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Medicine

準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

doi: 10.3791/4414 Published: December 7, 2012

Summary

この記事では全献血から調製し、病原体不活化のためのインターセプト血液システムで処理された二重線量軟膜の血小板濃縮物を生産するエーレブルー大学病院で使用されるプロセスを説明します。ザ

Abstract

血液センターは、最大化、生産、​​彼らが受ける血液製剤の寄付からの収量ならびに輸血感染症からの保護を含む輸血患者の安全を可能な限り高いレベルを確保することなど、多くの課題に直面しています。これは、消耗品、機器、廃棄物、とりわけ人件費などの営業費用を最小限に抑えることが財政的に責任ある方法で行われなければならない。

いくつかのメソッドは、血小板輸血のために集中を生成するために用意されています。最も一般的なものの1つは単一の治療血小板単位(単位当たり、各地域の規制あたり≥2.0×10 11血小板が)から最大6全献血へのバフィーコート層をプールすることにより調製される軟膜方法です。 "二重線量"全血由来血小板を製造するための手順は、ごく最近開発された。

ここに提示され調製するための新規な方法である二重線量全血由来血小板は7軟膜、その後病原体不活化の切片、血液系のダブル投与単位の治療のプールから集中している。インターセプトは、献血された血液中に存在しうるウイルス、細菌、寄生虫、汚染ドナー白血球を不活化するために開発されました。デュアルストレージコンテナ( "DSセット")で設定INTERCEPT処理を利用することによって、二重線量軟膜法とINTERCEPTペアリングすることにより、患者の安全性を最大限に、血液センターは、単一の病原体不活化処理セットで彼らの二重投与単位のそれぞれを扱うことができますコストを最小限に抑えながら。二重線量軟膜法は少ない軟膜を必要とし、単回投与軟膜血小板ユニットの準備や治療に比べて50%( 例えばプーリングセット、フィルターセット、血小板添加溶液、および無菌接続ウェーハ)までで消耗品の使用を削減。その他のコスト削減は無駄の少ない機器maintenanを含めるCE、低所要電力、削減人員時間、アフェレーシス技術と比較して低コストのコレクション。

Protocol

1。全血採取

  1. ローカル採血ガイドラインに従って設定し450ミリリットルトップ/ボトムコレクションのボランティアドナーからの全血を収集します。
  2. 全血を遠心分離し、分離前の冷却板上に2時間の最小値が格納される。

2。バフィーコートの調製

  1. 赤血球、バフィーコート、および血漿:3つの層に血液を分離するのは難しいスピンを用いた全血を遠心分離します。使用される遠心分離機パラメータは±2℃22℃11分間4880 RCFあっ
  2. 収集容器に軟膜を残して、トップのサテライトバッグと下部のサテライトバッグに赤血球(RBC)にプラズマを表現するために自動化された血液·セパレータを使用します。軟膜のボリュームとヘマトクリット値の範囲は、それぞれ約48ミリリットルと37%であるという意味でターゲットにしています。
  3. バフィーコートは22±2℃で血小板アジテータを一晩保存されている

  1. 列車の長さを削減するための無菌接続7軟膜との平行線を持つ列車構成でSSP +血小板添加溶液(PAS)の300ミリリットル、PASは、列車の先頭でなければなりません。 PASと第一軟膜の間のラインをクランプします。
  2. 軟膜ユニット間の無菌接続を開き、軟膜は最後のコンテナに排出することができます。
  3. 溶接とPAS最初の軟膜の間にクランプを開きます。添加液の3分の1が連続して軟膜コンテナのそれぞれを介してリンスすることができます。 2回以上残っているPASの半分を使用して、それぞれの時間を繰り返します。
  4. 平均バフィーコート·プール·ボリュームは、約600ミリリットルである必要があります。後の工程でINTERCEPT病原体不活化処理の必要に応じて、47パーセント - 個々の軟膜のターゲット·ボリュームとヘマトクリット値が満たされている場合、血漿比は32となります。
  5. 空のSSP +およびバフィを破棄コー​​トコンテナ。
  6. 最適な血小板の回復については、遠心分離前に1時間のアジテータをプールしておく。
  7. 無菌バフィーコート·プールに統合された白血球除去フィルターを用いて血小板貯蔵容器に接続してください。
  8. 懸濁液中の血小板(9分、20秒462 RCF)から赤血球を分離するバフィーコート·プールの "ソフトスピン"を行う。血小板保存容器に白血球除去フィルターを介して自動化された血液分離装置を用いて血小板懸濁液を表明。
  9. 420ミリリットルの容積、2.5から7.0×10 11血小板用量、≤4×10 6 / mlの赤血球-前述の処理要件は血小板懸濁液を300ミリリットルのインターセプト処理の仕様を満たしていることを確認してください。

4。インターセプト処理

  1. 採取後1日目の終わり(0日目は、コレクションの日です)の前にインターセプト処理を実行します。
  2. INTERCEPT処理セットをアンラップ透明なプラスチック袋からデュアルストレージコンテナを持つ。
  3. 無菌INTERCEPT処理セットでamotosalen容器のチューブに血小板懸濁液の容器を接続します。
  4. ローカル要件に従って適切な血液製剤の識別とINTERCEPT処理セット貯蔵容器にラベルを付けます。
  5. 血小板をハングアップし、照明容器に流入amotosalenソリューションを可能にする、第一amotosalen容器の底カニューレを破る。血小板は照明容器にamotosalenコンテナを通して流すことamotosalenコンテナの上部カニューレを破る。
  6. 優しく血小板とamotosalen混合物を混ぜるとam​​otosalen容器内に照射容器から空気を表現しています。
  7. チューブの約4cm充填、チューブに血小板混合物の少量を表現しています。これは、チューブや照明コンテナの両方で血小板が病原体inactivati​​を受け確実に治療について。
  8. 照明容器とamotosalenコンテナ間のチューブをシールします。照明コンテナから伸びるチューブの約4 cm以上のものを残しなさい。取り外して捨てる空の血小板とamotosalenコンテナを、サンプリング·ポーチにクランプを閉じます。
  9. 左側の大きなコンパートメント内の照明容器と右側の小さいコンパートメントにオーガナイザーとイルミに設定された処理を配置します。
  10. 寄付先ID、製品コード、および照明に処理セットのロット番号を入力するハンドヘルドバーコードデバイスを使用しています。金属製のカバーを閉じて、照明のグラフィカルインターフェイスでプロンプトが表示されたときに、引き出しを閉める。イルミネーションを開始するために "Start"を押してください。
  11. 照射後に、照明装置から処理セットを削除します。照明は自動的に処理された血小板の単位(s)の治療レポートを印刷します。
  12. 主催者からの容器を開けて、電話をハングlateletsと処理セットは、照明容器の出口にカニューレを破ると、血小板は化合物吸着装置(CAD)容器に流れるようになります。
  13. プラズマ抽出器を用いて照明容器にCAD容器から空気を表現し、CADのウエハを曲げないように注意しながら。
  14. CADの容器の入口ポートに近いチューブをシールします。空の照明容器を取り外して廃棄します。
  15. 少なくとも6時間、血小板上のアジテーターに接続されたストレージ·コンテナーを使用するCADコンテナが、以上16時間を置きます。これは≤2μMの濃度に残留amotosalenの削減になります。
  16. CADデータを処理した後、アジテータから血小板ユニットを取り外します。血小板をハングアップする。カニューレを破ると、血小板は貯蔵容器に流れるようになります。
  17. CADの容器に貯蔵容器から空気を表現しています。残留濃厚血小板フローバック貯蔵容器内でみよう重力。 Y字フィッティング上記チューブを密封し、空のCADデータコンテナを削除します。
  18. 必要に応じて貯蔵容器の間に再配布するボリューム。ボリューム調整は貯蔵容器を計量することによって作られています。数センチ貯蔵容器の入口上記の各貯蔵容器にチューブを密封、これは5.2で説明したように最終製品から無菌のサンプルを得ることが容易になります。

5。製品のサンプリング

  1. ルーチンQCテストでは、最終貯蔵容器は、貯蔵容器に採取袋を使用して一度にサンプリングすることができます。これを行うには、血小板ユニットがうまくミックスされていることを確認してから、袋にクランプを開いて、数回絞る。ポーチは、血小板で満たされた後、チューブをシールします。適切な実験チューブに血小板試料を移し、すぐにアッセイを行う。
  2. このような検証研究用として、記憶の過程で複数の時点でサンプルを得るために、無菌接続血小板貯蔵容器のチューブに新しいサンプリング容器。血小板が十分にサンプリングコンテナに転送する前に混合していることを確認します。

6 in vitroでの機能評価

  1. この検証研究では、in vitroでの評価は、CAD治療(1日目または2日目に、CAD期間によって異なります)の後に実行し、再び4日目(または5日目)と7日目にしました。vitroでの測定容積、血小板数、pHを、含まれている血液ガス(PO 2、PCO 2)、グルコース、乳酸、と渦巻く。
  2. ボリュームは添加剤溶液中の血小板の比重として1.01グラム/ mlを使用して重量を測定した。
  3. ヘモグロビン汚染は視覚的にカラーチャートとの比較を用い​​て評価した。
  4. 旋回は、視覚的に決定した。
  5. 他のアッセイの方法論については、 "機器のテーブル"を参照してください。

7。代表的な結果

Dの製造プロセスouble用量軟膜の血小板は、ボリュームおよびヘマトクリットの目標仕様を満たす個々の軟膜の生産から始まります。それが最終的なプロセスの検証中に、個々の軟膜のヘマトクリット値を測定することは現実的ではないので、我々は一貫してターゲット·ボリュームとヘマトクリット値を満たすことができることを確認するために私達の軟膜を最適化するために独立した努力を行うことによって始まった。 表1に示すように、我々の最適化されたバフィーコートは46でボリュームおよびヘマトクリット両方±2 mlおよび37±3%、それぞれの目標値に好意的に比較した。

プーリング後、バフィーコート·プールのボリュームおよびヘマトクリットは、それぞれのソフトスピン遠心分離前に約600ミリリットルと20%であるべきである。 表2に示すように、私たちの軟膜プールは615を平均±5ミリリットルを、ヘマトクリット値は19を平均±1%。

二重線量血小板の濃ソフトスピン遠心結果INTERCEPT血液系のDS処理セットを利用病原体不活化のための入力要件を満たすことentrate。インターセプト処理用キーの入力パラメータは、ボリューム、血小板数、血漿比、およびRBCコンテンツが含まれています。加えて、我々は軟膜プールに比べて濃厚血小板の血小板の≥75%を回収することを目指しています。地域の要件ごとに、白血球(WBC)の汚染は、<1×10 6 /ユニットでなければなりません。血小板は、私たちの検証に集中し、表3に示すように、インターセプト処理だけでなく、WBC汚染および血小板回復のための目標の重要なパラメータに会った。

病原体不活化のためのプロセスは、単一INTERCEPTインターセプト処理セットを使用して二重線量濃縮血小板上で実行されます。処理セットは、処理ユニットはパスが完了した時点で2個々の治療血小板用量に分割することを可能にする2つの積分の貯蔵容器が含まれていますプラスミン不活化プロセス。ヨーロッパのガイドラインでは、テストユニットの75%が治療dose1当たり≥200x10 9血小板が含まれていることを必要とします。スウェーデンのローカルな要件は、試験したユニットの75%は投与量当たり> 240x10 9血小板が含まれている必要があります。インターセプト処理後、平均血小板含有量は265であった±22×10 9(N = 24)。さらに、ユニットの88%が治療用量当たり240x10 9血小板を達するか、それを超えるが、これは欧州のガイドラインとスウェーデンの規制の両方の範囲内である。それぞれ二重線量バフィーコートの調製およびインターセプト処理プロセスの図については図1および2を参照してください。

この検証のために、私たちは、血小板のin vitroでの特性を測定したインターセプト処理(個々の貯蔵容器に分割した後IE)の後に集中して、パラメータは、記憶の7日間にわたって測定した。平均値と標準偏差がのために収集した血小板投与量は、pH、PO 2、PCO 2、乳酸生産とグルコース消費。

図3は、ストレージの7日間のインターセプト処理後の分割の各製品でインターセプト処理と平均血小板投与前に二重線量濃厚血小板の血小板開始用量の平均を示しています。貯蔵中の血小板の損失は約9%であった。この減少は、従来の血小板の貯蔵中の血小板の期待損失と変わりません。2

表4は、単一ユニットに分割し、分割後の治療INTERCEPT血小板のin vitroでの特徴をまとめたものです。

欧州の要件ごとに、血小板のpHは貯蔵寿命の終わりを通って6.4以上を保つ必要があります。処理中に、血小板のpHはわずかに血小板濃度、体積、および血小板STOのガス透過性に基づいてドロップ集中怒りコンテナ図4は、ストレージの7日間の分割血小板製剤のpHを示しています。貯蔵中に、pHが安定しており、うまく処理要件の範囲内で維持した。

として図5Aおよび図5Bに示すように、血小板O 2消費量とCO 2産生は、ストレージの7日間にPL2410容器の切片血小板による継続的な呼吸を示す。 図6Aおよび図6Bは、ストレージの7日間乳酸とグルコースレベルを示す。血小板のグルコース消費と乳酸生産は、ストレージの7日間に互いに整合している。 5単位は1.11 mmol / lの(グルコースアッセイの下限値)未満の血糖値を持っていた。

具体的には、ボリューム、血小板数、血漿比、赤BL、バフィーコートの調製およびプーリング検証生産血小板がインターセプト処理のための入力基準を満たしている集中OOD細胞汚染。最後のユニットは血小板用量およびpHなどのストレージの7日間にわたって検証基準を満たした。

パラメーター 対象範囲 結果は平均値±SDを
体積(ml) 〜48 46±2
ヘマトクリット値(%) 〜37 37±3
プール前のホールド時間アジテーター上で一晩アジテーター上で一晩

表1個々の軟膜(N = 19)の特性。

パラメーター 対象範囲 結果は平均値±SDを
体積(ml) 〜600 615±5
ヘマトocrit(%) 〜20 19±1
遠心前のホールド時間アジテーターで1時間アジテーターで1時間

表2。バフィーコート·プールの特性(n = 12)で。

パラメーター ターゲット 結果は平均値±SDを
体積(ml) 370から420 404±8
血小板数(×10 9 /ユニット) 250から700 577±62
血小板回収率(%)を意味する ≥75 75±4
血漿比(%) 32から47 38±1
RBC(×10 6個 / ml) ≤4 1.2±0.4
WBC(×10 6 ≤1 0.11±0.1
INTERCEPT(HR)までの時間を保持する 1日目の終わり≤ 1日目の終わり≤

表3。ダブル線量血小板の特性(n = 12)に集中している。

平均値±SD ミン マックス
体積(ml) 199±16 182 236
血小板数(×10 9 /ユニット) 265±22 225 292
pH値(22℃) 6.9±0.1 6.8 7.0
PO 2(kPa) 21.4±4.8 12.8 27.3
PCO 2(kPa) 4.3&PLusmn; 0.4 3.3 4.9
乳酸(ミリモル/リットル) 9.1±1.7 6.8 12.4
グルコース(mmol / L)を 5.3±0.9 3.7 6.5

INTERCEPT処理された血小板の日1月2日(シングルユニットは、n = 24)の表4。特性。

図1
図1 7軟膜のプールから二重線量血小板濃縮物の生産。

図2
図2インターセプト血液システムを持つ二重線量血小板濃縮物の病原体不活化。

図3
図3:前と線量のための血小板の平均インターセプト処理7日後(切片前にN = 12; INTERCEPTの後にn = 24)。

図4
図4:インターセプト治療(N = 24)の後に血小板pHは平均±SD。

図5A
図5Aは。インターセプト治療(N = 24)の後pO 2は平均±SD。

図5B
図5Bは。インターセプト治療(N = 24)の後pO 2は平均±SD。

図6A
図6Aは、インターセプト治療(N = 24)の後に乳酸濃度平均値±SD。

図6B
図6Bは、。&血糖値を平均plusmn、SDインターセプト治療後に(n = 24)。

Discussion

軟膜の血小板は、人事時間、消耗品、機器、および血小板のユニットを生産するコスト全体に組み込む必要があり、廃棄物、を含むポスト回収費用、その結果、いくつかの処理工程を必要とします。各バフィーコート(バフィーコート量とヘマトクリット値の最適化を介して)から血小板収量を向上させることが7軟膜のプールから二重線量軟膜血小板ユニットを製造することができる。この最適化が実行されると、血小板用量の固定番号を生成するために必要な軟膜の数は、それによって、軟膜の全体的な利用率を改善し、(PC)を集中して、追加の血小板の生産を可能にする、減少させることができる。人事時間だけでなく、セット、血小板添加溶液、無菌接続ウェーハ、フィルターセット、遠心分離の手続きをプールするなどの消耗品や機器のコストを50%まで削減されます。血小板産生を最適化し、コストを削減することに加えて、THIのプーリング法は、私たちだけでなく、私たちの輸血の受信者向けに強化された保護を提供できるように、INTERCEPT、デュアルストレージコンテナの処理セットを使用するための入力要件を満たして濃厚血小板(PC)を生成することができます。

INTERCEPT血液系病原体の不活性化は、病気を引き起こすことができません核酸複製およびレンダリングする病原体を防ぐこと、共有結合架橋DNAとRNAにamotosalenおよび紫外線(UVA)光を使用するため。3それが効果的にウイルス、細菌を含めた病原体の広いスペクトルを不活性化する、寄生虫、およびドナー白血球を混入4-6 INTERCEPT新しいテストを開発し、最終的に試験実施するための重要な財政投資を必要としている間に歴史的にかなりの遅れを伴う新興病原体のために、現在のテストのパラダイムに代わるものを提供しています利用できるようになります。7,8は、それまた、冗長安全measuに代わるものを提供することができますこのような細菌検出9およびガンマ線照射などでRES。さらに10月12日 、切片は、私たちの生産効率に利益をもたらし、私たちは私たちの予算に固執するのに役立ちダブル線量血小板ユニットを扱うことができます。

INTERCEPT、および二重線量軟膜法は血液センターのワークフローの様々に適応することができます。例としては、全血のコレクションは500ミリリットルに増やすことができ、コレクションも22℃で一晩保存することができる°C分離に先立って。また、代替軟膜プーリング法が可能である( 例えば、タコのメソッドの代わりに鉄道法)および/ ​​または自動装置( 例えば TACSI)残りの赤血球から第2の遠心分離及び血小板懸濁液の分離のために利用することができる。

増加血小板コンテンツが必要な場合には、いくつかの技術は、血小板数、全血で一晩インキュベーションし、adjusに基づいてドナーの事前選択を含むご利用いただけます遠心分離の設定のtment、または7の代わりに8軟膜のプールを利用する。

プーリングの制限により、現在利用可能な、遠心バケットの容量を設定し、軟膜プールの合計容量は約600ミリリットルである必要があります。このプロトコールに記載の遠心分離プロセスと設定は7軟膜のプールの切片パラメータを満たす製品を得るために最適化されています。プール内の軟膜の数が変更された場合に遠心分離の設定を変更する必要があります。

一部の国では、最小の血小板用量が高くなるとQC要件はスウェーデンよりもさらに厳しくなっています。このように、我々の結果は、普遍的に適用できない場合があります。これらの国では、治療をインターセプトする前に二重線量PCがインターセプト処理と分割後のローカルな要件を満たすために、血小板の数が多く入っていなければなりません。なぜなら最大血小板コンテンツや治療ボリュームFOR切片はそれぞれ7×10 11血小板と420ミリリットルであり、INTERCEPT処理の要件を超えているか、または2つの治療用量に分割するには不十分な血小板含有量を持っているユニットの割合は、例えば血小板投与量、品質管理基準の地域の要件などの要因によって異なります軟膜最適化の結果、生産の安定性。

二重線量PCはINTERCEPT処理要件を超える場合は、手動で要件を​​満たすように調整され、その後に扱われるかもしれません。 7-軟膜プールはINTERCEPT後の二重線量製品の不十分な血小板をもたらすそれらのいくつかの場面では、インターセプト処理を実行しないことを選択した。あるいは、他の血液センターでは、単回投与インターセプト処理セット(大ボリュームセットをIE)を搭載したPCを扱うことにより、すべてのユニットで病原体不活化を行う、単一の大きな治療用量としてPCを格納するために選択することができます。私達が私達を満たしていることを確認するために、QCの要件とする病原体、できるだけ私たちの血小板ユニットの多くのように、私たちは、プールされた場合は、プール内5.6x10 11血小板の最小血小板コンテンツになり、ドナー血小板数に基づいて、軟膜を選択して不活性化する。これは、インターセプト処理後の2つの治療用量を生成するために十分な血小板含有量を保証します。

私たちの検証では、7全血由来軟膜ユニットが正常に製造(スウェーデン要件と欧州のガイドライン)について、患者のサポートのための受け入れ基準を満たす2病原体不活化血小板製剤で、その結果、血小板の切片プロセスをプールし、治療することができることを示して診療ガイドラインとスウェーデンの標準血小板注入法に従って血小板輸血を必要とする。

Disclosures

この記事への生産とフリーアクセスはシーラスが主催しています。

Acknowledgments

公開のための資金は、シーラス社、INTERCEPT、血液系の製造業者によって提供されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whole blood donation, primary separation, and platelet production
Blood collection pack Fenwal R6485 Top/Bottom set
Automated component extractor Fenwal Optipress-II
Blood mixer and balance system Baxter Easymix V3
Platelet leukocyte filtration set Fenwal K4R7042
Centrifuge Hettich Roto Silenta 63 RS Version 5.5
Platelet additive solution - SSP+ MacoPharma SSP2030U 300 ml
Sterile tubing welder Terumo T-SCD
INTERCEPT treatment & storage
INTERCEPT processing set Cerus INT2503 Dual Storage (DS) set
INTERCEPT Illuminator Cerus INT100
PC sample pack Fenwal FTX 1122
Incubator Helmer PC2200/PC3200
Agitator Helmer PF48H/PF96H
Evaluation of in vitro Platelet Function
Blood gas analyzer Radiometer ABL 735 Used for pH, blood gases, and lactate measurement
Chemistry system Ortho Clinical Diagnostic Vitros 5.1 Used for glucose measurement
Hematology analyzer Boule Medical AB Medonic CA620-Cellguard Used for platelet count measurement
Flow cytometer BD FACSCanto Used for white blood cell measurement

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References

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準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化
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Cite this Article

Abedi, M. R., Doverud, A. C. Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System. J. Vis. Exp. (70), e4414, doi:10.3791/4414 (2012).More

Abedi, M. R., Doverud, A. C. Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System. J. Vis. Exp. (70), e4414, doi:10.3791/4414 (2012).

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