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Biology

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

Published: April 26, 2013 doi: 10.3791/4401
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

Summary

Die 3DNA Softwarepaket ist eine beliebte und vielseitige Bioinformatik-Tool mit Funktionen zu analysieren, zu konstruieren, zu visualisieren und dreidimensionale Strukturen Nukleinsäure. Dieser Artikel stellt ausführliche Protokolle für eine Teilmenge der neue und beliebte Features, die in 3DNA, für beide einzelnen Strukturen und Ensembles von verwandten Strukturen.

Abstract

Die 3DNA Softwarepaket ist eine beliebte und vielseitige Bioinformatik-Tool mit Funktionen zu analysieren, zu konstruieren, zu visualisieren und dreidimensionale Strukturen Nukleinsäure. Dieser Artikel stellt ausführliche Protokolle für eine Teilmenge der neue und beliebte Features, die in 3DNA, für beide einzelnen Strukturen und Ensembles von verwandten Strukturen. Protokoll Nr. 1 enthält die Reihe von Anweisungen benötigt zum Herunterladen und Installieren der Software. Darauf folgt in Protokoll 2, durch die Analyse eines Nukleinsäure-Struktur, einschließlich der Zuordnung von Basenpaaren und die Bestimmung der Starrkörper-Parametern, die die Struktur zu beschreiben und in Protokoll Nr. 3, gefolgt von einer Beschreibung der Rekonstruktion eines atomaren Modell einer Struktur aus der Starrkörper-Parameter. Die neueste Version von 3DNA, Version 2.1, verfügt über neue Features für die Analyse und Manipulation von Ensembles von Strukturen, wie jene von Kernspinresonanz (NMR)-Messungen und molekularen Dynamik (MD abgeleitet) Simulationen; diese Funktionen sind in den Protokollen 4 und 5 dargestellt. Neben den Stand-Alone-3DNA Softwarepaket, das w3DNA Webserver an folgenden http://w3dna.rutgers.edu bietet eine benutzerfreundliche Schnittstelle auf ausgewählte Funktionen der Software. Protokoll Nr. 6 zeigt ein neues Merkmal der Website für den Bau von Modellen der langen DNA-Molekülen mit Proteinen in benutzerspezifischen Orten eingerichtet.

Introduction

Das Verständnis der dreidimensionalen Strukturen von DNA, RNA und ihre Komplexe mit Proteinen, Drogen und andere Liganden, ist von entscheidender Bedeutung für die Entschlüsselung ihrer vielfältigen biologischen Funktionen, und zum Ermöglichen das rationale Design von Therapeutika. Exploration solcher Strukturen umfasst drei getrennte, aber eng verwandte Komponenten: Analyse (Muster in Formen und Wechselwirkungen extrahieren), Modellierung (zu Energetik und Molekulardynamik beurteilen) und Visualisierung. Statik und Modellbau sind im Wesentlichen zwei Seiten der gleichen Medaille, und Visualisierung ergänzt sie beide.

Die 3DNA Suite von Computerprogrammen ist eine zunehmend beliebte strukturelle Bioinformatik-Toolkit mit Fähigkeiten zu analysieren, zu konstruieren, zu visualisieren und dreidimensionale Strukturen Nukleinsäure. Frühere Veröffentlichungen erläutert die Möglichkeiten der Software 1, sofern Rezepte durchzuführen ausgewählten Aufgaben 2, führte die web-basierte Schnittstellezu beliebten Features der Software 3, gesammelt präsentiert Datenbanken struktureller Merkmale mit 3DNA 4, 5 und veranschaulicht die Nützlichkeit der Software für die Analyse von DNA und RNA-Strukturen 6, 7.

Das Ziel dieses Artikels ist es, die 3DNA Software-Kit zur Labor-Wissenschaftler und andere mit Interessen und / oder Bedürfnisse zu bringen, um DNA-und RNA-räumliche Organisation mit state-of-the-art Computer-Tools untersuchen. Die Protokolle hier vorgestellten Schritt-für-Schritt-Anleitung (i) zum Herunterladen und Installieren der Software auf einem Mac OS X-System, (ii-iii) zu analysieren und zu modifizieren DNA-Strukturen auf der Ebene der konstituierenden Basenpaar-Schritten ( iv-v) zu analysieren und auszurichten Gruppen von verwandten DNA-Strukturen, und (vi) die Modelle von Protein-DNA-Ketten dekoriert mit der benutzerfreundlichen Weboberfläche w3DNA konstruieren. Die Software hat die Fähigkeit, zu analysieren einzelnen Strukturen gelöst mit röntgenkristallographische Methoden sowie großeEnsembles von Strukturen mit Kernspinresonanz (NMR) ermittelt oder die durch Computer-Simulation Techniken.

Die hier untersuchten Strukturen umfassen (i) die hochauflösende Kristallstruktur von DNA gebunden an die HBB Protein aus Borrelia burgdorferi 8 (die von Zecken übertragene Bakterium, dass Lyme-Borreliose verursacht beim Menschen 9, 10), (ii) zwei große Gruppen von sequentiell verwandten DNA-Moleküle mit Molekülsimulationen 11 erzeugt - 4,500 Momentaufnahmen d (GGCAAAATTTTGCC) 2 und d (CCGTTTTAAAACGG) 2 bei 100-ps-Schritten während der Berechnungen gesammelt, und (iii) eine kleine Ensemble NMR-basierte Strukturen der DNA O3 Bediener verpflichtet, den Kopfschmuck des Escherichia coli Lac Repressorprotein 12. Die folgenden Anweisungen enthalten Informationen darüber, wie die Dateien der Atomkoordinaten mit jeder dieser Strukturen sowie wie 3DNA (Eine Kopie dieser Datei gefunden verwenden assoziiert zugreifenauf der 3DNA Forum auf http://forum.x3dna.org/jove ) zu prüfen und ändern diese Strukturen.

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Protocol

1. Die Installation der Software-Paket

  1. Verbindung zum 3DNA Website http://x3dna.org und klicken Sie auf den Link zu den 3DNA Forum. Im Forum wählen Sie das 'Register' Link und folgen Sie den Anweisungen, um ein neues Konto zu erstellen.
  2. Die folgende Anleitung ausführlich Installation der Software auf einem OS X-basierten Macintosh-Computer mit einem default 'bash' Shell. Das Verfahren für Linux oder Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) Systeme mit häufig verwendeten Schalen (einschließlich "tcsh") innerhalb des 3DNA Forum gefunden.
  3. Sobald Sie einen Benutzernamen und ein Passwort eingerichtet haben, in das Forum einloggen. Wählen Sie die 'Downloads' Link in der Sektion und Willkommen auf der neuen Seite wählen '3 DNA herunterladen '. Dadurch werden Sie auf der Download-Seite, wo 3DNA verschiedenen Versionen der Software heruntergeladen werden kann bringen.
  4. Wählen Sie die Mac OS X Intel Link, um ein komprimiertes Tar-Archiv-Datei (tar.gz) enthält die Software herunterzuladen.
  5. Doppel click auf dem (tar.gz-Datei), um einen Ordner mit dem Namen x3dna-v2.1 erstellen. Dieser Ordner, der die Software-Suite 3DNA enthält, können zu jedem beliebigen Ort verschoben werden. Für die Zwecke dieses Rezept, ziehen wir und legen Sie es in den 'Applications' Verzeichnis. In diesem Stadium sind Sie mit der tar.gz Datei fertig und kann sie löschen.
  6. Öffnen Sie die Terminal-Anwendung, in der Regel unter "Dienstprogramme" gefunden, und wechseln Sie in das Verzeichnis x3dna-v2.1 in Schritt 5 erstellt mithilfe des folgenden Befehls (endete hier und in allen folgenden Anweisungen von einem Wagenrücklauf):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Führen Sie das Setup-Skript für 3DNA benötigt, um richtig funktionieren zu können, indem Sie:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Kopieren Sie die beiden Online-Export-Einstellungen in Step 7 gedruckt. Wenn der Benutzer die Software im 'Applications' Verzeichnis abgelegt, sollten die beiden Zeilen wie folgt aussehen:
    Export X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    Ein anderes Wort außer 'Applications' wird Appear in der Export-Befehl, wenn der Benutzer ausgewählt hat, um die Software in einem anderen Verzeichnis installieren. Diese alternativen Verzeichnis-Namen ersetzt 'Applications' in den beiden oben genannten Befehle. Beachten Sie, dass, wenn die Standard-Shell ist 'tcsh' anstelle von 'bash', der Inhalt der beiden Linien wäre: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 und setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Anreise 'Finder' um zu sehen, ob eine Datei namens '. Bashrc' existiert bereits auf Ihrem Computer.
  10. Öffnen Sie das Programm TextEdit in der 'Applications' Verzeichnis und wählen Sie "Als Nur-Text" unter dem Menü 'Format'.
  11. Wenn die '. Bashrc "-Datei aus Schritt 9 vorhanden ist, öffnen Sie die Datei in TextEdit und fügen Sie die Export-Einstellungen von Schritt 8 bis zum Ende der Datei. Wenn nein '. Bashrc-Datei beendet, fügen Sie den Export-Einstellungen aus Schritt 8 in eine leere Datei und speichern Sie mit dem Dateinamen'. Bashrc "in Ihrem Home-Verzeichnis. (Das Home-Verzeichnis wird von einem "Haus"-Symbol auf dem Macintosh bezeichnet.)
  12. Um die neuen Einstellungen zu be zur Verfügung, müssen Sie die neu gespeicherte 'bashrc.' Datei mit dem folgenden Befehl im Terminal-Programm:
    source ~ /. bashrc
  13. Die 3DNA Suite ist nun auf Ihrem System installiert und Sie können Protokolle 2-5 im Terminal-Programm durchzuführen. Protokoll Nr. 6 wird mit w3DNA, ein Web-Interface zu ausgewählten Merkmalen der 3DNA Software.

2. Analyse einer Kristallstruktur

  1. Wir erläutern die Analyse einer Nukleinsäure-Struktur mit der gebundenen DNA HBB Proteins aus Borrelia burgdorferi 8. , Die Datei von Atomkoordinaten mit dieser Struktur verbunden sind, können bei der Protein Data Bank 13 (PDB finden http://www.rcsb.org , wo es die strukturelle Kennung 2np2 zugeordnet ist). Die beigefügten Ergänzende Daten eine Kopie dieser Datei, die auch auf der 3DNA Forum zu finden unter http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Der erste Schritt in der 3DNA Analyse der Struktur ist die Schaffung einer Datei, die alle der gepaarten Basen auflistet. Dies wird mit dem 'find_pair "-Programm, indem Sie folgendes getan:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Hier 2np2.pdb ist die Input-Datei der Atomkoordinaten oben beschrieben und 2np2.bps ist der Ausgang Textdatei, die Basenpaarung Informationen enthält. Letztere Basenpaar-Datei untersucht und bearbeitet werden durch den Benutzer, wenn nötig.
  3. Der nächste Schritt in der Analyse ist es, die geometrischen Parameter, die die Struktur kennzeichnen zu bestimmen. Dazu gehören Standard-chemischen Torsionswinkel 14, Pseudorotation Winkeln, die die Faltung des Zucker-Ring 15, Starrkörperplatte Parameter, die die Anordnungen der Basen und aufeinanderfolgende Basenpaare 16, und andere Maßnahmen der dreidimensionalen chemischen Struktur angeben zu beschreiben. Der Befehl 'analysieren' Als Eingabe werden die Basenpaar-Datei in Schritt 2 erzeugte und erzeugt mehrere output Dateien, die in der vorliegenden Arbeit Verzeichnis angezeigt. Diese Werte werden durch Eingabe des folgenden Befehls berechnet:
    analysieren 2np2.bps
    Die Output-Dateien verwendet, hier sind 2np2.out, die einen Überblick über die berechneten Parameter enthält, und bp_step.par, die eine Liste der starren Körper oben beschriebenen Parameter enthält. Letztere Datei kann leicht in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur weiteren Analyse und Darstellung gelesen werden. Siehe Repräsentative Ergebnisse (Abb. 1) zeigt ein Beispiel.

3. Bau einer DNA-Struktur von Rigid-Body-Parameter

  1. Neben der Analyse einer Nukleinsäure-Struktur stellt die 3DNA Software die Möglichkeit, ein Strukturmodell von Starrkörper-Parameter unter Verwendung der "Wiederherstellung"-Befehl zu bauen. In diesem Protokoll werden wir zeigen, wie man zwei DNA spiralförmigen Modelle konstruieren, zuerst mit den starren Körper Parameter aus der HBB-DNA-Komplex wie in Protokoll Nr. 2 berechnet und dann mit Hilfe eines modifizierten Satz von Parametern in werden ausgewählten Rollwinkeln geändert werden. Der Rollwinkel misst den Grad der Biegung der aufeinanderfolgenden Basenpaaren in die Nuten der DNA 16. Positive Werte der Walze mit der Verengung der großen Furche und negative Werte in die Verengung der kleinen Furche verbunden. Die Standard-Referenz-Frame 17 durch 3DNA und anderen beliebten Nukleinsäure-Analyse-Software übernommen, versichert zB Curves + 18, numerische Konsistenz der berechneten Parameter von Watson-Crick-Basenpaare.
  2. Standardmäßig wird der 3DNA "rebuild"-Funktion erstellen genaue atomare Modelle, die nur die Koordinaten der Atome in den stickstoffhaltigen Basen enthalten. Um eine ungefähre Atommodell, die Koordinaten sowohl Rückgrat und Basis-Atomen enthält erstellen, geben Sie folgenden Befehl ein:
    x3dna_utils cp_std bDNA
    Dieser Befehl weist 3DNA eine Standard-B-DNA-Rückgrat-Konformation in der Modell einführen von Starrkörper-Parameter.
  3. Um build eine Doppelhelix-Modell mit den starren Körper Parameter in der HBB-DNA-Struktur gefunden, geben Sie die folgenden Schritte aus:
    Wiederaufbau-Atom bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Hier '-Atom "den Bau einer all-Atom-Modell mit Atom-Koordinaten für alle schweren (Nicht-Wasserstoff-Atome) angibt, ist' bp_step.par 'die Datei in Schritt 3 des Protokolls Nr. 2 erzeugt, die die eingegebenen Starrkörperplatte Parameter enthält und '2 np2_rbld_org.pdb 'die Ausgabedatei mit den atomaren Koordinaten der Struktur erstellt. Letztere Datei wird in Übereinstimmung mit den Spezifikationen des HVE formatiert und endet somit mit '. Pdb'.
  4. Die 'bp_step.par' Datei kann eine modifizierte Struktur zu erzeugen. Auf einem Macintosh können die durchgeführten Änderungen mit dem Programm TextEdit in Protokoll 1 Schritt 10 beschrieben.
  5. Hier ändern wir die extreme Rollwinkeln an den beiden Standorten der größten Biegung gebildet. Die Werte, die in Grad ausgedrückt sind, verändert werden, um aus den Werten von 64.95 in Zeile 17 und 60 auf Null gesetzt.93 In Zeile 26. Wir speichern Sie die geänderte Datei unter einem neuen Namen, "bp_step_roll0.par", und schließen Sie das Programm TextEdit.
  6. Wir bauen die Struktur, wie in Schritt 3, mit dem modifizierten Satz von Schritt werden die Parameter als Input-Datei, indem Sie Folgendes eingeben:
    Wiederaufbau-Atom bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Die beiden Modelle können in einem Standard-molekularen Betrachter, wie PyMOL (eingesehen werden www.pymol.org ), unter Verwendung der erzeugten Koordinaten-Dateien (. pdb) als Eingabe. Siehe Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 2) für Bilder der Strukturen wieder aufgebaut.

4. Analyse von Multi-Modell-Struktur Files

  1. Im Gegensatz zum Protokoll Nr. 2, in denen wir analysieren eine einzelne Nukleinsäure-enthaltende Struktur, hier zeigen wir, wie man ein großes Ensemble von Strukturen zu analysieren. Wir untersuchen die Veränderung im Laufe der Zeit von den starren Körper-Parameter entlang einer Reihe von 14-Basenpaar-DNA-Ketten von molekularen Dynamik (MD)-Simulationen 11 erhalten http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Der erste Schritt in der Analyse ist die gleiche wie in Protokoll 2 Identifizierung der gepaarten Basen durch Ausführen der 'find_pair-Programm durchgeführt. Da die gesamte Reihe von Strukturen teilt die gleiche Basenpaarungsverhalten Schema muss man 'find_pair' nur einmal ausgeführt auf einer repräsentativen Datei. Hier wählen wir die 1001-Struktur in der Simulation von DNA-Ketten, die eine zentrale AT Schritt, mit dem Dateinamen md_AT_set1.pdb.1001. Die folgende Anweisung Gattungentes die Basenpaarung Informationen und speichert sie in der Datei md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    Der Benutzer kann auf die identifizierte Basenpaarungsstruktur und manuelle Änderungen in der Datei auf der Kenntnis der Struktur.
  3. Der nächste Schritt ist, um die geometrischen Parameter des gesamten Satzes von Strukturen unter Verwendung der "x3dna_ensemble analysieren"-Befehl zu bestimmen. Das Programm verwendet als Eingabe die Basenpaar-Datei in Schritt 2 (md_AT_set1.bps) sowie eine Datei mit einer Liste der Strukturen zu analysierenden erzeugt. Die zweite Datei, hier als md_AT_set1.list, enthält die 4.500 Dateien analysiert, mit den Dateinamen auf einzelnen Linien in der Reihenfolge von der MD-Simulation erzeugt eingegeben werden. Eine Kopie dieser Datei wird in der Supplementary Material enthalten und auch auf der 3DNA Forum angeboten. Der Anwender sollte gewarnt, wegen der großen Anzahl der Dateien ist, dass die Rechenzeit kann lang sein (~ 20 min pro 1.000 Dateien auf einem AMD Phenom II X4 965 Prozessor). ThE-Befehl wird durch Eingabe des folgenden ausführen:
    x3dna_ensemble analysieren-b-l md_AT_set1.bps md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
    In dem obigen Beispiel "-b" bezieht sich auf die Basenpaar-Datei in Schritt 2 erstellt wurde, gibt '-l', die eine Liste von Dateien gegeben ist, und '-o' kann der Benutzer einen Namen für die Ausgabedatei zuordnen. Es gibt viele Optionen, die im Zusammenhang mit der 'x3dna_ensemble analysieren' Befehl verwendet werden können, wie die Auswahl von bestimmten Modellen. Der Benutzer kann Typ 'x3dna_ensemble analysieren-h ", um mehr Informationen zu diesen Optionen erhalten.
  4. Der nächste Schritt ist, um die gewünschten Starrkörper-Parameter aus der Übersicht Ausgabedatei md_AT_set1.out in Schritt 3 abzuführen. Dies erfolgt über die "x3dna_ensemble Extrakt 'Befehl. Eine Auflistung der verfügbaren geometrischen Parameter können durch Eingabe von 'x3dna_ensemble Extrakt-l' gefunden werden. Hier haben wir extrahieren die Rollwinkeln und erstellen Sie eine durch Kommata getrennte Textdatei (CSV) der Rollwinkel mit dem folgenden Befehl:
    x3dna_ensemble Extrakt-pRoll-s,-f-o md_AT_set1.out md_AT_set1_roll.csv
    Die '-p Rolle "in diesem Befehl legt die Parameter extrahiert werden, das"-s ", eine komma-separierte Datei bedeutet, bezeichnet die'-f 'die Ausgabe-Datei aus dem Ensemble analysieren Befehl erhalten, und die'-o "ermöglicht es dem Benutzer, die CSV Ausgabedatei Rollwinkel entlang der DNA in allen analysierten Strukturen zu nennen. Diese Datei kann in andere Programme zur weiteren Analyse und Darstellung gelesen werden. Siehe Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 3) für die Analyse der Veränderung der Rolle in den beiden MD-generierten Datensätze beschrieben und der 3DNA Forum für die MATLAB-Skript verwendet, um diese Bilder zu erzeugen.

5. Überlagerung von Multi-Modell-Strukturen auf einen gemeinsamen Referenzrahmen

  1. Die neueste Version von 3DNA (Version 2.1) hat eine neue Funktion, die ein Benutzer an mehreren Strukturen aus einer gemeinsamen Perspektive zu betrachten können. Die 'x3dna_ensemble umorientieren' command überlagert eine Sammlung von verwandten strukturelles auf einem gemeinsamen Basenpaar oder Basenpaaren Schritt. Das folgende Protokoll gilt diese Fähigkeit auf die NMR-abgeleiteten Strukturen der DNA O3 Betreiber verpflichtet, den Kopfschmuck des Lac Repressorprotein 12. Diese Strukturen sind in der PDB unter der Kennung 2kek in einem Multi-Modell-Struktur-Datei, die alle Struktur-Modelle in einer einzigen Datei, um separate Dateien, wie sie für jede der 4.500 Modelle in Protokoll Nr. 4 verwendet dagegen enthält gespeichert. Die beigefügten Ergänzende Daten eine Kopie dieser Datei, die auch auf der 3DNA Forum zu finden unter http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Wie in den vorangegangenen Protokollen ist der erste Schritt, um die Basenpaarung der DNA mit der "find_pair-Programm zu berechnen. In diesem Fall verwenden wir als Eingabe der Datei '2 kek.pdb "und geben Sie die folgenden Schritte aus:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    Die Basenpaarung wird unter Verwendung des ersten Modells in der PDB-Datei. Manuelle Korrekturen der ausgegebenen base-pair-Datei, '2 kek.bps 'kann basierend auf der Kenntnis der Struktur vorgenommen werden.
  3. Das Programm "x3dna_ensemble auszurichten 'werden die einzelnen Modelle in einer Multi-Modell-Struktur auf einem gemeinsamen Bezugssystem auszurichten. Dieses Programm erfordert sowohl die PDB-Datei und die Basenpaarung Datei aus dem vorherigen Schritt als Eingabe und wird mit dem folgenden Befehl ausführen:
    x3dna_ensemble umorientieren-b 2kek.bps-f 1-e-o 2kek.pdb 2kek_fr1.pdb
    Hier die '-b' Option die Basenpaarung Datei angibt, bezeichnet die "-f 1 'das Basenpaar an dem alle Strukturen ausgerichtet sind, in diesem Fall Basenpaar 1 am 5'-Ende der Sequenz-Stranges, die '-e' gibt den Eingang Ensemble-Datei und die '-o' erlaubt es dem Benutzer, um einen Ausgang Dateinamen angeben, in diesem Fall '2 kek_fr1.pdb '. Weitere Informationen zu Befehlsoptionen kann durch Eingabe von 'x3dna_ensemble umorientieren-h' erhalten werden. Siehe Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 4) zur Diskussion der Strukturen ausgerichtet.

6. Construktion eines Protein-DNA-Molekül dekoriert

  1. Die w3DNA Weboberfläche enthält einige beliebte Features der 3DNA Softwarepaket. Hier haben wir die Aufmerksamkeit auf die Fähigkeit, dreidimensionale Modelle von Protein-DNA dekoriert mit dem Web-Server zu bauen. Die gebundenen DNA-Fragmente treffen die Starrkörper-Parameter der ausgewählten Protein-DNA-Komplexe, hier die Werte der gebundenen DNA HBB Protein in Protokoll 2 analysiert. Die ungebundenen DNA-Regionen kann einen der drei vom Benutzer ausgewählten spiralförmigen Formen (A, B, oder C). Die A, B, und C beziehen sich auf drei kanonischen Modelle von DNA, von der frühen Faser Beugungsexperimente erhalten, mit jeweils 11, 10 und 9 Basenpaaren pro Windung der Doppelhelix 19-21.
  2. Der erste Schritt beim Aufbau einer Protein-DNA-Modell eingerichtet ist, die w3DNA Website besichtigen http://w3dna.rutgers.edu . Auswahl von 'Wiederaufbau' aus dem Menü am oberen linken Rand der Seite aktiviertviert die Online-Modellbau-Fähigkeiten.
  3. Der nächste Schritt ist es, die 'Bound Protein-DNA-Template "-Link in der leicht schattierten Feld in der Mitte der neuen Seite wählen. Diese Auswahl wird aktiviert, ein Pull-Down-Menü, das es dem Benutzer, die Anzahl der gebundenen Proteine ​​angeben können. Hier wählen wir zwei Proteine ​​und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter". Beachten Sie, dass die Modelle in der Größe bis 1000 Basenpaare, oder 2000 Nukleotide und Proteine ​​dreißig begrenzt.
  4. Die Auswahl der Anzahl der gebundenen Proteine ​​führt zu einer Spezifikation Seite ähnlich wie in Fig. 5 gezeigt. Diese Seite ermöglicht es dem Benutzer, um die DNA-Sequenz, die spiralförmige Form des ungebundenen DNA, und die Identität und die Positionen der gebundenen Proteine ​​angeben.
  5. Der Benutzer gibt oder Pasten in der gewünschten Reihenfolge in das Textfeld in der Mitte der Seite Spezifikation (Abbildung 5, Label 1). Beachten Sie nur Standard-Rückstände - A, T, C, G und U - werden akzeptiert. Hier geben wir eine 81 Basenpaar-homopolymer, ganz aus A · T-Paare mit dem A in der Reihenfolge tragenden Strang zusammen.
  6. Es ist ein Pull-Down-Menü (Abbildung 5, Etikett 2), unter dem Textfeld, um die helikale Konformation der ungebundenen DNA-Regionen ausgewählt. In diesem Beispiel wählen wir den B-Form Konformation.
  7. Es ist ein Textfeld am unteren Rand der Seite der Spezifikation, um die Bindung Position (en) und Dateiname (n) des gebundenen Proteins (s) (Abbildung 5, Label 3) in Kraft. Die Bindung Position gibt die Position der Mitte des proteingebundenen Fragment der DNA-Sequenz. Wenn die gebundene DNA eine ungerade Anzahl von Basenpaaren, wie in der HBB-DNA-Struktur bezeichnet die Bindeposition die Position der Mitte Basenpaar des Fragments. Im Falle der HBB-gebundene DNA ist dieser mittlere Basenpaar ein T · T Fehlpaarung. In diesem Beispiel, wo wir zwei Kopien des HBB-Protein zu binden, um die DNA-Matrize, die T · T Paar an den Positionen 20 und 63 des 81 Basenpaar-DNA se platziertSequenz. Beachten Sie, dass die Sequenz des gebundenen Fragment muss nicht mit dem übereinstimmen eingegeben in Schritt 5. Wenn das Protein gebundenen Bereich eine gerade Anzahl von Basenpaaren bezeichnet die Bindeposition den Standort der mittlere Basenpaar Schritt auf der DNA. Das heißt, der mittlere Basenpaar Schritt des gebundenen Fragment Basenpaare zwischen n und n +1, wobei n die angegebene entlang des Segments angeordnet. Beachten Sie, dass Benutzer die DNA mit einem Protein, solange die Struktur des Komplexes mit DNA dekorieren ist bekannt und in Standard-PDB-Format 13.
  8. Am unteren Ende der Spezifikation Seite gibt es ein Feld, das dem Benutzer eine Vorschau des Protein-gebundener DNA (Abbildung 5, Beschriftung 4) generieren. Hier überprüfen wir, dass das Feld und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter". Diese Aktion generiert eine Rezension Seite mit den gewählten Parametern sowie alle Fehler, die aus der Überlappung der ausgewählten Bindungsstellen ergeben haben. Der Benutzer kann sichwählen Sie die Schaltfläche "Zurück", wenn Änderungen vorgenommen werden, oder die 'Übersetzen', um fortzufahren müssen.
  9. Auf der nächsten Seite zeigt ein statisches Bild der DNA-Protein-Komplex in seiner erweiterten Anordnung und ermöglicht interaktive Online-Visualisierung über Jmol und Webmol. Der Benutzer kann auch ein Koordinatensystem downloaden (. Pdb-Datei), die in Übereinstimmung mit den Spezifikationen des HVE formatiert ist. Dies wird durch die Wahl der Zahlungsart der wiederaufgebauten PDB-Datei 'Link generierte Bild gemacht. Letztere Datei kann leicht in eine molekulare Grafikprogramm zur weiteren Visualisierung gelesen werden. Siehe Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 6) für Beispiele der HBB-dekorierten DNA oben beschrieben und eine etwas längere (86 Basenpaare) Kette mit der HBB zentriert an den Positionen 20 und 67.

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Representative Results

Die 3DNA Software-Tools werden routinemäßig zur Nukleinsäure-Strukturen zu analysieren. Zum Beispiel werden die Identitäten von Basenpaaren und der Starrkörperplatte Parameter, die die Anordnung der Basen in Doppelhelix-DNA-Fragmente und RNA-Strukturen charakterisieren automatisch berechnet und für jeden neuen Eintrag gespeichert in der Nukleinsäure-Datenbank 22, eine weltweite Sammlung von Nukleinsäure strukturelle Informationen. Die Werte der starren Körper Parameter mit Protokoll Nr. 2 bestimmt leicht offenbaren Verzerrungen im dreidimensionalen Struktur, wie die beiden Seiten der extremen DNA Biegen in die große Furche, mit großen positiven Rollwinkel (64.95 ° und 60.93 °), gefunden bei AT · AT Schritte 13 und 22 im Kristall Komplex mit dem Borrelia burgdorferi Hbb Protein 8 (Abbildung 1).

Die Fähigkeit der Software, um Strukturen aus diesen Mengen Wiederaufbau mit Protokoll Nr. 3 ist es möglich, zu bestimmen, wie inindividuellen Basis und Basenpaar-Schritte tragen zur allgemeinen molekularen fache. Wie in 2 dargestellt ist, spiegelt die globale Krümmung von DNA durch HBB induziert mehr als die beiden extremen Roll Verzerrungen oben erwähnt. Das heißt, bleibt die DNA stark gekrümmten, wenn mit diesen Basenpaar Schritte rekonstruiert gerichtet, dh mit null Rollwinkel an beiden Seiten. Die gleiche Technik hat zuvor die Beiträge der spezifischen Basenpaarung Schritte und Verformungen der superhelical Steigung der DNA auf der Oberfläche der Kernteilchen 6 Nukleosomen gewickelt und der Breite der kleinen Furche der DNA, gebunden an die bakterielle offenbart nucleoid- associated protein 23 Fis.

Durch die neue Möglichkeit in 3DNA, in Protokoll Nr. 4 beschrieben, eine große Anzahl von verbundenen Strukturen prüfen macht es möglich, sowohl die Sequenz-und zeitabhängige Muster in die räumliche Anordnung der simulierten DNA-und RNA-Moleküle zu extrahieren. Zum Beispiel kann die (gelb) coloder-Codierung der Rollwinkel zwischen aufeinander folgenden Basenpaaren in zwei große Gruppen von simulierten DNA-Strukturen 11 zeigt die bevorzugte Biege dieser Moleküle an Pyrimidin-Purin-Base-Paar Schritte (Abbildung 3). Die höheren Werte der Rolle, in rot dargestellt, die für eine kurze Zeit an den Enden der DNA bestehen deuten auf ein lokales Schmelzen und Nachglühen der Doppel-Helix-Struktur. Die veränderlichen Muster der anderen Starrkörper-Parameter, wie der Winkel und Abstände zwischen komplementären Basen sind, zu entschlüsseln, die genaue strukturelle Deformationen zu helfen.

Die Fähigkeit der Software 3DNA, in Protokoll Nr. 5 vorgestellt, um verwandte Moleküle in einem gemeinsamen Bezugsrahmen orientieren, zeigt Merkmale der Gesamtstruktur in vielen der Dateien im PDB gespeichert verborgen. Zum Beispiel erzeugt die herkömmliche Angleichung verwandter Strukturen auf der Basis eines root-mean-square fit entsprechender Atome eine Reihe von ähnlichen räumlichen Bahnen tHut grob aufeinander überlagern, hier die zehn NMR-basierte Modelle der O3 DNA Betreiber den Kopfschmuck des Lac Repressor Protein 12 (Abbildung 4 links) gebunden. Die Überlagerung der gleichen Strukturen auf einem gemeinsamen Koordinatensystem auf der 5'-terminalen Basenpaar jedes Duplex zeigt beträchtliche Verzerrung des globalen Struktur, in der die Moleküle in deutlich unterschiedliche Richtungen (Fig. 4 rechts) biegen. Die strukturelle Variabilität kann Einfluss auf die Leichtigkeit, mit der die Escherichia coli Lac Repressor Protein bindet O3 und induziert eine Schleife zwischen O3 und sequenziell fernen Operatoren in der lac-Operon 24.

Die Schritte in Protokoll Nr. 6 skizziert, für den Aufbau von Modellen der langen DNA-Fragmente an beliebigen Standorten mit Proteinen und anderen Liganden dekoriert, fügt eine neue Perspektive auf die Organisation von großen makromolekularen Anordnungen. Solche Modelle helfen, wie die multi-molekulare Komplexe verstehenInteraktion bei der biologischen Verarbeitung. Wie in 6 dargestellt ist, kann die genaue Plazierung eines architektonischen Protein wie HBB einen dramatischen Einfluss auf die gesamte Faltung DNA. Wenn zwei Kopien des bekannten hochaufgelöste Struktur 8 von 43 Basenpaare getrennt sind, schließt eine 81-Basenpaar-DNA-Fragment in einem engen, fast geschlossenen Konfiguration. Wenn die beiden Proteine ​​durch weitere fünf bp getrennt sind, folgt die DNA eine offene, mäanderförmigen Weg. Die sehr unterschiedlichen Regelungen des Proteins eingerichtete Duplex zeigen, wie der Abstand der architektonischen Proteine ​​beeinflussen die Cyclisierung oder Schleifen von DNA 25, 26.

Abbildung 1
Abbildung 1. Variation des Rollwinkels zwischen aufeinander folgenden Basenpaaren (siehe Kasten zur visuellen Darstellung) entlang dem DNA-chaverpflichtet, in der HBB Protein aus Borrelia burgdorferi 8. Werte unter Verwendung der 'analysieren' Befehl von 3DNA und die strukturellen Daten in Protokoll Nr. 2 beschrieben. Beachten Sie die Extremwerte der Walze an die in den Schritten, die Halterung der mittleren Drittel der Struktur.

Abbildung 2
Abbildung 2. Ungefähre atomare Modelle der DNA unter Verwendung des 'Wiederaufbau' Funktion 3DNA und in PyMOL mit farbcodierten Atome (C-cyan, blau N-, O-rot; P-gold) gerendert. Models auf (links) den starren Körper-Schritt werden die Parameter der HBB Protein und (rechts) einen modifizierten Satz von Schritt werden die Parameter, in denen die beiden größten Werte der Rolle auf Null gesetzt wurden basierend. Siehe Protokoll Nr. 3 eine Schritt-für-Schritt-Anleitungen . Beachten Sie die Entfaltung der DNA durch die auferlegten Änderungen in Rolle induziert.


Abbildung 3. Mosaic Bilder der Rollwinkeln entlang der DNA in zwei Sätze von simulierten Strukturen 11. Werte von Rolle, extrahiert mit Protokoll Nr. 4 sind von blau zu rot über den Bereich farblich [-5 °, 20 °]. Beachten Sie die umgekehrte Reihenfolge der Basen und große Werte von Rollen, von Gelb / Rot Säulen, die an Purin-Pyrimidin-Schritte in der 14-Basenpaar-selbst-komplementären Sequenzen auftreten hervorgehoben.

Fig. 4
Abbildung 4. Cartoon Bilder der DNA-Modelle in den NMR-abgeleiteten Strukturen der DNA O3 Betreiber mit den Lac Repressorprotein Kopfbedeckungen 12 Veranschaulichung der Fähigkeiten gefundender 'x3dna_ensemble umorientieren' Befehl. Images in PyMOL (Backbones zeigen wie Gold Rohre und Basen als blaue Sticks) gerendert und ausgerichtet mit (von links) die Koordinaten in der PDB-Eintrag (2kek) und (rechts) die strukturelle Überlagerung in Protokoll Nr. 5 vorgestellt . Beachten Sie die großen Unterschiede zwischen den Strukturen, wenn sie in einem gemeinsamen Bezugssystem auf der 5'-terminalen Basenpaaren angeordnet.

Abbildung 5
Abbildung 5. Screen shot von der w3DNA Webserver zeigt Spezifikationen der DNA-Sequenz (Label 1), die spiralförmige Form des ungebundenen DNA (Label-2), die Positionen und Identitäten von Proteinen (Label 3), und die Bildvorschau Kontrollkästchen (Beschriftung 4) beschrieben in Protokoll Nr. 6. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 6
Abbildung 6. Ungefähre atomare Modelle der beiden Proteine ​​Hbb 8 gebunden an ein langes DNA-Fragment. Strukturen mit dem Web-Server als w3DNA in Protokoll Nr. 6 beschrieben und gerendert in PyMOL erstellt. Die Proteinketten sind Show als violette Bänder, während die DNA von Atom-Typ (C-cyan, blau N-, O-rot; P-gold) farbig markiert. Die zentrale Basenpaar jedes Protein-Bindungsstellen an Positionen gesetzt (links) 20 und 62 entlang der 81-Basenpaar-DNA-Kette und (rechts) 20 und 67 entlang der 86-Basenpaar-DNA-Kette. Beachten Sie die große Veränderung in der Faltung der Strukturen mit der erhöhten (fünf Basenpaare) Verschiebung der beiden Proteinen assoziiert.

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Discussion

Der Satz von Protokollen in diesem Artikel vorgestellt nur von den Fähigkeiten des 3DNA Suite von Programmen zu berühren. Die Werkzeuge angewendet werden, um Strukturen RNA nicht-kanonischen Basenpaaren zu identifizieren, um die sekundären strukturellen Kontexte, in denen eine solche Paarung tritt bestimmen, um die räumliche Anordnung der spiralförmigen Fragmente zu quantifizieren, um die Überlappung von Basen entlang der Kette Rückgrat messen etc. werden Der Umbau Befehl ermöglicht es dem Benutzer, einfach und informative Darstellungen von den Basen und Basenpaare wie in der Einfügung dargestellt auf 1 zu konstruieren. Die Gebäude-Tools auch Funktionen 'thread' unterschiedliche Sequenzen auf einem bestimmten strukturellen Vorlage, um Modelle von zahlreichen Doppel-, Dreibett-und vier DNA-Strukturen zu erzeugen, zu orientieren Modelle in eine bestimmte Richtung, etc. Schließlich hat 3DNA spielte eine wichtige Rolle in einer Reihe von anderen Projekten, wie zB: die SwS Solvatation Webservice für Nukleinsäuren 27; die ARTS Web-Server fürAusrichten RNA Tertiärstrukturen 28; die MDDNA webbasiertes Tool für die Analyse der Ergebnisse und Molekulardynamik-Vorhersage 29; die Informationen HADDOCK-driven Protein-DNA-Docking-Verfahren 30, das SARA-Server für die Funktion Annotation von RNA-Strukturen 31, die 3D- DART DNA Strukturmodellierung Server 32, der 3D-Fußabdruck Datenbank für die strukturelle Analyse von Protein-DNA-Komplexe 33; die RNA FRABASE 2.0-Datenbank zur Identifizierung von dreidimensionalen Fragmenten innerhalb RNA-Strukturen 34 und der Setter-Webserver für den paarweisen Vergleich von RNA-Strukturen 35. Nach bestem Wissen versichern wir, es gibt derzeit keine anderen Nukleinsäure-Struktur Software-Paket mit einer vergleichbar breiten Kombination von Funktionen und die robuste Performance-Historie von 3DNA.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für die gemeinsame Nutzung Jiří Sponer die Koordinaten der DNA-Doppelhelix in Molekulardynamik-Simulationen erzeugt. Wir erkennen auch Nada Spackova um Hilfe beim Herunterladen dieser Strukturen. Unterstützung dieser Arbeit durch USPHS Forschungsstipendien GM34809 und GM096889 gedankt.

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