Analysere og Building nukleinsyrestrukturer med 3DNA

Summary

Den 3DNA softwarepakke er en alsidig og populær bioinformatik værktøj med kapaciteter til at analysere, konstruere og visualisere tredimensionale nukleinsyrestrukturer. Denne artikel præsenterer detaljerede protokoller for en delmængde af nye og populære funktioner i 3DNA, der gælder for både individuelle strukturer og ensembler af relaterede strukturer.

Abstract

Den 3DNA softwarepakke er en alsidig og populær bioinformatik værktøj med kapaciteter til at analysere, konstruere og visualisere tredimensionale nukleinsyrestrukturer. Denne artikel præsenterer detaljerede protokoller for en delmængde af nye og populære funktioner i 3DNA, der gælder for både individuelle strukturer og ensembler af relaterede strukturer. Protokol 1 viser det sæt af instruktioner, der er nødvendige for at downloade og installere softwaren. Dette følges, i protokol 2, til analyse af en nukleinsyre struktur, herunder tildeling af basepar og bestemmelse af stive-krop parametre, der beskriver strukturen, og i protokol 3, med en beskrivelse af genopbygningen af ​​en atomar model af en struktur fra dens stive kropsparametre. Den seneste version af 3DNA, version 2.1, har nye funktioner til analyse og manipulation af ensembler af strukturer, såsom dem udledes kernemagnetisk resonans (NMR) målinger og molekylær dynamik (MD) Simuleringer, disse funktioner er præsenteret i protokol 4 og 5. Ud over den 3DNA stand-alone-software pakken, w3DNA webserveren, placeret på http://w3dna.rutgers.edu tilvejebringer en brugervenlig grænseflade til udvalgte funktioner i softwaren. Protokol 6 viser en roman træk ved webstedet for at bygge modeller af lange DNA-molekyler dekoreret med bundne proteiner bruger-angivne steder.

Introduction

Forståelse af de tre-dimensionelle strukturer af DNA, RNA og deres komplekser med proteiner, narkotika og andre ligander, er afgørende for at decifrere deres forskellige biologiske funktioner, og som giver mulighed rationelt design af lægemidler. Udforskning af sådanne strukturer indebærer tre separate, men nært beslægtede komponenter: analyse (for at udvinde mønstre i figurer og interaktioner), modellering (at vurdere energetik og molekylær dynamik), og visualisering. Strukturel analyse og model bygning er grundlæggende to sider af samme mønt, og visualisering supplerer dem begge.

Den 3DNA suite af edb-programmer er en stadig mere populær strukturel bioinformatik værktøjskasse med kapaciteter til at analysere, konstruere, og visualisere tredimensionelle nukleinsyrestrukturer. Tidligere publikationer skitseret mulighederne i softwaren ^1, forudsat opskrifter til at udføre udvalgte opgaver ^2, indførte den web-baserede brugerfladetil populære funktioner i softwaren ^3, indsamlet præsenteret databaser af strukturelle træk ved hjælp 3DNA ^{4, 5} og illustreret nytten af softwaren i analysen af både DNA og RNA-strukturer ^{6, 7.}

Målet med denne artikel er at bringe 3DNA software kit til at laboranter og andre med interesser og / eller behov for at undersøge DNA og RNA rumlig organisation med state-of-the-art beregningsværktøjer. De protokoller, der præsenteres her, inkluderer trin-for-trin instruktioner (i) at downloade og installere softwaren på en Mac OS X-system, (ii-iii) at analysere og ændre DNA strukturer på niveau med de indgående basepar trin, ( iv-v) at analysere og tilpasse sæt af relaterede DNA strukturer, og (vi) at konstruere modeller for protein-dekoreret DNA kæder med den brugervenlige w3DNA web interface. Den software har evnen til at analysere de enkelte strukturer løses ved hjælp røntgenkrystallografiske metoder samt storensembler af konstruktioner bestemt med kernemagnetisk resonans (NMR) metoder eller genereret af computer-simulering teknikker.

Strukturerne undersøgte her omfatter (i) høj opløsning krystalstruktur af DNA bundet til Hbb protein fra Borrelia burgdorferi ⁸ (tick-bårne bakterie, der forårsager Lyme sygdom hos mennesker ^{9, 10),} (ii) to store sæt sekventielt relaterede DNA-molekyler fremstillet med molekylære simuleringer ¹¹ - 4.500 snapshots af d (GGCAAAATTTTGCC) ₂ og d (CCGTTTTAAAACGG) ₂ opsamlet i 100 psec intervaller for beregningerne, og (iii) en lille ensemble af NMR-baserede strukturer O3 DNA operatør bundet til headpieces af Escherichia coli Lac repressorproteinet ^12. Instruktionerne nedenfor indeholde oplysninger om, hvordan du får adgang til filer af atomkoordinater forbundet med hver af disse strukturer samt hvordan man bruger 3DNA (en kopi af denne fil er fundetpå 3DNA forum på http://forum.x3dna.org/jove ) at undersøge og ændre disse strukturer.

Protocol

1.. Installation af softwarepakke

1. Tilslut til 3DNA hjemmeside på http://x3dna.org og klik på linket til 3DNA Forum. Inden forummet vælge 'register' linket og følg anvisningerne for at oprette en ny konto.
2. Følgende anvisninger detalje installation af softwaren på en OS X-baseret Macintosh-computer med et default 'bash' shell. Proceduren for Linux eller Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) systemer med almindeligt anvendte skaller (herunder "tcsh ') findes i den 3DNA Forum.
3. Når du har oprettet et brugernavn og en adgangskode, skal du logge ind i forummet. Vælg 'Downloads' linket i Velkommen sektion og på den nye side vælger '3 DNA download '. Dette vil bringe dig til den 3DNA download side, hvor forskellige versioner af softwaren kan downloades.
4. Vælg Mac OS X Intel link til at downloade en komprimeret tarball fil (tar.gz), der indeholder softwaren.
5. Dobbelt klikk på (tar.gz-fil) til at oprette en mappe med navnet x3dna-v2.1. Denne mappe, som indeholder 3DNA softwarepakke, kan flyttes til ethvert sted. Med henblik på denne opskrift, skal du trække vi og slippe den ind i de 'Applications' bibliotek. På dette tidspunkt, du er færdig med tar.gz fil og kan slette den.
6. Åbn Terminal, der typisk findes under 'Utilities', og skifter til x3dna-v2.1 bibliotek blev oprettet i trin 5 ved brug af følgende kommando (sluttede her og i alle instruktionerne nedenfor ved en vognretur):
   cd / Applications/x3dna-v2.1
7. Kør setup script er nødvendig for 3DNA at fungere ordentligt ved at skrive:
   ./bin/x3dna_setup
8. Kopier de to linjer eksport udskrevet i trin 7. Hvis brugeren har lagt softwaren i 'Applications' mappe, skal de to linjer ud som følger:
   eksport X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
   eksport PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
   Et andet ord udover 'Applications' vil Appear i eksport kommando, hvis brugeren har valgt at installere softwaren i et andet bibliotek. Denne alternative mappenavn vil erstatte 'Applications' i de to ovennævnte kommandoer. Bemærk, at hvis standard-skallen er "tcsh 'i stedet for' bash", ville indholdet af de to linjer være: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 og setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
9. Check in "Finder" for at se om en fil ved navn '. Bashrc' findes allerede på din computer.
10. Åbn TextEdit program findes i 'Applications' mappe og vælg 'Make Plain Text "under" Format "i menuen.
11. Hvis ". Bashrc 'fil fra trin 9 eksisterer, skal du åbne filen i TextEdit og indsætte eksportindstillingerne fra trin 8 til slutningen af ​​filen. Hvis nej. Bashrc 'fil udgange, indsætte eksportmarkederne indstillinger fra trin 8 i en tom fil og gemme med filnavnet ". Bashrc' i dit hjemmebibliotek. (Det personlige bibliotek er angivet ved et "hus" ikonet på Macintosh.)
12. For at de nye indstillinger til be rådighed, skal du køre den nyligt gemte 'bashrc.' fil ved hjælp af følgende kommando i Terminal-program:
    source ~ /. bashrc
13. Den 3DNA suite er nu installeret på dit system, og du kan udføre protokoller 2-5 i Terminal-programmet. Protokol 6 udføres ved hjælp w3DNA, en web-grænseflade til udvalgte funktioner i 3DNA software.

2.. Analyse af et Krystalstrukturbestemmelse

1. Vi illustrerer analysen af en nukleinsyre struktur anvendelse af DNA bundet til Hbb proteinet fra Borrelia burgdorferi ^8.. Filen af atomare koordinater forbundet med denne struktur kan findes på Protein data Bank ¹³ (FBF; http://www.rcsb.org ), hvor den er tildelt den strukturelle identifier 2np2. De ledsagende supplerende data indeholde en kopi af denne fil, som også kan findes på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove.
2. Det første skridt i den 3DNA analyse af strukturen er oprettelsen af ​​en fil, der viser alle de parrede baser. Dette gøres med "find_pair-programmet ved at skrive følgende:
   find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
   Her 2np2.pdb er input-filen for atomkoordinater beskrevet ovenfor og 2np2.bps er output tekstfil, der indeholder base-parring information. Sidstnævnte basepar fil kan undersøges og redigeres af brugeren, hvis det er nødvendigt.
3. Det næste skridt i analysen er at bestemme de geometriske parametre, der karakteriserer strukturen. Disse omfatter standard kemiske torsionsvinkler ^14, pseudorotation vinkler, der beskriver rynkning af sukkeret ring ¹⁵ stive krop parametre, der angiver arrangementer af baser og efterfølgende basepar ^16, og andre foranstaltninger for tredimensionale kemiske struktur. Kommandoen 'analysere' tager som input base-pair-fil genereret i trin 2 og skaber flere output filer, der vises i den nuværende arbejdsmappe. Disse værdier er beregnet ved at skrive følgende kommando:
   analysere 2np2.bps
   Outputfilerne anvendes her indbefatter 2np2.out, som indeholder en oversigt over de beregnede parametre, og bp_step.par, som indeholder en liste over de stive legeme ovenfor beskrevne parametre. Sidstnævnte fil let kan læses i et regnearksprogram til yderligere analyse og plotning. Se Repræsentative resultater (Figur 1) for et eksempel.

3.. Opførelse af en DNA-struktur fra Rigid-kropsparametre

1. Ud over analyse af en nukleinsyre-syre-struktur giver 3DNA software evnen til at opbygge en strukturel model fra rigid-body parametre vha. 'genopbygningen' kommando. I denne protokol viser vi hvordan man kan konstruere to DNA spiralformede modeller først ved hjælp af de stive-kropsparametre fra Hbb-DNA kompleks som beregnet i protokol 2, og derefter bruge en modificeret sæt parametre i which udvalgte rullevinkler ændres. Krængning måler graden af bøjning af successive basepar i rillerne DNA ^16. Positive værdier af rullen er forbundet med indsnævringen af ​​major groove og negative værdier med indsnævringen af ​​minor groove. Standarden referenceramme ¹⁷ vedtaget af 3DNA og andre populære nukleinsyre analyse software, f.eks Curves + ^18, forsikrer talmæssige sammenhæng i de beregnede parametre for Watson-Crick basepar.
2. Som standard, vil 3DNA 'genopbygge' funktionen skaber præcise atomare modeller, der kun indeholder koordinaterne for atomer i nitrogenbaser. For at skabe en tilnærmet atommodel, som omfatter koordinaterne fra både rygrad og basere atomer, skrive følgende kommando:
   x3dna_utils cp_std BDNA
   Denne kommando instruerer 3DNA at indføre en standard B-DNA rygrad konformation i opbygningen af ​​modeller fra stift-kropsparametre.
3. Til Build en dobbelt-spiralformet modellen med de stive-kropsparametre fundet i Hbb-DNA-struktur, skal du skrive følgende:
   genopbygge-atomare bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
   Her-atomare "specificerer opbygningen af ​​en all-atom model med atomare koordinater for alle tunge (ikke-brint) atomer 'bp_step.par' er den fil genereret på trin 3 i protokol nr. 2, som indeholder de indlæste rigid kropsparametre og '2 np2_rbld_org.pdb 'er output-fil med de atomare koordinater for oprettede struktur. Sidstnævnte er formateret i overensstemmelse med specifikationerne i FBF og dermed ophører med ". Pdb.
4. Den "bp_step.par 'fil kan redigeres til at generere en modificeret struktur. På en Macintosh kan ændringerne udføres vha. TextEdit ansøgning som beskrevet i protokol 1. Trin 10.
5. Her vi ændre de ekstreme rullevinkler dannet ved de to steder med størst bøjning. De værdier, som er udtrykt i grader, ændres til nul fra værdierne 64.95 på linje 17 og 60.93 I linie 26. Vi gemmer den ændrede fil med et nyt navn, 'bp_step_roll0.par', og luk TextEdit-programmet.
6. Vi bygger strukturen, som i trin 3 med den modificerede sæt trin parametre som input-fil ved at skrive:
   genopbygge-atomare bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
7. De to modeller kan ses i en standard molekylær fremviser, såsom PyMOL ( www.pymol.org ), ved hjælp af de genererede koordinatsystemer-filer (. FBF) som input. Se Repræsentative resultater (figur 2) for billeder af de genopbyggede strukturer.

4.. Analyse af Multi-modelstruktur Files

1. I modsætning til protokol 2, hvor vi analyserer en enkelt nukleinsyre-syreholdige struktur, vi her viser, hvordan man analyserer et stort ensemble af strukturer. Vi undersøger variationen over tid af de stive kropsparametre langs en ​​serie på 14 basepar DNA kæder opnået fra molekylær dynamik (MD) simuleringer ¹¹ http://forum.x3dna.org/jove .
2. Det første skridt i analysen er den samme som udføres i protokol nr. 2, identifikation af de parrede baser ved at køre 'find_pair' program. Da det samlede sæt af strukturer deler den samme base-parring ordningen er man nødt til at køre 'find_pair "kun én gang på et repræsentativt fil. Her vælger vi 1001:e struktur i simuleringen af ​​DNA-kæder, der indeholder en central AT skridt, med filnavnet md_AT_set1.pdb.1001. Den følgende instruktion slægterTES base-parring information og gemmer den i filen md_AT_set1.bps:
   find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
   Brugeren kan undersøge identificerede basen skrælle og foretage manuelle ændringer i filen baseret på viden om struktur.
3. Det næste skridt er at bestemme de geometriske parametre det samlede sæt af strukturer ved hjælp af 'x3dna_ensemble analysere' kommando. Programmet anvender som input basepar fil genereret i trin 2 (md_AT_set1.bps) samt en fil, der indeholder en liste over de strukturer, der skal analyseres. Sidstnævnte fil her kaldet md_AT_set1.list, indeholder 4.500 filer, der skal analyseres med den filnavne opført på enkelte strækninger i den rækkefølge genereret af MD simulering. En kopi af denne fil er inkluderet i supplerende materiale, og også tilbydes på 3DNA Forum. Brugeren bør advares, på grund af det store antal filer, at den beregningsmæssige tid kan være lang (~ 20 min per 1.000 filer på en AMD Phenom II X4 965 processor). The kommandoen afvikles ved at skrive følgende:
   x3dna_ensemble analysere-b md_AT_set1.bps-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
   I ovenstående eksempel '-b «vedrører den basepar fil oprettet i trin 2,'-l 'angiver, at en liste over filer er givet, og'-o 'giver brugeren mulighed for at tildele et navn til output filen. Der er mange muligheder, der kan bruges i forbindelse med den »x3dna_ensemble analysere 'kommando, såsom valg af bestemte modeller. Brugeren kan skrive 'x3dna_ensemble analysere-h' for at få flere oplysninger om disse indstillinger.
4. Det næste skridt er at udtrække de ønskede stive kropsparametre fra oversigten output fil, md_AT_set1.out genereret i trin 3. Dette udføres ved hjælp af 'x3dna_ensemble ekstrakt' kommando. En liste over tilgængelige geometriske parametre kan findes ved at taste 'x3dna_ensemble ekstrakt-l'. Her har vi udpakke rullevinkler og skabe en kommasepareret tekstfil (CSV) i rullevinkler med følgende kommando:
   x3dna_ensemble ekstrakt-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
   Den "-p roll" i denne kommando angiver parameter, der skal udvindes, den '-s' betegner en kommasepareret fil, '-f' betegner output filen stammer fra ensemblet analysere kommando, og den "-o »tillader brugeren at navngive CSV output fil af rullevinkler langs DNA'et i alle analyserede strukturer. Denne fil kan læses i andre programmer til videre analyse og plotte. Se Repræsentative resultater (figur 3) til analyse af variationen af rullen i de to MD-genererede datasæt beskrevet ovenfor, og 3DNA Forum for MATLAB script bruges til at generere disse billeder.

5.. Superposition af Multi-modelstrukturer på en fælles referenceramme

1. Den seneste version af 3DNA (version 2.1) har en ny funktion, der giver brugeren mulighed for at se på flere strukturer fra et fælles perspektiv. Den "x3dna_ensemble nyorientere 'kommando overlejrer en samling af beslægtede struktues om en fælles basepar eller base-pair skridt. Følgende protokol anvender denne evne til NMR-afledte struktur af DNA-O3 operatør bundet til headpieces af lac repressorproteinet ^12. Disse strukturer er gemt på FBF under identifier 2kek i en multi-model strukturel fil, som indeholder alle de struktur modeller i en enkelt fil, i modsætning til separate filer som dem, der anvendes for hver af de 4.500 modeller i protokol 4. De ledsagende supplerende data indeholde en kopi af denne fil, som også kan findes på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove .
2. Som i tidligere protokoller, er det første skridt til at beregne baseparring af DNA med "find_pair 'program. I dette tilfælde vil vi bruge som input filen '2 kek.pdb 'og skriv følgende:
   find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
   Basen parring genereres ved hjælp af første model i FBF fil. Manuelle korrektioner til udlæste base-pair-fil, '2 kek.bps 'kan foretages på grundlag af viden om strukturen.
3. Programmet 'x3dna_ensemble orientere' vil bringe de enkelte modeller i en multi-model struktur på en fælles reference ramme. Dette program kræver både FBF filen og basepardannelse fil fra det foregående trin som input og drives med følgende kommando:
   x3dna_ensemble nyorientere-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
   Her '-b' indstilling angiver baseparring fil, '-f 1' betegner basepar, hvor alle strukturer er ens, i dette tilfælde basepar 1 ved 5'-enden af ​​sekvensen-bærende streng, den "-e« angiver input ensemble filen, og den "-o 'giver brugeren mulighed for at give et output filnavn, i dette tilfælde '2 kek_fr1.pdb'. Flere oplysninger om kommandofunktioner kan fås ved at skrive 'x3dna_ensemble nyorientere-h'. Se Repræsentative resultater (figur 4) til drøftelse af de justerede strukturer.

6.. EntreIndsatsen af ​​et protein dekoreret DNA-molekyle

1. Den w3DNA web interface indeholder nogle populære funktioner i 3DNA softwarepakke. Her skal vi gøre opmærksom på muligheden for at konstruere tredimensionelle modeller af protein-dekoreret DNA med webserveren. De bundne DNA-fragmenter vedtage de stive-krop parametre for de udvalgte protein-DNA-komplekser, her værdier af DNA bundet til Hbb protein analyseret i protokol 2. De ubundne regioner af DNA kan have en af ​​tre brugervalgte spiralformede former (A, B eller C). A, B og C henviser til tre kanoniske modeller af DNA, opnået fra tidlig fiber diffraktion eksperimenter, med henholdsvis 11, 10 og 9 basepar pr omdrejning af den dobbelte helix ^19-21.
2. Det første skridt i opbygningen af et protein dekoreret DNA-modellen er at besøge w3DNA webstedet på http://w3dna.rutgers.edu . Udvælgelse af 'Reconstruction' fra menuen øverst til venstre på siden aktiverer de online model-building kapaciteter.
3. Det næste skridt er at vælge 'Bundet Protein-DNA template' linket findes i let skygge boks midt på den nye side. Dette valg vil aktivere en pull-down menu, som giver brugeren mulighed for at angive antallet af bundne proteiner. Her vælger vi to bundne proteiner, og klik på knappen 'Fortsæt'. Bemærk, at modellerne er begrænset i størrelse til 1.000 basepar, eller 2.000 nukleotider og tredive bundne proteiner.
4. Valg af antal af bundne proteiner fører til en specifikation side svarende til den i figur 5 viste. Denne side gør det muligt for brugeren at specificere DNA-sekvensen, den spiralformede form ubundet DNA, og hvis identitet og placeringerne af de bundne proteiner.
5. De bruger typer eller pastaer i den ønskede rækkefølge i tekstfeltet midt på specifikationen (Figur 5, Label 1). Bemærk kun standard restprodukter - A, T, C, G og U - accepteres. Her indtaster vi en 81 basepar homopolymer, der udelukkende består af A · T par med A i sekvensen bærende streng.
6. Der er en pull-down menu (figur 5, Label 2) under tekstboksen, for at vælge den spiralformede konformation de ubundne regioner af DNA. I dette eksempel vælger vi B-formen konformation.
7. Der er en tekstboks i bunden af specifikationen til at indtaste den bindende position (er) og filnavn (e) på det bundne protein (e) (figur 5, Label 3). Indbindingspositionen angiver placeringen af ​​midten af ​​proteinbundet fragment for DNA-sekvensen. Hvis det bundne DNA indeholder et ulige antal basepar, som i Hbb-DNA-struktur, indbindingspositionen betegner placeringen af ​​den midterste basepar af fragmentet. I tilfælde af Hbb-bundet DNA, er denne midterste basepar en T · T mispair. I dette eksempel, hvor vi binder to kopier af Hbb protein til DNA-templaten er T · T par placeret i positionerne 20 og 63 af de 81 basepar DNA SEkvens. Bemærk, at sekvensen af ​​de bundne fragment ikke behøver at falde sammen med det indtastede i trin 5.. Hvis proteinbundet region indeholder et lige antal basepar, indbindingspositionen betegner placeringen af ​​den midterste basepar trin på DNA. Det vil sige, den centrale basepar trin af de bundne fragmentet placeret mellem basepar n og n +1, hvor n er det angivne antal langs segmentet. Bemærk også, at brugeren kan dekorere DNA til proteiner, så længe strukturen af dets kompleks med DNA er kendt og opbevares i standard FBF format ^13..
8. Nederst på specifikationssiden der er en boks, der giver brugeren mulighed for at generere en visning af proteinbundet DNA (figur 5, Label 4). Her kontrollerer vi, at feltet og klik på knappen 'Fortsæt'. Denne handling genererer en gennemgang side opregner de udvalgte parametre samt eventuelle fejl, der måtte være opstået fra overlapningen af ​​de udvalgte bindingssteder. Brugeren kan seLect den "Tilbage" knappen, hvis eventuelle ændringer skal foretages, eller 'Build' knappen for at fortsætte.
9. Den næste side viser et statisk billede af DNA-protein-kompleks i sin mest udvidede arrangement og giver mulighed for on-line interaktiv visualisering via Jmol og Webmol. Brugeren kan også downloade en koordinat (. FBF) fil, der er formateret i overensstemmelse med specifikationerne i FBF. Dette gøres ved at vælge 'Hent den genopbyggede FBF filen' linket under genererede billede. Sidstnævnte fil let kan læses i et molekylært grafikprogram til yderligere visualisering. Se Repræsentative resultater (figur 6) for eksempler på den Hbb-dekoreret DNA beskrevet ovenfor, og en lidt længere (86 basepar) kæde med Hbb centreret ved positionerne 20 og 67.

Representative Results

De 3DNA softwareværktøjer anvendes rutinemæssigt til at analysere nukleinsyrestrukturer. For eksempel er identitet basepar og den stive-krop parametre, der kendetegner arrangementer af baser i dobbelt heliske fragmenter af DNA og RNA-strukturer automatisk beregnes og gemmes for hver ny post i Nucleic Acid Database ^22, en verdensomspændende samling af nukleinsyre strukturel information. Værdierne af rigid body parametre bestemmes med protokol 2 let afsløre forvridninger i tredimensionel struktur, såsom de to lokaliteter af ekstrem DNA bøjning i major groove, med store positive rullevinkler (64,95 ° og 60,93 °), findes på AT · AT trin 13 og 22 i krystal kompleks med Borrelia burgdorferi Hbb protein ⁸ (figur 1).

Evnen af ​​softwaren til at genopbygge strukturer fra disse mængder med protokol 3 gør det muligt at bestemme, hvordan iindividuel basis og base-pair skridt bidrager til den samlede molekylære fold. Som illustreret i figur 2, den globale bøjning af DNA induceret af Hbb afspejler mere end de to ekstreme roll forvridninger nævnt ovenfor. Det vil sige, at DNA'et forbliver krummeste når rekonstrueret med disse basepar trin rettede, dvs med null rullevinkler på de to lokaliteter. Den samme teknik har tidligere afdækkede bidragene af specifikke basepar trin og deformationer til superhelical tonehøjde DNA viklet på overfladen af den nukleosom kernepartikel ⁶ og til bredden af den lille fure af bundet DNA til det bakterielle nucleoid- associerede protein Fis ^23..

Den nye kapacitet i 3DNA, beskrevet i protokol 4, til at undersøge et stort antal tilknyttede strukturer gør det muligt at trække både sekvens-og tidsafhængige mønstre i de rumlige arrangementer af simuleret DNA og RNA-molekyler. For eksempel (gul) coleller-kodningen af rullevinkler mellem successive basepar i to store sæt simulerede DNA strukturer ¹¹ afslører præferentielle bøjning af disse molekyler på pyrimidin-purin basepar trin (figur 3). De højere værdier for roll, afbildet i rødt, som er persistente i korte perioder i enderne af DNA er tyder på lokaliseret smeltning og reannealing af dobbelt-spiralformet struktur. De variational mønstre af andre stive kroppens parametre, såsom de vinkler og afstande mellem komplementære baser, kan bidrage til at dechifrere de præcise strukturelle forvridninger.

Evne til 3DNA software, præsenteres i protokol nr. 5, at omlægge relaterede molekyler i en fælles reference ramme, afslører funktioner i overordnede struktur skjult i mange af de filer, der er gemt i FBF. For eksempel producerer den konventionelle tilpasning af tilknyttede strukturer på grundlag af en rod-betyde-square fit af de tilsvarende atomer en række lignende rumlige veje that groft oven på hinanden, her de ti NMR-baserede modeller af O3 DNA operatør bundet til headpieces af lac repressorproteinet ¹² (figur 4 til venstre). Superposition af de samme strukturer på en fælles koordinatsystem på den 5'-terminale basepar af hver duplex afslører betydelige forvridninger af globale struktur, hvor molekylerne Flex mærkbart forskellige retninger (figur 4 til højre). Den strukturelle variation kan påvirke den lethed, hvormed den Escherichia coli Lac repressorprotein binder O3 og inducerer en løkke mellem O3 og sekventielt fjerne operatører i lac operon ^24..

Trinene i protokol 6, til at bygge modeller af lange DNA-fragmenter dekoreret på vilkårlige steder med proteiner og andre ligander, tilføjer et nyt perspektiv på tilrettelæggelsen af ​​store makromolekylære forsamlinger. Sådanne modeller bidrager til at forstå, hvordan multi-molekylære komplekserinteragere under biologisk behandling. Som illustreret i figur 6, kan den præcise placering af en arkitektonisk protein som Hbb have en dramatisk effekt på den samlede foldning af DNA. Hvis to kopier af kendte høj opløsning struktur ⁸ er adskilt af 43 basepar, en 81-basepar DNA-fragment lukker i en stram, næsten lukket konfiguration. Hvis de to proteiner er adskilt af yderligere fem basepar DNA følger en åben, bugtende vej. De meget forskellige arrangementer af proteinet dekoreret duplex viser, hvordan afstanden af arkitektoniske proteiner kan påvirke ringslutningen eller looping af DNA ^{25, 26.}

Figur 1. Variation af rullen vinklen mellem successive basepar (se indsats for visuel skildring) langs DNA chai bundet til Hbb protein fra Borrelia burgdorferi ^8.. opnåede værdier ved hjælp af 'analysere' kommandoen over 3DNA og de ​​strukturelle data nævnt i protokol 2. Bemærk de ekstreme værdier rulle på AT trin, beslag den midterste tredjedel af strukturen.

Figur 2. Omtrentlige atomare modeller konstrueret DNA ved hjælp af 'genopbygge' funktion af 3DNA og gengives i PyMOL med farvekodede atomer (C-cyan, N-blue, O-røde, P-guld). Modeller baseret på (til venstre) de stive krop trin parametre Hbb protein og (til højre) en modificeret sæt trin parametre, hvor de to største værdier for roll er blevet sat til nul. Se protokol 3 til trin-for-trin instruktioner . Bemærk udfoldelsen af ​​DNA induceret af de pålagte ændringer i roll.

Figur 3. Mosaik billeder af rullevinkler langs DNA i to sæt simulerede konstruktioner ^11.. Værdier for roll, udvundet ved hjælp af protokol 4, er farvekodede fra blåt til rødt over området [-5 °, 20 °]. Bemærk den omvendte rækkefølge af baser og store værdier af roll, fremhævet af gule / røde søjler, der opstår ved pyrimidin-purin skridt i de to 14 basepar self-komplementære sekvenser.

Figur 4.. Tegneserie billeder af DNA modeller findes i NMR-afledte strukturer O3 DNA operatør med Lac repressorprotein headpieces ¹² illustrative for de kapaciteteraf de »x3dna_ensemble omlægge 'kommando. Images afsagt i PyMOL (rygbenet vise så guld rør og baser som blå pinde) og afstemt med (til venstre) koordinaterne i FBF post (2kek) og (til højre) den strukturelle superposition præsenteres i protokol nr. 5 . Bemærk de store forskelle mellem de strukturer, når de placeres i en fælles reference ramme på 5'-terminal basepar.

Figur 5. Screen shot fra w3DNA webserver illustrerer specifikationer af DNA-sekvensen (Label 1), den spiralformede form for ubundet DNA (etiket 2), de holdninger og identiteter af proteiner (Label 3) samt visningsbilledet afkrydsningsfeltet (Label 4) beskrevet i protokol 6.. Klik her for at se større figur .

Figur 6.. Omtrentlige atomare modeller af to HBB proteiner ⁸ bundet til en lang DNA-fragment. Strukturer, der oprettes med w3DNA webserver som beskrevet i protokol 6 og gengives i PyMOL. Protein kæder er show som violette bånd, mens DNA er farvet-kodet af atom type (C-cyan, N-blue, O-røde, P-guld). Den centrale basepar af hvert protein-bindingssteder er indstillet på positioner (venstre) 20 og 62 langs den 81 basepar DNA-kæde og (højre) 20 og 67 langs den 86 basepar DNA-kæde. Bemærk den større ændring i foldningen af ​​de strukturer, der er forbundet med den øgede (fem basepar) forskydning af de to proteiner.

Discussion

Det sæt af protokoller, der præsenteres i denne artikel kun berøre mulighederne i 3DNA suite af programmer. Værktøjerne kan anvendes til RNA strukturer at identificere ikke-kanoniske basepar, at bestemme de sekundære strukturelle sammenhænge, ​​hvor en sådan parring forekommer, at kvantificere den rumlige disponering af spiralformede fragmenter, at måle overlapningen af ​​baser langs kæden rygrad, osv. Ombygningen kommandoen tillader brugeren at konstruere enkle og informative blok repræsentationer af baser og basepar ud som i det indsatte figur 1. De bygning værktøjer omfatter også funktioner til 'tråd' forskellige sekvenser på en given strukturel skabelon til at generere modeller af talrige double-, triple-og fire-DNA strukturer, at orientere modeller i en bestemt retning, osv. Endelig 3DNA har spillet en væsentlig rolle i en række andre projekter, såsom: SWS hydrat webservice for nukleinsyrer ^27, den ARTS webserver tilSfæriske RNA tertiære strukturer ^28, den MDDNA webbaseret værktøj til analyse af molekylær dynamik resultater og struktur forudsigelse ^29, kuller information-drevet protein-DNA docking metode ^30, SARA server for funktion annotation af RNA-strukturer ^31, 3D- DART DNA-struktur modellering server ^32, 3D-fodaftryk database til strukturel analyse af protein-DNA-komplekser ^33, RNA FRABASE 2.0 database til identifikation af tredimensionale fragmenter inde RNA-strukturer ³⁴ og setter webserver for den parvise sammenligning af RNA-strukturer ^35. Til de bedste af vores viden, er der i øjeblikket ingen anden nukleinsyre-syre-struktur software-pakke med en sammenlignelig bred kombination af funktioner og den robuste ydeevne rekord i 3DNA.