incrementi di 100 PSEC durante i calcoli, e (iii) un piccolo ensemble di strutture NMR basati dell'operatore DNA O3 legato alle testate del Escherichia coli Lac repressore proteico 12. Le istruzioni riportate di seguito includono informazioni su come accedere ai file di coordinate atomiche associate a ciascuna di queste strutture, nonché come utilizzare 3DNA (una copia di questo file viene trovatosul forum 3DNA a http://forum.x3dna.org/jove ) per esaminare e modificare queste strutture.

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Protocol

1. L'installazione del pacchetto software

  1. Collegarsi al sito 3DNA a http://x3dna.org e clicca sul link per il Forum 3DNA. All'interno del Forum di selezionare il 'registro' link e seguire le istruzioni per creare un nuovo account.
  2. Le seguenti istruzioni di montaggio dettaglio del software su un computer basato su X Macintosh OS con un default 'bash' shell. La procedura per i sistemi Linux o Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) con conchiglie comunemente usati (tra cui 'tcsh') si trova all'interno del Forum 3DNA.
  3. Una volta che avete stabilito un nome utente e una password, accedere al forum. Seleziona il link "Download" nella sezione di benvenuto e sulla nuova pagina scegliere '3 DNA scaricare '. Questo vi porterà alla pagina di download 3DNA dove le varie versioni del software possono essere scaricati.
  4. Selezionare il collegamento Intel Mac OS X per scaricare un file tarball compresso (tar.gz) contenente il software.
  5. Doppio click sul file (tar.gz) per creare una cartella denominata x3dna-v2.1. Questa cartella, che contiene la suite software 3DNA, può essere spostato in qualsiasi posizione. Ai fini di questa ricetta, abbiamo trascinarlo nella directory 'Applications'. In questa fase si è finito con il file tar.gz e possibile eliminarlo.
  6. Apri l'applicazione Terminale, in genere si trova sotto 'Utilities', e passare alla directory x3dna-v2.1 creato nel passaggio 5 con il seguente comando (finita qui e in tutte le istruzioni riportate di seguito da un ritorno a capo):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Eseguire lo script di installazione necessario per 3DNA di funzionare correttamente digitando:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Copiare le impostazioni di due linee di esportazione stampata al passo 7. Se l'utente ha inserito il software nella directory "Applicazioni", le due linee dovrebbero apparire come segue:
    export X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    Una parola diversa oltre a "Applicazioni" si APPEar nel comando di esportazione, se l'utente ha scelto di installare il software in una directory diversa. Questo nome directory alternativa sostituirà 'Applicazioni' nei due comandi precedenti. Si noti che se la shell di default è 'tcsh' invece di 'bash', il contenuto delle due linee sarebbe: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 e setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Arrivo 'Finder' per vedere se un file di nome '. Bashrc' esiste già sul computer.
  10. Aprire l'applicazione TextEdit trovato nella directory "Applicazioni" e selezionare 'Solo testo' sotto il menù 'Formato'.
  11. Se il file '. Bashrc' dal punto 9 esiste, aprire il file in TextEdit e incollare le impostazioni di esportazione dal punto 8 alla fine del file. Se no '. Bashrc' di file esce, incollare le impostazioni di esportazione dal punto 8 in un file vuoto e salvarlo con il nome del file '. Bashrc' nella vostra home directory. (La home directory è indicata da una icona di 'casa' su Macintosh.)
  12. Affinché le nuove impostazioni be disponibile, è necessario eseguire il file 'bashrc.' appena salvata usando il seguente comando all'interno del programma Terminal:
    source ~ /. bashrc
  13. La suite 3DNA è ora installato sul vostro sistema ed è possibile eseguire protocolli 2-5 all'interno del programma Terminal. Protocollo 6 viene eseguita utilizzando w3DNA, un'interfaccia web per le caratteristiche selezionate del software 3DNA.

2. Analisi di una struttura di cristallo

  1. Illustriamo l'analisi della struttura di acido nucleico utilizzando il DNA legato alla proteina Hbb da Borrelia burgdorferi 8. Il file di coordinate atomiche associati a questa struttura può essere trovata nella Protein Data Bank 13 (PPB; http://www.rcsb.org ), dove viene assegnato l'identificatore 2np2 strutturale. Gli accompagnatori dati supplementari includono una copia di questo file, che può anche essere trovato sul Forum 3DNA a http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Il primo passo nell'analisi 3DNA della struttura è la creazione di un file che elenca tutte le basi accoppiati. Questo viene fatto con il programma 'find_pair' digitando il seguente:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Qui 2np2.pdb è il file di input di coordinate atomiche sopra descritte e 2np2.bps è il file di testo di output che contiene le informazioni di base-pairing. Il file di base-pair quest'ultimo può essere esaminato e modificato dall'utente, se necessario.
  3. Il prossimo passo per l'analisi è quello di determinare i parametri geometrici che caratterizzano la struttura. Questi includono standard di angoli di torsione chimici 14, angoli pseudorotazione che descrivono il puckering dell'anello zucchero 15, parametri di corpo rigido che specifica le modalità di basi e di coppie di basi successive 16, e le altre misure di struttura chimica tridimensionale. Il comando 'analizzare' prende come input il file base-pair generato nel passaggio 2 e crea diverse oufile tput, che compaiono nella directory di lavoro. Questi valori sono calcolati digitando il seguente comando:
    analizzare 2np2.bps
    I file di output utilizzati qui sono 2np2.out, che contiene una panoramica dei parametri calcolati, e bp_step.par, che contiene un elenco dei corpi rigidi parametri sopra descritti. Quest'ultimo file può essere letto facilmente in un programma di foglio di calcolo per ulteriori analisi e la stampa. Vedere Rappresentante Risultati (Figura 1) per un esempio.

3. Costruzione di una struttura del DNA da rigidi parametri-corpo

  1. Oltre all'analisi di una struttura nucleico-acido, il software 3DNA fornisce la possibilità di costruire un modello strutturale da parametri corpo rigido utilizzando il comando 'ricostruzione'. In questo protocollo si mostra come costruire due modelli di DNA elicoidali, prima utilizzando i parametri del corpo rigido dal complesso Hbb-DNA come calcolato nel protocollo 2 e quindi utilizzando una serie di parametri modificati in wuali angoli di rollio selezionati vengono modificati. L'angolo di rollio misura il grado di flessione delle coppie di basi successive nelle scanalature del DNA 16. Valori positivi di rotolo sono associati con il restringimento del solco maggiore e valori negativi con il restringimento del solco minore. La cornice di riferimento standard 17 adottata dal popolare software di analisi degli acidi nucleici 3DNA e altri, ad esempio Curve + 18, assicura consistenza numerica dei parametri calcolati di coppie di basi Watson-Crick.
  2. Per impostazione predefinita, la funzione 3DNA 'ricostruzione' creerà modelli atomici esatte che contengono solo le coordinate degli atomi nelle basi azotate. Al fine di creare un modello atomico approssimativa, che include le coordinate sia da spina dorsale e gli atomi di base, digitare il seguente comando:
    x3dna_utils cp_std bDNA
    Questo comando 3DNA di introdurre un B-DNA backbone conformazione standard nella costruzione di modelli da parametri del corpo rigido.
  3. Per build un modello a doppia elica con i parametri rigido-corpo trovato nella struttura Hbb-DNA, digitare quanto segue:
    ricostruire-atomica bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Qui '-atomico' specifica la costruzione di un modello tutto-atomo con le coordinate atomiche per tutti (non-idrogeno) atomi pesanti, 'bp_step.par' è il file generato al punto 3 del protocollo 2, che contiene i parametri di corpo rigido immessi , e '2 np2_rbld_org.pdb 'è il file di uscita con le coordinate atomiche della struttura creata. Quest'ultimo file è formattato secondo le specifiche del PPB e termina così con '. PDB'.
  4. Il file 'bp_step.par' può essere modificato per generare una struttura modificata. Su un computer Macintosh, le modifiche possono essere eseguite utilizzando l'applicazione TextEdit, come descritto nel protocollo 1 Fase 10.
  5. Qui modifichiamo gli angoli di rollio estreme formate nei due siti di maggior curvatura. I valori, espressi in gradi, vengono modificate a zero da valori di 64.95 in linea 17 e 60.93 In linea 26. Salviamo il file modificato con un nuovo nome, 'bp_step_roll0.par', e chiudere il programma TextEdit.
  6. Costruiamo la struttura, come nel passo 3, con il set di parametri modificati passo come file di input digitando:
    ricostruire-atomica bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. I due modelli possono essere visualizzati in un visualizzatore molecolare standard, come PyMOL ( www.pymol.org ), utilizzando i file generati (coordinate. pdb) come input. Vedere Rappresentante Risultati (Figura 2) per le immagini delle strutture ricostruite.

4. Analisi del Multi-modello Files Struttura

  1. Contrariamente al protocollo 2, nella quale si analizza una singola struttura nucleico contenente acido, qui vi mostriamo come analizzare un grande insieme di strutture. Esaminiamo la variazione nel tempo dei parametri di corpo rigido lungo una serie di 14 paia di basi catene di DNA ottenuti da-dinamica molecolare (MD) simulazioni 11 http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Il primo passo nell'analisi è lo stesso di quello effettuato nel protocollo 2, l'identificazione delle basi accoppiate eseguendo il programma 'find_pair'. Dal momento che l'intero insieme di strutture condivide lo stesso schema di base-pairing uno ha bisogno di correre 'find_pair' solo una volta su un file rappresentativo. Qui scegliamo la struttura 1001 nella simulazione di catene di DNA contenente una centrale AT passo, con il nome del file md_AT_set1.pdb.1001. Seguenti generi di istruzionites le informazioni di base-accoppiamento e la memorizza nel file md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    L'utente può esaminare la base individuata paring e apportare modifiche manuali al file in base alla conoscenza della struttura.
  3. Il passo successivo è quello di determinare i parametri geometrici dell'intero insieme di strutture utilizzando il 'x3dna_ensemble analizzare' comando. Il programma utilizza come input il file base-pair generato nella Fase 2 (md_AT_set1.bps) così come un file contenente una lista delle strutture da analizzare. L'ultimo file, qui chiamato md_AT_set1.list, contiene le 4.500 file da analizzare, con i nomi dei file inseriti su righe nell'ordine generato dalla simulazione MD. Una copia di questo file è incluso nel materiale supplementare e anche offerto al Forum 3DNA. L'utente deve essere avvertito, a causa del gran numero di file, che il tempo di calcolo può essere lunga (~ 20 min per 1.000 file su un processore AMD Phenom II X4 965). Thcomando e viene eseguito digitando il seguente:
    x3dna_ensemble analizzare-b md_AT_set1.bps-l-o md_AT_set1.list md_AT_set1.out
    Nell'esempio di cui sopra si riferisce '-b' per il file di base-pair creato al passaggio 2, '-l' specifica che un elenco di file è dato, e '-o' permette all'utente di assegnare un nome al file di output. Ci sono molte opzioni che possono essere utilizzate in combinazione con il comando 'x3dna_ensemble analizzare', come la selezione di modelli specifici. L'utente può digitare 'x3dna_ensemble analizzare-h' per ottenere ulteriori informazioni su queste opzioni.
  4. Il passo successivo è quello di estrarre i parametri del corpo rigido desiderati dal file di output panoramica, md_AT_set1.out, generato nel passaggio 3. Questa operazione viene eseguita utilizzando il comando 'estratto x3dna_ensemble'. Un elenco di parametri geometrici disponibili può essere trovata digitando 'x3dna_ensemble estratto-l'. Qui si estrae gli angoli di rollio e creiamo un file di testo separato da virgole (CSV) di angoli di rollio con il seguente comando:
    x3dna_ensemble estratto-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    Il 'roll-p' in questo comando specifica il parametro da estrarre, il '-s,' indica un file separato da virgole, '-f' indica il file di output ottenuto dalla Ensemble comando analizzare, e il '-o 'permette all'utente di assegnare un nome al file di output CSV di angoli di rollio lungo il DNA in tutte le strutture analizzate. Questo file può essere letto in altri programmi per ulteriori analisi e la stampa. Vedere Rappresentante Risultati (Figura 3) per l'analisi della variazione dei rotoli nei due dataset MD-generated sopra descritte e il Forum 3DNA per lo script MATLAB utilizzato per generare queste immagini.

5. Sovrapposizione di strutture multi-modello su un sistema di riferimento comune

  1. La versione più recente di 3DNA (versione 2.1) è una nuova funzionalità che consente agli utenti di guardare più strutture da un punto di vista comune. Il 'x3dna_ensemble riorientare' comando sovrappone una raccolta di structur correlaties su una coppia di base comune o step base-coppia. Il seguente protocollo si applica questa funzionalità per le strutture NMR-derivati ​​del gestore DNA O3 legato alle testate del repressore lac proteine ​​12. Queste strutture sono conservati presso il PPB sotto la 2kek identificatore in un file strutturale multi-modello, che contiene tutti i modelli di struttura in un unico file, al contrario di file separati, come quelli utilizzati per ciascuno dei 4.500 modelli nel protocollo 4. Gli accompagnatori dati supplementari includono una copia di questo file, che può anche essere trovato sul Forum 3DNA a http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Come nei precedenti protocolli, il primo passo è calcolare l'appaiamento delle basi del DNA con il programma 'find_pair'. In questo caso si usa come input il file kek.pdb '2 'e digitare quanto segue:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    L'abbinamento di base viene generato utilizzando il primo modello nel file PDB. Correzioni manuali al b outputtedfile di ase-pair, '2 kek.bps ', può essere fatta sulla base della conoscenza della struttura.
  3. Il programma 'x3dna_ensemble riorientare' sarà allineare i singoli modelli in una struttura multi-modello in un sistema di riferimento comune. Questo programma richiede sia il file PDB e il file base-pairing dal passo precedente come input e viene eseguito con il seguente comando:
    x3dna_ensemble riorientare-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    Qui opzione '-b' specifica il file base-associazione il '-f 1' indica la coppia di basi su cui sono allineate tutte le strutture, in questo caso 1 coppia di basi alla estremità 5 'del filamento sequenza-cuscinetto, il '-e' specifica il file insieme di input, e il '-o' permette all'utente di fornire il nome di un file di output, in questo caso kek_fr1.pdb '2 '. Maggiori informazioni sulle opzioni di comando può essere ottenuto digitando 'x3dna_ensemble riorientare-h'. Vedere Rappresentante Risultati (Figura 4) per la discussione delle strutture allineate.

6. Construction di una proteina-decorato molecola di DNA

  1. L'interfaccia web w3DNA include alcune caratteristiche popolari del pacchetto software 3DNA. Qui richiamiamo l'attenzione alla capacità di costruire modelli tridimensionali di proteine-DNA decorato con il server web. I frammenti di DNA legato adottano i parametri del corpo rigido dei complessi proteina-DNA selezionati, qui i valori del DNA legato alla proteina Hbb analizzati nel protocollo 2. Le regioni non legate di DNA possono adottare una delle tre forme elicoidali selezionati dall'utente (A, B, o C). A, B, e C si riferiscono a tre modelli canonici di DNA, ottenuti dai primi esperimenti di diffrazione di fibre, rispettivamente con 11, 10 e 9 coppie di basi per giro della doppia elica 19-21.
  2. Il primo passo nella costruzione di un modello di DNA proteina-decorata è quello di visitare il sito web w3DNA situato a http://w3dna.rutgers.edu . Selezione di 'ricostruzione' dal menu in alto a sinistra della pagina actiVates le capacità di costruzione di modelli in linea.
  3. Il passo successivo è quello di selezionare il link 'modello di proteina-DNA Bound' trovato nella scatola leggermente ombreggiata al centro della nuova pagina. Questa selezione attiverà un menu a tendina, che consente all'utente di specificare il numero di proteine ​​legate. Qui selezioniamo due proteine ​​legate e cliccare sul pulsante 'Continua'. Si noti che i modelli hanno dimensioni limitate a 1.000 coppie di basi, o 2.000 nucleotidi, e trenta proteine ​​legate.
  4. Selezione del numero di proteine ​​legate a una pagina specifica simile a quella mostrata in Figura 5. Questa pagina consente all'utente di specificare la sequenza di DNA, la forma elicoidale del DNA non legato, e le identità e le posizioni delle proteine ​​legate.
  5. L'utente o paste nella sequenza desiderata nella casella di testo al centro della pagina specifica (Figura 5, etichetta 1). Nota soltanto i residui standard - A, T, C, G e U - sono accettati. Qui si entra in un 81 base-coppia homopolymer, composta interamente da A · coppie di T con la A nel filone sequenza-cuscinetto.
  6. C'è un menu a discesa (Figura 5, Etichetta 2), sotto la casella di testo, per selezionare la conformazione elicoidale delle regioni legate di DNA. In questo esempio abbiamo scelto il B-modulo conformazione.
  7. Vi è una casella di testo nella parte inferiore della pagina specifica per immettere la posizione di rilegatura (s) e il nome del file (s) della proteina legata (s) (figura 5, Label 3). La posizione di rilegatura specifica la posizione del centro del frammento legata alle proteine ​​sulla sequenza di DNA. Se il DNA legato contiene un numero dispari di coppie di basi, come nella struttura Hbb-DNA, la posizione di rilegatura denota la posizione della coppia di basi mezzo del frammento. Nel caso del DNA Hbb-bound, questa coppia di basi centrale è una T · T mispair. In questo esempio, dove leghiamo due copie della proteina Hbb al DNA stampo, la coppia T · T è collocato nelle posizioni 20 e 63 del 81 coppie di basi del DNA SEsequenza. Si noti che la sequenza del frammento legato non deve coincidere con quello indicato nella Fase 5. Se la regione legata alle proteine ​​contiene un numero pari di coppie di basi, la posizione di rilegatura indica la posizione di passo base-coppia centrale sul DNA. Cioè, il passo base-coppia centrale del frammento legato viene collocato tra base paia ne n +1, dove n è il numero specificato lungo il segmento. Notare anche che l'utente può decorare il DNA con ogni proteina purché la struttura del suo complesso con il DNA è conosciuto e memorizzati in formato PDB standard di 13.
  8. Nella parte inferiore della pagina specifica c'è una casella che permette all'utente di generare una anteprima del DNA legata alle proteine ​​(Figura 5, Etichetta 4). Qui controlliamo che dialogo e fare clic sul pulsante 'Continua'. Questa azione genera una pagina di recensione che elenca i parametri selezionati, nonché eventuali errori che potrebbero sorgere dalla sovrapposizione dei siti di legame selezionati. L'utente può sezionare il pulsante 'Indietro' se le modifiche devono essere fatte o il pulsante 'Build' per procedere.
  9. La pagina successiva visualizza un'immagine statica del complesso DNA-proteina nella sua disposizione più estesa e consente la visualizzazione interattiva on-line tramite Jmol e Webmol. L'utente può anche scaricare un file di coordinate (. Pdb) che è formattato in conformità con le specifiche del progetto preliminare di bilancio. Questo viene fatto selezionando la 'Scarica il file PDB ricostruita' link qui sotto l'immagine generata. Quest'ultimo file può essere letto facilmente in un programma di grafica molecolare per l'ulteriore visualizzazione. Guarda i risultati rappresentativi (Figura 6) per esempi del DNA Hbb-decorato descritto sopra e una catena leggermente più lungo (86 paia di basi) con la Hbb centrato nelle posizioni 20 e 67.

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Representative Results

Gli strumenti software 3DNA sono abitualmente utilizzati per analizzare le strutture di acidi nucleici. Per esempio, le identità di coppie di basi e dei parametri del corpo rigido che caratterizzano le modalità di basi in frammenti a doppia elica del DNA e strutture di RNA vengono calcolati e memorizzati automaticamente per ogni nuova voce nella Nucleic Acid Database 22, un repository mondiale di Acido nucleico informazioni strutturali. I valori dei parametri del corpo rigido determinate con protocollo 2 prontamente rivelano distorsioni nella struttura tridimensionale, come ad esempio i due siti del DNA estrema flessione nel solco maggiore, con grandi angoli di rollio positivi (64,95 ° e 60,93 °), disponibile sul AT AT · i passaggi 13 e 22 nel complesso cristallo con la Borrelia burgdorferi Hbb proteina 8 (Figura 1).

La capacità del software di ricostruire le strutture di queste quantità con protocollo 3 permette di determinare il modo inBase dividuale e passaggi di base a coppie contribuiscono alla piega molecolare complessiva. Come illustrato in figura 2, la curvatura globale del DNA indotto da Hbb riflette più di due rulli distorsioni estreme di cui sopra. Cioè, il DNA rimane altamente curvo quando ricostruito con questi passaggi di base a coppie raddrizzata, cioè con angoli di rollio nullo nei due siti. La stessa tecnica precedentemente ha rivelato i contributi di specifiche fasi di paia di basi e deformazioni in campo allo superelicoidale del DNA avvolto sulla superficie del nucleo nucleosoma particella 6 ed alla larghezza del solco minore del DNA legato al nucleoide batterico- associati Fis proteine ​​23.

La nuova funzionalità in 3DNA, descritto nel protocollo 4, di esaminare un gran numero di strutture correlate consente di estrarre sia la sequenza-e modelli dipendenti dal tempo nelle disposizioni spaziali di DNA simulato e molecole di RNA. Ad esempio, il (giallo) colo-codifica degli angoli rotolo tra coppie di basi successive due grandi insiemi di DNA strutture simulate 11 rivela la piegatura preferenziale di queste molecole a pirimidina-purina passi paia di basi (Figura 3). I valori più elevati di rotolo, raffigurati in rosso, che persistono per brevi periodi alle estremità del DNA sono suggestivi di fusione localizzata e reannealing della struttura a doppia elica. I modelli variazionali di altri parametri del corpo rigido, come gli angoli e le distanze tra basi complementari, possono aiutare a decifrare le distorsioni strutturali precise.

La capacità del software 3DNA, presentato nel protocollo 5, di riorientare le molecole correlate in una cornice di riferimento comune, rivela caratteristiche della struttura complessiva nascosti in molti dei file memorizzati nel PPB. Per esempio, l'allineamento convenzionale di strutture correlate sulla base di una misura radice quadrata media dei corrispondenti atomi produce una serie di analoghi percorsi spaziali tcappello di circa sovrapporre l'una sull'altra, ecco i dieci modelli NMR basati dell'operatore DNA O3 legati alle testate del repressore lac proteina 12 (figura 4 a sinistra). La sovrapposizione delle stesse strutture su un telaio coordinate comune sulla coppia di basi 5'-terminale di ciascuna duplex rivela distorsioni considerevole di struttura globale, in cui le molecole flettono in direzioni sensibilmente diverse (Figura 4 a destra). La variabilità strutturale può influenzare la facilità con cui la proteina repressore Lac coli Escherichia lega O3 e induce un ciclo tra O3 e operatori sequenzialmente distanti nel operone lac 24.

La procedura descritta nel protocollo 6, per la costruzione di modelli di frammenti di DNA lunghi decorati in siti arbitrari con le proteine ​​e gli altri ligandi, aggiunge una nuova prospettiva l'organizzazione di grandi assiemi macromolecolari. Tali modelli aiutano a capire come i complessi multi-molecolariinteragire durante la lavorazione biologica. Come illustrato in figura 6, il posizionamento preciso di una proteina architettonico come Hbb può avere un effetto drammatico sul ripiegamento globale del DNA. Se due copie della struttura ad alta risoluzione noto 8 sono separati da 43 coppie di basi, un frammento di DNA 81-base-pair chiude in una, stretta configurazione quasi chiusa. Se le due proteine ​​sono separate da un ulteriore cinque coppie di basi, il DNA segue un aperto, percorso tortuoso. I molto diverse disposizioni dello spettacolo duplex proteina-decorato come la spaziatura delle proteine ​​architettoniche possono influenzare la ciclizzazione o loop di DNA 25, 26.

Figura 1
Figura 1. Variazione dell'angolo di rollio tra coppie di basi successive (vedi inserto per la rappresentazione visiva) lungo il DNA chain legato alla proteina Hbb da Borrelia burgdorferi 8. Valori ottenuti utilizzando il comando 'analizzare' di 3DNA ei dati strutturali descritte nel protocollo 2. Notare i valori estremi del rotolo alla AT gradini che delimitano il terzo centrale della struttura.

Figura 2
Figura 2. Approssimative modelli atomici di DNA costruito utilizzando la funzione di 'ricostruire' di 3DNA e reso in PyMOL con atomi colorati (C-ciano; N-azzurro, O-rosso, P-gold). Modelli basati su (a sinistra) i parametri del passo del corpo rigido della proteina Hbb e (a destra) un insieme modificato di parametri di passo, in cui i due più grandi valori del rotolo sono stati impostati a zero. Per le istruzioni passo-passo Vedere protocollo 3 . Notare il dispiegarsi di DNA indotti dai cambiamenti imposti in rotolo.


Figura 3. Immagini mosaico della angoli di rollio lungo il DNA in due insiemi di strutture simulate 11. Valori del rotolo, estratti utilizzando il protocollo 4, sono a colori dal blu al rosso nel range [-5 °, 20 °]. Notare l'ordine inverso di basi e di grandi valori del rotolo, evidenziato dal colore giallo / rosso colonne, che si verificano in fasi pirimidina-purina nei due 14 paia di basi sequenze auto-complementari.

Figura 4
Figura 4. Immagini dei cartoni animati dei modelli di DNA presenti nelle strutture NMR-derivati ​​del gestore DNA O3 con i repressore lac copricapo proteine ​​12 illustrative delle capacitàdei 'x3dna_ensemble Riorientare' comando. Immagini resi in PyMOL (dorsali mostrano come tubi d'oro e basi come bastoni blu) e allineata con (a sinistra), le coordinate del PDB (2kek) e (a destra) la sovrapposizione strutturale presentato nel protocollo 5 . Si notino le grandi differenze tra le strutture, quando sono immessi in un sistema di riferimento comune in coppia di basi 5'-terminale.

Figura 5
Figura 5. Screen shot dal server web w3DNA illustrano specifiche della sequenza di DNA (etichetta 1), la forma elicoidale del DNA non legato (Etichetta 2), le posizioni e le identità delle proteine ​​(etichetta 3), e la casella di controllo Immagine anteprima (etichetta 4) descritto nel protocollo 6. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6
Figura 6. Approssimative modelli atomici di due proteine ​​HBB 8 legati ad un frammento di DNA lungo. Strutture create con il server web w3DNA come descritto nel protocollo 6 e reso in PyMOL. Le catene proteiche sono indicati con il nastro viola, mentre il DNA è di colore codificato per atomo di tipo (C-ciano; N-azzurro, O-rosso, P-gold). La coppia base centrale di ogni siti di legame della proteina è fissato a posizioni (sinistra) 20 e 62 lungo la catena del DNA coppia di basi 81 e (destra) 20 e 67 lungo la coppia di basi catena del DNA 86. Notare il forte cambiamento del ripiegamento delle strutture correlate alla crescente (cinque base-pair) spostamento dei due proteine.

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Discussion

L'insieme dei protocolli presentati in questo articolo toccare solo dalle capacità della suite 3DNA dei programmi. Gli strumenti possono essere applicati a RNA strutture per identificare coppie di basi non canonici, per determinare i contesti strutturali secondari in cui si verifica tale accoppiamento, per quantificare la disposizione spaziale dei frammenti elicoidali, per misurare la sovrapposizione delle basi lungo la catena dorsale, ecc Il comando ricostruzione permette all'utente di costruire rappresentazioni blocco semplici e informativo di basi e paia di basi, come quello mostrato nel riquadro alla Figura 1. Gli strumenti di costruzione comprendono anche funzioni di "filo" sequenze diverse di un determinato modello strutturale, per generare modelli di numerose strutture di DNA a doppio, triplo, e quattro-stranded, ai modelli di orientare in una direzione specifica, ecc Infine, 3DNA ha svolto un ruolo significativo in una serie di altri progetti, come ad esempio: il servizio web solvatazione SwS per gli acidi nucleici 27, il server web per la ARTSallineamento RNA strutture terziarie 28, lo strumento MDDNA web-based per l'analisi dei risultati di dinamica molecolare e predizione struttura 29; l'eglefino information-driven attracco metodo proteina-DNA 30, il server SARA per la funzione di annotazione di strutture di RNA 31; la 3D- DART DNA server di modellazione della struttura 32; nel database 3D-impronta per l'analisi strutturale di complessi proteina-DNA 33; l'RNA FRABASE database di 2.0 per l'identificazione di frammenti tridimensionali all'interno di strutture di RNA 34, e il server web SETTER per il confronto a coppie di strutture di RNA 35. Per quanto a nostra conoscenza, non esiste attualmente nessun altro pacchetto software struttura nucleico-acido con una vasta combinazione di caratteristiche comparabili e il record robusta performance del 3DNA.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Siamo grati a Sponer Jiří per condividere le coordinate di doppie eliche di DNA generati in simulazioni di dinamica molecolare. Riconosciamo anche Nada Špačková per l'assistenza nel download di queste strutture. Sostegno di questo lavoro attraverso USPHS Assegni di ricerca GM34809 e GM096889 Si ringrazia.

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